生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)-凝膠過濾層析

1、實(shí)驗(yàn)十 凝膠過濾柱層析純化 堿性磷酸酶 一、目的要求 1.學(xué)習(xí)和掌握凝膠過濾層析分離蛋白質(zhì)的原理與 方法。 2.通過凝膠過濾柱層析對(duì)堿性磷酸酶進(jìn)行純化 二、原理 凝膠過濾層析也稱分子篩層析、排阻層析。是利用 具有網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的凝膠的分子篩作用，根據(jù)被分離物 質(zhì)的分子大小不同來進(jìn)行分離。 內(nèi)水體積Vi 外水體積Vo 柱床體積Vt 洗脫體積Ve Vt=Vo+Vi+Vg Ve=Vo+KdVi Kd=(Ve-Vo)/Vi Kd=0 Kd=1 0Kd1 優(yōu)點(diǎn)： a. 條件溫和 b.操作簡便 c. 損失少回收率高 d. 層析 柱可反復(fù)使用 凝膠的類型： Sephadex: 交聯(lián)葡聚糖 Sepharose：瓊脂

2、糖凝膠 Bio-Gel A Bio-Gel P：聚丙烯酰胺凝膠分子篩 Sephacryl：用N，N-亞甲雙丙烯酰胺交聯(lián)的葡聚糖 凝膠 G-10G-15G-25G-50G-75G-100G-150G-200 吸水量 （g/g干凝 膠） 1.01.52.55.07.510.015.020.0 工作范圍 （肽與蛋 白）D 700150050001500- 20000 3000- 70000 4000- 150000 5000- 300000 5000- 500000 凝膠及柱的選擇 凝膠的處理及裝柱 凝膠干粉的溶脹（熱溶 脹）、浮選、抽氣、裝 柱、藍(lán)色葡聚糖檢查、 平衡 裝柱時(shí)要注意操作壓。 裝柱的

3、兩種方法： a.手工操作 1/3床體積水加入少許凝膠積起1-2 厘米凝膠床打開出水口連續(xù)緩慢 加入凝膠 b.電動(dòng)攪拌下的裝柱法 （如圖4-9） 樣品上柱 分析用量：柱床體積的12% 制備用量：柱床體積的1020% 洗脫收集 部分收集器、核酸蛋白檢測(cè)儀 凝膠的保存方法 0.02%疊氮鈉或0.002%洗必泰 應(yīng)用 a. 分離蛋白質(zhì) b. 脫鹽 c. 蛋白質(zhì)分子量的測(cè)定 三、儀器的使用核酸蛋白檢測(cè)儀及 部分收集器的操作方法 核酸蛋白檢測(cè)儀及記錄儀操作方法 1、在儀器使用前，首先檢查檢測(cè)器，電源和記錄儀 三部份電路連接是否正確，插上電源插頭。 2、接通記錄儀電源開關(guān)，使電源開關(guān)拔到“通”指 示燈亮?？?/p>

4、根據(jù)需要調(diào)換不同的走紙速度。記錄儀 量程調(diào)在10mV檔上。 3、將檢測(cè)儀波長旋鈕旋到所需波長刻度上，把量程 旋鈕拔到100T檔。 4、按下檢測(cè)儀電源箱面板上的電源開關(guān)，此時(shí)記錄 儀指針從零點(diǎn)開始向右移動(dòng)某一刻度，調(diào)節(jié)“光量” 旋鈕使指針停留在記錄儀大約中間位置5mV左右數(shù) 字顯示為50左右。儀器開機(jī)穩(wěn)定時(shí)間大約在1小時(shí) 左右，待基線平直后，可加樣測(cè)試。 5、把檢測(cè)器進(jìn)樣口塑料管接到部份收集器上，使層析 柱中的洗脫液通過。透光率為“0”廠家巳調(diào)好，光 密度A要調(diào)零，量程開關(guān)拔到100T，調(diào)節(jié)光量旋 鈕，使記錄儀指針在10mV數(shù)字顯示為100，即透光 率為100%。把量程開關(guān)拔到“A”擋，緩慢調(diào)節(jié)

5、A調(diào) 零旋鈕，使檢測(cè)儀數(shù)字顯示為“0” ， 同時(shí)調(diào)節(jié)記錄 儀零位旋紐使記錄儀指示在0位 。 6、上述5個(gè)步驟結(jié)束后，就可以在層析柱上加樣。當(dāng) 樣品經(jīng)層析柱分離，通過檢測(cè)后，就能通過記錄儀 給出所需樣品吸收的圖譜。 7、測(cè)試完畢，必須切斷電源，并用蒸餾水清洗樣品池 和尼龍管。 記錄儀光吸收A讀數(shù) 當(dāng)采用l0mV量程記錄儀時(shí)，記錄儀的滿量程讀數(shù)對(duì)應(yīng) 于A量程開關(guān)所對(duì)應(yīng)的A讀數(shù)范圍。如A量程開關(guān)選定 在0-0.5A時(shí)，則記錄儀滿量程光吸收A讀數(shù)為0.5，當(dāng) 記錄筆指示在記錄紙一半 (50%刻度)位置時(shí)即為 0.25A。 數(shù)字顯示光吸收A讀數(shù)(可變量程讀數(shù)模式) 當(dāng)A量程開關(guān)選定在0-1.0A檔時(shí)，此

6、時(shí)數(shù)顯板上顯示 和讀數(shù)即為光吸收A的實(shí)際讀數(shù)，如顯示為080即表示 為0.80A。 當(dāng)A量程開關(guān)切換在其它量程位置時(shí)，則數(shù)顯光吸收 A讀數(shù)為: A量程選定在0-2.0檔時(shí)，數(shù)顯讀數(shù)2=實(shí)際光吸收讀數(shù) A A量程選定在0-1.0檔肘，數(shù)顯讀數(shù)1=實(shí)際光吸收讀數(shù) A 部分收集器的操作方法 1將“手/自”框內(nèi)的鍵置于自動(dòng)狀態(tài)，按“定”和 “?！?使定時(shí)時(shí)間為零，放開“?！卑础翱臁被?“慢”(“定”仍按著)至所需的定時(shí)時(shí)間，放開慢 和“定”，再按一下停設(shè)定定時(shí)時(shí)間工作就完畢。 若要查看設(shè)置時(shí)間，則只需按一下“定”鍵，就能 顯示上一次所設(shè)時(shí)間，若要以秒顯示走時(shí)時(shí)刻，則 需按下“秒”鍵。 2定位， 將“順

7、/逆”鍵置于“順”或“逆”狀態(tài)，按“手 動(dòng)”鍵，使試管架轉(zhuǎn)至終點(diǎn)，這時(shí)報(bào)警器工作，報(bào) 警指示燈亮，然后將“順/逆”鍵置于“逆”或 “順”狀態(tài)，本儀器就會(huì)自動(dòng)地對(duì)準(zhǔn)第一個(gè)試管 (在 “順”狀態(tài)，第一臂試臂為最外的那根。在 “逆”狀態(tài)，第一臂試管為最內(nèi)的那根)。如滴管 口沒對(duì)準(zhǔn)第一根試管只要松開換節(jié)臂調(diào)整螺釘，使 滴臂口對(duì)準(zhǔn)第一根試管即可。 移液器（俗稱移液器（俗稱“槍槍”）的使用：）的使用： 四、操作方法 （一）凝膠的選擇與處理 1.凝膠及柱的選擇 選擇Sephadex G100和1.5cm60cm的柱子。 2.凝膠的處理 凝膠型號(hào)選定后，將干膠顆粒懸浮于5-10倍量的蒸餾水 或洗脫液中充分溶脹

8、，溶脹之后將極細(xì)的小顆粒傾瀉 出去。自然溶脹費(fèi)時(shí)較長，加熱可使溶脹加速，即在 沸水浴中將濕凝膠漿逐漸升溫至近沸，1-2小時(shí)即可達(dá) 到凝膠的充分脹溶。加熱法既可節(jié)省時(shí)間又可消毒。 （二）裝柱 1.裝柱前，必須用真空干燥器抽盡凝膠中空氣，并將 凝膠上面過多的溶液傾出。 2.先關(guān)閉層析柱出水口，向柱管內(nèi)加入約5cm高度柱 容積的洗脫液，然后邊攪拌，邊將薄漿狀的凝膠液連 續(xù)傾入柱中，使其自然沉降，等凝膠沉降約2-3cm后， 打開柱的出口，調(diào)節(jié)合適的流速，使凝膠繼續(xù)沉集， 待沉集的膠面上升到離柱的頂端約5cm處時(shí)停止裝柱， 關(guān)閉出水口。 （三）凝膠柱的平衡 通過2-3倍柱床容積的洗脫液使柱床穩(wěn)定，然后在

9、凝膠 表面上放一片濾紙或尼龍濾布，以防將來在加樣時(shí)凝 膠被沖起，并始終保護(hù)凝膠上端有一段液體。 （四）加樣 1.準(zhǔn)備好部分收集器、核酸蛋白檢測(cè)儀及記錄儀。柱出水 口與核酸蛋白質(zhì)檢測(cè)儀比色池進(jìn)液口相連，比色池出液 口再與自動(dòng)部分收集器相連。核酸蛋白檢測(cè)儀的量程置 于2A，記錄儀量程置于10mV，走紙速度設(shè)定 0.5mm/min。 2.打開柱上端的螺絲帽塞子，吸出層析柱中多余液體直至 與膠面相切。沿管壁將堿性磷酸酶樣品溶液2mL小心加 到凝膠床面上，應(yīng)避免將柱床面凝膠沖起，打開下口夾 子，使樣品溶液流入柱內(nèi)，同時(shí)收集流出液，當(dāng)樣品溶 液流至與膠面相切時(shí)，夾緊下口夾子。按加樣操作，用 1mL洗脫液沖

10、洗管壁2次。最后凝膠上方加滿洗脫液， 旋緊上口螺絲帽，柱進(jìn)水口連通洗脫瓶。上樣和洗脫的 流速為0.3mL/min左右。 （五）洗脫 洗脫時(shí)，打開上、下進(jìn)出口夾子，用0.01mol/LTris-HCl洗 脫，用自動(dòng)部分收集器收集流出液，每管2mL 。 (六）堿性磷酸酶活力峰收集 對(duì)部分收集器收集的洗脫液進(jìn)行堿性磷酸酶活力測(cè)定， 收集堿性磷酸酶活力峰，即為經(jīng)凝膠過濾柱層析純 化的洗脫液。對(duì)合并后的堿性磷酸酶活力峰進(jìn)行酶 活和蛋白濃度的測(cè)定，即可得到其比活力。 五、注意事項(xiàng) 1）各接頭不能漏氣，連接用的小乳膠管不要有破損， 否則造成漏氣、漏液。 2）裝柱要均勻，既不過松，也不過緊，最好在要求的 操作壓下裝柱，流速不宜過快，避免因此凝膠。 3）始終保持柱內(nèi)液面高于凝膠表面，否則水