DNA重組實驗步驟

1、DNA 重組實驗步驟要求： 1 每個同學需要的 3 張照片參見黃色字體。2 寫實驗報告的時候請將相應的試劑盒的實驗步驟寫入， 本文僅作參考， 不能照抄。 試 劑盒的說明書在實驗室桌子上都有。第一組：目的基因： GAPDH 甘油醛 -3-磷酸脫氫酶 ：片段大?。?496bp第二組：目的基因： Actin 肌動蛋白 ，片段大小 ：約 200bp1.總 RNA 的抽提 （參照植物組織 RNA 提取試劑盒， 本部分直接以提供材料開始， 可以 不寫）所取材料經(jīng) DEPC 水（蠶體或組織）清洗后，添加液氮充分研磨；然后轉入 1.5 mLEppe ndof 管，加入 1 mL TRIzol ,振蕩 2 mi

2、n ,室溫靜置 5 min ; 4 C, 12 000 r/mi n 離心 5 min , 上清轉入新的 Eppendorf 管中；以每毫升 TRIzol 0.2 mL 氯仿的比例加入氯仿，振蕩 15 s 左 右，室溫放置5 min , 12 000 g, 4 C離心15 min ;取上清液，加 0.6 mL異戊醇，顛倒混勻， 靜置10 min ； 4 C，12 000 g離心10 min，棄上清；加入 1 mL用DEPC水配置的75%乙醇 洗RNA沉淀，室溫晾干；將沉淀溶于50丄DEPC水中，-70 C保存?zhèn)溆谩?RNA 反轉錄 （參照 RT-PCR 試劑盒 ）在 Eppendof 管中加入

3、組織總 RNA 1 譏，Oligo （dT）化 1 卩,40 U/ 卩 L RNase Inhibitor 0.5 譏，5 x reactionbuffer 4 卩 L, 2.5 mmol/L dNTP 2 卩 L,200 U/ 卩 LRTase M-MLV 1 卩 L,然后加 DEPC水至20 y；42C水浴1 h,然后70C滅活10 min,此即為第一鏈 cDNA產(chǎn)物。3 .PCR 擴增反應程序及加樣體系（參照 RT-PCR 試劑盒 ）PCR擴增反應程序（上海生工試劑）：94C預變性3 min , 94C 50 s , 55C（根據(jù)引物適當改變） 50 s, 72C 50 s, 30個循環(huán)

4、。終延伸 72C 10 min。ddH2O16.310 XPCR Buffer,2+、(without Mg )2.525 mmol/L MgCl 22.01L2.5 mmol/L dNTPmix1.01LPrimer-s1.01 L(約20 pmol/L )Primer-a1.01 L(約20 pmol/L )cDNA1.01 L(約2.0 ng)Taq DNA聚合酶0.21 L(約1.0 U)總體積25.01L1.2% Agarose凝膠電泳，記錄拍照結果。4 PCR產(chǎn)物的回收與連接DNA回收參照天根 Agarose Gel DNA Purification Kit使用說明書。連接：在微型

5、離心管中依次加入純化PCR產(chǎn)物8 U (目的基因)，pUC19 2讓，buffer 4ul,dNPT 1ul, T4連接酶1ul,水4ul,共20ul體系。11度20分鐘后70度5分鐘即可。5感受態(tài)細胞制備挑取大腸桿菌DH5A劃線培養(yǎng)得到的單菌落；挑單菌落接種于3 mL LB液體培養(yǎng)基過夜培養(yǎng)，然后取30丄菌液接種于3 mL LB液體培養(yǎng)基，37 C 200 r/min震蕩培養(yǎng)至OD550 達0.5左右(液體變渾濁即可);將培養(yǎng)液轉入1.5 mL離心管，冰浴10 min ; 4 C, 3500 r/min 離心5 min，棄上清；用預冷的 75 mmol/L CaCl 2 750 L輕輕懸浮細

6、胞，冰浴 30 min ; 4 C, 3500 r/min離心10 min，棄上清；加入 200 L預冷的75 mmol/L CaCl 2輕輕懸浮細胞，冰浴 4 h以上，即成感受態(tài)細胞。6 .連接產(chǎn)物的轉化取200 U感受態(tài)細胞懸液，加入連接產(chǎn)物10 uL，輕輕混勻，冰浴 30 min ; 42C水浴1min ,立即置于冰浴中2-3 min ,然后向離心管中加入 1 mL 37 C預熱LB培養(yǎng)基，于37C 200 r/min振蕩培養(yǎng)1 h,使細胞恢復正常生長狀態(tài)；4C, 3500 r/min離心5min ,棄900 L上清，加入5 L X-gal(20 mg/mL)和5丄IPTG (100 mg/mL ),輕輕懸浮細胞，將菌液均勻涂布在 含Amp+抗生素的LB固體培養(yǎng)基上；正面放置 1 h使吸收完全，然后 37C倒置培養(yǎng)過夜。7.重組質(zhì)粒的篩選觀察藍白斑結果（拍照記錄，培養(yǎng)皿上有自己的名字，沒有的本次實驗重做），挑取單個獨立的白色菌落（可將培養(yǎng)基平板放置 4C冰箱顯色），分別接種于3 mL含有相應抗生 素的LB液體培養(yǎng)基上，37 200 r/min震蕩培養(yǎng)過夜。8質(zhì)粒DNA抽提（參照試劑盒）質(zhì)粒DNA小量制備試劑盒。9酶切反應在1.5mL的Eppe ndof管中依次加入dd