端粒端粒酶PPT課件

1、 端粒與端粒酶端粒與端粒酶 Telomere and Telomerase 端端 粒粒 端粒端粒 是位于真核細(xì)胞線性染色體末端的是位于真核細(xì)胞線性染色體末端的 特殊結(jié)構(gòu)特殊結(jié)構(gòu), ,由一段重復(fù)串聯(lián)的由一段重復(fù)串聯(lián)的DNADNA序列與端序列與端 粒結(jié)合蛋白構(gòu)成；粒結(jié)合蛋白構(gòu)成； 端粒端粒具有穩(wěn)定染色體具有穩(wěn)定染色體, ,防止末端降解和融合防止末端降解和融合 的功能；的功能； 端粒的平均長(zhǎng)度隨細(xì)胞分裂次數(shù)的增多及端粒的平均長(zhǎng)度隨細(xì)胞分裂次數(shù)的增多及 年齡的增長(zhǎng)而變短年齡的增長(zhǎng)而變短, ,端粒端粒DNADNA逐漸變短而消逐漸變短而消 失失, ,可導(dǎo)可導(dǎo) 致染色體穩(wěn)定性下降并導(dǎo)致衰老致染色體穩(wěn)定性下降

2、并導(dǎo)致衰老。 端粒與端粒酶是當(dāng)今生物學(xué)研究的熱點(diǎn)。端粒與端粒酶是當(dāng)今生物學(xué)研究的熱點(diǎn)。 端粒是位于真核細(xì)胞染色體末端的核酸蛋白端粒是位于真核細(xì)胞染色體末端的核酸蛋白 復(fù)合體復(fù)合體,其功能在于維持染色體的穩(wěn)定性和完整性。其功能在于維持染色體的穩(wěn)定性和完整性。 端粒酶是一種核酸核蛋白酶端粒酶是一種核酸核蛋白酶,能以自身的能以自身的RNA 為模板合成端粒的重復(fù)序列為模板合成端粒的重復(fù)序列,以維持端粒長(zhǎng)度的穩(wěn)以維持端粒長(zhǎng)度的穩(wěn) 定性。定性。 許多研究表明許多研究表明,端粒、端粒酶的功能失調(diào)將影端粒、端粒酶的功能失調(diào)將影 響細(xì)胞的生物學(xué)行為，包括細(xì)胞周期的穩(wěn)定性、細(xì)響細(xì)胞的生物學(xué)行為，包括細(xì)胞周期的穩(wěn)定

3、性、細(xì) 胞增殖、癌變、凋亡、衰老。胞增殖、癌變、凋亡、衰老。 端粒的發(fā)現(xiàn)端粒的發(fā)現(xiàn) 1938 Muller X-ray Drosophila 末端極少發(fā)生缺失和倒位末端極少發(fā)生缺失和倒位 推測(cè)染色體兩端存在特殊結(jié)推測(cè)染色體兩端存在特殊結(jié) 構(gòu)，使染色體趨于穩(wěn)定構(gòu)，使染色體趨于穩(wěn)定. 并定名為并定名為T(mén)elomere 1938 B.McClintock 頂端缺失染色體易于融合，而正常染色體不易連接。頂端缺失染色體易于融合，而正常染色體不易連接。 推測(cè)染色體末端具有特殊端粒結(jié)構(gòu)。推測(cè)染色體末端具有特殊端粒結(jié)構(gòu)。 七十年代七十年代 端粒分子組成確定端粒分子組成確定 八十年代八十年代 端粒酶的發(fā)現(xiàn)端粒酶

4、的發(fā)現(xiàn) 九十年代九十年代 端粒酶與細(xì)胞衰老、癌癥的關(guān)系端粒酶與細(xì)胞衰老、癌癥的關(guān)系 二零零九年二零零九年 諾貝爾獎(jiǎng)諾貝爾獎(jiǎng) 伊麗莎白伊麗莎白布蘭克波恩、卡羅爾布蘭克波恩、卡羅爾格雷德、格雷德、 杰克杰克紹斯塔紹斯塔 端粒的結(jié)構(gòu)與功能端粒的結(jié)構(gòu)與功能 Chromosome DNA Gene 1 Gene 2 Telomeres Telomeres TTAGGG 1. 1.端粒的組成端粒的組成 端粒端粒DNADNA與端粒結(jié)合蛋白與端粒結(jié)合蛋白 端粒端粒DNADNA 重復(fù)重復(fù): : 端粒端粒DNADNA由高度重復(fù)短核苷酸序列組成。由高度重復(fù)短核苷酸序列組成。 人：人：-TTAGGG-TTAGGG-重

5、復(fù)序列重復(fù)序列 保守：保守： 為不含功能基因的簡(jiǎn)單、高度重復(fù)序列為不含功能基因的簡(jiǎn)單、高度重復(fù)序列, 在生物進(jìn)化過(guò)程中具有高度保守性。在生物進(jìn)化過(guò)程中具有高度保守性。 不同物種的端粒不同物種的端粒DNA 序列存在差異序列存在差異。 人類及其它脊椎動(dòng)物染色體端粒的結(jié)構(gòu)是 5TTAGGG3的重復(fù)序列。體細(xì)胞的端粒有限長(zhǎng)度 （telomere restriction fragments TRFS）大多數(shù)明顯短于 生殖細(xì)胞，青年人的TRFs又顯著長(zhǎng)于年長(zhǎng)者，提示TRFs 隨著細(xì)胞分裂或衰老，在不斷變短，主要是由于DNA聚合 酶不能完成復(fù)制成線性DNA末端所致。 端粒端粒DNA由兩條互相配對(duì)的由兩條互相

6、配對(duì)的DNA 單鏈組成單鏈組成, 其其 雙鏈部分通過(guò)與端粒結(jié)合蛋白質(zhì)雙鏈部分通過(guò)與端粒結(jié)合蛋白質(zhì)TRF1和和TRF2 結(jié)合結(jié)合 共同組成共同組成t環(huán)環(huán)(t loops)。這種。這種t 環(huán)特殊結(jié)構(gòu)可維持染色環(huán)特殊結(jié)構(gòu)可維持染色 體末端的穩(wěn)定體末端的穩(wěn)定,保持染色體及其內(nèi)部基因的完整性保持染色體及其內(nèi)部基因的完整性,從從 而使遺傳物質(zhì)得以完整復(fù)制。缺少端粒的染色體不而使遺傳物質(zhì)得以完整復(fù)制。缺少端粒的染色體不 能穩(wěn)定存在。能穩(wěn)定存在。 端粒端粒DNA與結(jié)構(gòu)蛋白形成的復(fù)合物如同染色體與結(jié)構(gòu)蛋白形成的復(fù)合物如同染色體 的一頂?shù)囊豁敗懊弊用弊印?，它既可保護(hù)染色體不被降解，又，它既可保護(hù)染色體不被降解，又

7、 避免了端粒對(duì)端融合（避免了端粒對(duì)端融合（end-end fusion）以及染色體）以及染色體 的喪失，同時(shí)端粒能幫助細(xì)胞識(shí)別完整染色體和受的喪失，同時(shí)端粒能幫助細(xì)胞識(shí)別完整染色體和受 損染色體。在生理情況下，端粒作為細(xì)胞損染色體。在生理情況下，端粒作為細(xì)胞“分裂時(shí)分裂時(shí) 鐘鐘”能縮短，最終導(dǎo)致細(xì)胞脫離細(xì)胞周期。能縮短，最終導(dǎo)致細(xì)胞脫離細(xì)胞周期。 端粒端粒DNA的長(zhǎng)度的長(zhǎng)度： 端粒端粒DNADNA的平均長(zhǎng)度因物種而異。的平均長(zhǎng)度因物種而異。 端粒端粒DNADNA的長(zhǎng)度總是波動(dòng)變化，隨遺傳或營(yíng)養(yǎng)狀態(tài)而改變。的長(zhǎng)度總是波動(dòng)變化，隨遺傳或營(yíng)養(yǎng)狀態(tài)而改變。 人體中，隨細(xì)胞分裂，會(huì)緩慢縮短。人體中，隨細(xì)

8、胞分裂，會(huì)緩慢縮短。 Telomere length 端粒端粒DNA重復(fù)重復(fù) 序列序列T 四膜蟲(chóng)，四膜蟲(chóng)， 酵母，酵母， 植物，植物， 蠶，蠶， 人人 端粒結(jié)合蛋白端粒結(jié)合蛋白 與端粒與端粒DNADNA上的特異序列相結(jié)合的蛋白上的特異序列相結(jié)合的蛋白 質(zhì)稱為端粒結(jié)合蛋白。質(zhì)稱為端粒結(jié)合蛋白。 人端粒重復(fù)序列結(jié)合因子人端粒重復(fù)序列結(jié)合因子(Telomeric (Telomeric repeat factorrepeat factor，TRF)TRF)，包括，包括TRF1TRF1和和TRF2TRF2。 TRF1TRF1通過(guò)負(fù)反饋機(jī)制抑制端粒增長(zhǎng)，通過(guò)負(fù)反饋機(jī)制抑制端粒增長(zhǎng)， 穩(wěn)定端粒長(zhǎng)度，其并不抑

9、制端粒酶穩(wěn)定端粒長(zhǎng)度，其并不抑制端粒酶 (telomerase)(telomerase)的表達(dá)而是抑制它在端粒末的表達(dá)而是抑制它在端粒末 端的行為端的行為 TRF1 TRF1，是一個(gè)是一個(gè)60 kD60 kD的蛋白，結(jié)合同的蛋白，結(jié)合同 源二聚體雙鏈源二聚體雙鏈TTAGGGTTAGGG重復(fù)序列，包含重復(fù)序列，包含 一個(gè)一個(gè)C C端螺旋端螺旋- -轉(zhuǎn)折轉(zhuǎn)折- -螺旋區(qū)和一個(gè)螺旋區(qū)和一個(gè)DNADNA 結(jié)合折疊同源區(qū)，結(jié)合折疊同源區(qū)，N N端是酸性區(qū)。端是酸性區(qū)。 TRF2TRF2，與與TRF1TRF1相似，但相似，但N N端堿性強(qiáng)。可端堿性強(qiáng)?？?以防止染色體末端相互融合。以防止染色體末端相互融合

10、。 兩種蛋白在體外都專一與雙鏈兩種蛋白在體外都專一與雙鏈TTAGGGTTAGGG 重復(fù)序列結(jié)合，在體內(nèi)則位于端粒。重復(fù)序列結(jié)合，在體內(nèi)則位于端粒。 人該環(huán)人該環(huán)DNA DNA 與與TRF1TRF1、TRF2TRF2結(jié)合，結(jié)合， TRF2TRF2參與參與T T環(huán)形成。環(huán)形成?！癟 T環(huán)環(huán)”保護(hù)保護(hù)3 3端對(duì)端對(duì) 抗雙鏈破壞的核酸酶作用。）抗雙鏈破壞的核酸酶作用。） Telomere T-loop 2. 2.端粒的功能端粒的功能 端粒酶的結(jié)構(gòu)與功能端粒酶的結(jié)構(gòu)與功能 端粒酶端粒酶是一種是一種RNA-RNA-蛋白質(zhì)復(fù)合物，蛋白質(zhì)復(fù)合物， 在端粒被發(fā)現(xiàn)以前，人們就推測(cè)生殖細(xì)胞之所在端粒被發(fā)現(xiàn)以前，人們

11、就推測(cè)生殖細(xì)胞之所 以能世代相傳，其中可能存在一種維持端粒長(zhǎng)度的以能世代相傳，其中可能存在一種維持端粒長(zhǎng)度的 特殊機(jī)制，體細(xì)胞可能正是由于缺乏這種機(jī)制，它特殊機(jī)制，體細(xì)胞可能正是由于缺乏這種機(jī)制，它 的染色體末端才面臨著致死性缺失（的染色體末端才面臨著致死性缺失（deletion）的危）的危 險(xiǎn) 。 因 此 在 正 常 人 體 細(xì) 胞 間 永 生 化 細(xì) 胞險(xiǎn) 。 因 此 在 正 常 人 體 細(xì) 胞 間 永 生 化 細(xì) 胞 （immortalized cells）及腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)化過(guò)程中可）及腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)化過(guò)程中可 能也存在著與生殖細(xì)胞類似的機(jī)制。這些細(xì)胞怎樣能也存在著與生殖細(xì)胞類似的機(jī)制。這些

12、細(xì)胞怎樣 保持細(xì)胞具有繼續(xù)分裂或長(zhǎng)期分裂的能力呢？科學(xué)保持細(xì)胞具有繼續(xù)分裂或長(zhǎng)期分裂的能力呢？科學(xué) 家們發(fā)現(xiàn)端粒確實(shí)隨著每次分裂而縮短，但也會(huì)被家們發(fā)現(xiàn)端粒確實(shí)隨著每次分裂而縮短，但也會(huì)被 新合成的端粒片斷再延長(zhǎng)?？茖W(xué)家們懷疑，可能尚新合成的端粒片斷再延長(zhǎng)?？茖W(xué)家們懷疑，可能尚 有末被發(fā)現(xiàn)的酶，該酶具有標(biāo)準(zhǔn)的有末被發(fā)現(xiàn)的酶，該酶具有標(biāo)準(zhǔn)的DNA多聚酶所不多聚酶所不 具備的功能，能使已縮短的端粒延長(zhǎng)，使科學(xué)家們具備的功能，能使已縮短的端粒延長(zhǎng)，使科學(xué)家們 興奮的是到興奮的是到1984年首先在四膜蟲(chóng)中證實(shí)了這種能使年首先在四膜蟲(chóng)中證實(shí)了這種能使 端粒延長(zhǎng)的酶端粒延長(zhǎng)的酶端粒酶的存在。端粒酶的存在。

13、 端粒酶的結(jié)構(gòu)端粒酶的結(jié)構(gòu) 端粒酶在結(jié)構(gòu)上為一核糖核蛋白復(fù)合體端粒酶在結(jié)構(gòu)上為一核糖核蛋白復(fù)合體, ,由由RNA RNA 和結(jié)合的蛋白質(zhì)組成和結(jié)合的蛋白質(zhì)組成, ,是是RNARNA依賴的依賴的DNA DNA 聚合酶。它是聚合酶。它是 一種特殊的能合成端粒一種特殊的能合成端粒DNADNA的酶的酶, ,通過(guò)明顯的模板依賴通過(guò)明顯的模板依賴 方式每次添加一個(gè)核苷酸。方式每次添加一個(gè)核苷酸。 端粒酶實(shí)質(zhì)上是一種特殊的逆轉(zhuǎn)錄酶端粒酶實(shí)質(zhì)上是一種特殊的逆轉(zhuǎn)錄酶 端粒酶端粒酶RNA(hTR)RNA(hTR) 端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶（端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶（TERTTERT） 端粒酶結(jié)合蛋白端粒酶結(jié)合蛋白（TEP） 1 1、

14、端粒酶、端粒酶RNA(hTERT)RNA(hTERT) 哺乳動(dòng)物端粒酶哺乳動(dòng)物端粒酶RNAs(hTR)RNAs(hTR)在許多組織的不同發(fā)育階段在許多組織的不同發(fā)育階段, , 甚至那些沒(méi)有端粒酶活性的組織中廣泛表達(dá)。甚至那些沒(méi)有端粒酶活性的組織中廣泛表達(dá)。 體內(nèi)端粒酶體內(nèi)端粒酶RNARNA的存在對(duì)端粒酶功能至關(guān)重要，影響到的存在對(duì)端粒酶功能至關(guān)重要，影響到 端粒酶端粒酶RNARNA的穩(wěn)定性與突變的穩(wěn)定性與突變, ,也可改變體內(nèi)端粒長(zhǎng)度，并可通也可改變體內(nèi)端粒長(zhǎng)度，并可通 過(guò)改變端粒完整性或端粒結(jié)合因子的末端結(jié)合位點(diǎn)致細(xì)胞核過(guò)改變端粒完整性或端粒結(jié)合因子的末端結(jié)合位點(diǎn)致細(xì)胞核 分裂后期細(xì)胞死亡分

15、裂后期細(xì)胞死亡 。 端粒酶端粒酶RNARNA轉(zhuǎn)錄模板轉(zhuǎn)錄模板 遠(yuǎn)端區(qū)遠(yuǎn)端區(qū): :參與和底物的結(jié)合。參與和底物的結(jié)合。 近端區(qū)近端區(qū): :能添加特定的核苷酸能添加特定的核苷酸, ,對(duì)底物識(shí)別并不重要。對(duì)底物識(shí)別并不重要。 模板邊界區(qū)模板邊界區(qū): :與端粒酶催化亞基與端粒酶催化亞基TERTTERT結(jié)合結(jié)合, ,也與端粒酶相關(guān)也與端粒酶相關(guān) 因子因子Est1pEst1p和和Ku Ku 結(jié)合。結(jié)合。 Telomerase RNA The template region Main TERT-binding region Template boundary element(TBE) TRE, Templa

16、te recognition element Low affinity TERT binding sites Annu.Rev.Biochem 2006, 75:493-517 2 2、端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶、端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(Telomerase reverse (Telomerase reverse transcriptase,TERT)transcriptase,TERT) 幾乎所有存在端粒酶的機(jī)體均含有一單獨(dú)的幾乎所有存在端粒酶的機(jī)體均含有一單獨(dú)的 TERT TERT 基因基因, , 哺乳動(dòng)物哺乳動(dòng)物TERT TERT 的轉(zhuǎn)錄由許多轉(zhuǎn)錄因的轉(zhuǎn)錄由許多轉(zhuǎn)錄因 子、激素和細(xì)胞外信號(hào)嚴(yán)格控制子、激素和

17、細(xì)胞外信號(hào)嚴(yán)格控制。不同的轉(zhuǎn)錄因不同的轉(zhuǎn)錄因 子調(diào)節(jié)子調(diào)節(jié)hTERThTERT在不同的細(xì)胞內(nèi)含物中的表達(dá)。癌基在不同的細(xì)胞內(nèi)含物中的表達(dá)。癌基 因因c-mycc-myc是一個(gè)受特殊信號(hào)調(diào)節(jié)的可誘導(dǎo)癌基因是一個(gè)受特殊信號(hào)調(diào)節(jié)的可誘導(dǎo)癌基因, , 并可與并可與H HRasRas、N NRasRas、多瘤病毒多瘤病毒MTMT、LT LT 等癌基等癌基 因協(xié)同作用因協(xié)同作用, , 促進(jìn)細(xì)胞無(wú)限增殖促進(jìn)細(xì)胞無(wú)限增殖, , 獲得永生化并獲得永生化并 發(fā)生癌變。發(fā)生癌變。 人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶 （human Telomerase Reverse Transcriptase (TERT),） TE

18、RT gene : 3396bp, protein: 1131 氨基酸殘基 Crystal Structure of the Essential N-terminal of the telomerase reverse transcriptase (TEN) C-terminal domain of TERT Nature structureal 膀胱癌組膀胱癌組 織中端粒酶陽(yáng)性率為織中端粒酶陽(yáng)性率為90%(342/381),正常組織為正常組織為 27% (36/134);膀胱癌患者尿液中端粒酶陽(yáng)性率為膀胱癌患者尿液中端粒酶陽(yáng)性率為 65%(436/675) ,膀胱灌洗液中端粒酶陽(yáng)性率為膀胱灌

19、洗液中端粒酶陽(yáng)性率為72 %(131/182) ,而正常人為而正常人為9%(47/ 486);前列腺癌組織前列腺癌組織 中端粒酶陽(yáng)性率為中端粒酶陽(yáng)性率為80%(266/332),鄰近組織為鄰近組織為 38%(32/83) ,前列腺上皮瘤為前列腺上皮瘤為16%(4/25) ,良性前列良性前列 腺肥大為腺肥大為8%(11/129) 。 85%90%的人腫瘤細(xì)胞中可以檢測(cè)到端粒的人腫瘤細(xì)胞中可以檢測(cè)到端粒 酶活性酶活性,而正常細(xì)胞中卻沒(méi)有或活性很低。人們推而正常細(xì)胞中卻沒(méi)有或活性很低。人們推 測(cè)腫瘤細(xì)胞逃避衰老持續(xù)增殖是端粒酶激活或端測(cè)腫瘤細(xì)胞逃避衰老持續(xù)增殖是端粒酶激活或端 粒維持機(jī)制改變的結(jié)果。

20、粒維持機(jī)制改變的結(jié)果。 一般認(rèn)為一般認(rèn)為,端粒酶的激活是惡性腫瘤發(fā)生過(guò)程中端粒酶的激活是惡性腫瘤發(fā)生過(guò)程中 的一個(gè)后期事件的一個(gè)后期事件,使腫瘤細(xì)胞的端粒不再進(jìn)行性縮使腫瘤細(xì)胞的端粒不再進(jìn)行性縮 短而得以維持短而得以維持,避免了細(xì)胞正常的復(fù)制避免了細(xì)胞正常的復(fù)制-衰亡機(jī)制衰亡機(jī)制 的制約而獲得永生性的制約而獲得永生性,這是惡性腫瘤細(xì)胞顯著的生這是惡性腫瘤細(xì)胞顯著的生 物學(xué)特征之一物學(xué)特征之一,是癌變機(jī)制中一個(gè)十分重要的環(huán)節(jié)是癌變機(jī)制中一個(gè)十分重要的環(huán)節(jié)。 對(duì)細(xì)胞端粒功能的觀察和推測(cè)的最顯著的特征對(duì)細(xì)胞端粒功能的觀察和推測(cè)的最顯著的特征 是發(fā)生端粒長(zhǎng)度的維持是發(fā)生端粒長(zhǎng)度的維持,甚至在離開(kāi)常規(guī)的

21、激活時(shí)甚至在離開(kāi)常規(guī)的激活時(shí) 端粒長(zhǎng)度維持機(jī)制端粒長(zhǎng)度維持機(jī)制(TMM)的延長(zhǎng)的延長(zhǎng),使初期細(xì)胞突破使初期細(xì)胞突破 衰老屏障后癌變。發(fā)生的原因衰老屏障后癌變。發(fā)生的原因,最可能為過(guò)度的端最可能為過(guò)度的端 粒酶激活在細(xì)胞癌變中端粒長(zhǎng)度的保留或增加粒酶激活在細(xì)胞癌變中端粒長(zhǎng)度的保留或增加,允允 許在致瘤突變發(fā)生時(shí)異?？寺〉臄U(kuò)展。許在致瘤突變發(fā)生時(shí)異常克隆的擴(kuò)展。 一些端粒酶陰性的癌癥通過(guò)一種或幾種一些端粒酶陰性的癌癥通過(guò)一種或幾種ALT途途 經(jīng)維持端粒的長(zhǎng)度。端粒酶或經(jīng)維持端粒的長(zhǎng)度。端粒酶或ALT機(jī)制存在于絕大機(jī)制存在于絕大 多數(shù)腫瘤細(xì)胞中以通過(guò)添加端粒重復(fù)序列而維持端多數(shù)腫瘤細(xì)胞中以通過(guò)添加端

22、粒重復(fù)序列而維持端 粒的長(zhǎng)度。粒的長(zhǎng)度。 在一些腫瘤中也觀察到一些端?？s短的現(xiàn)象，在一些腫瘤中也觀察到一些端?？s短的現(xiàn)象， 可能的機(jī)制是由于細(xì)胞分裂的增加端?？s短，導(dǎo)致可能的機(jī)制是由于細(xì)胞分裂的增加端?？s短，導(dǎo)致 異常修復(fù)事件使染色體發(fā)生端端融合。端端融合的異常修復(fù)事件使染色體發(fā)生端端融合。端端融合的 后果是在隨后的細(xì)胞分裂過(guò)程中發(fā)生染色體斷裂后果是在隨后的細(xì)胞分裂過(guò)程中發(fā)生染色體斷裂, , 進(jìn)而導(dǎo)致遺傳不穩(wěn)定和腫瘤易感性。進(jìn)而導(dǎo)致遺傳不穩(wěn)定和腫瘤易感性。 以端粒酶為靶標(biāo)的抗癌藥物研究以端粒酶為靶標(biāo)的抗癌藥物研究 在在85%85%以上的腫瘤細(xì)胞和組織中高度表達(dá)端粒酶，以上的腫瘤細(xì)胞和組織中高度

23、表達(dá)端粒酶， 因此端粒酶是一個(gè)較理想的抗腫瘤藥物靶標(biāo)。因此端粒酶是一個(gè)較理想的抗腫瘤藥物靶標(biāo)。 (1)(1)使用端粒酶抑制劑后使用端粒酶抑制劑后, ,腫瘤細(xì)胞端?？s短直至足腫瘤細(xì)胞端?？s短直至足 以對(duì)增殖產(chǎn)生負(fù)面效應(yīng)以對(duì)增殖產(chǎn)生負(fù)面效應(yīng), ,這種時(shí)間上的滯后與起始端這種時(shí)間上的滯后與起始端 粒的長(zhǎng)度有關(guān)；粒的長(zhǎng)度有關(guān)； (2)(2)至少在理論上腫瘤細(xì)胞存在抗端粒酶抑制劑或不至少在理論上腫瘤細(xì)胞存在抗端粒酶抑制劑或不 依賴端粒酶的端粒維持機(jī)制的可能；依賴端粒酶的端粒維持機(jī)制的可能； (3)(3)端粒酶抑制劑對(duì)人表達(dá)端粒酶的體細(xì)胞可能有作端粒酶抑制劑對(duì)人表達(dá)端粒酶的體細(xì)胞可能有作 用用, ,例如造

24、血干細(xì)胞、生殖細(xì)胞、表皮基層細(xì)胞和腸例如造血干細(xì)胞、生殖細(xì)胞、表皮基層細(xì)胞和腸 腺管細(xì)胞腺管細(xì)胞, ,但這種作用可能很小但這種作用可能很小, ,因?yàn)樾律M織的干因?yàn)樾律M織的干 細(xì)胞比腫瘤細(xì)胞的端粒要長(zhǎng)得多。在細(xì)胞靜止期細(xì)胞比腫瘤細(xì)胞的端粒要長(zhǎng)得多。在細(xì)胞靜止期, ,端端 粒不縮短粒不縮短, ,端粒酶幾乎沒(méi)有活性。端粒酶幾乎沒(méi)有活性。 端粒酶抑制劑對(duì)腫瘤細(xì)胞和端粒酶陽(yáng)性的端粒酶抑制劑對(duì)腫瘤細(xì)胞和端粒酶陽(yáng)性的 正常細(xì)胞的作用是不同的正常細(xì)胞的作用是不同的: :腫瘤細(xì)胞對(duì)端粒酶抑腫瘤細(xì)胞對(duì)端粒酶抑 制劑很敏感制劑很敏感, ,作用一定時(shí)間后細(xì)胞出現(xiàn)生長(zhǎng)抑制作用一定時(shí)間后細(xì)胞出現(xiàn)生長(zhǎng)抑制 或凋亡或凋亡

25、; ; 生殖細(xì)胞在端粒酶抑制劑的作用下生殖細(xì)胞在端粒酶抑制劑的作用下, ,端粒長(zhǎng)端粒長(zhǎng) 度稍有縮短度稍有縮短, ,然后繼續(xù)生長(zhǎng)然后繼續(xù)生長(zhǎng), ,端粒不再縮短端粒不再縮短; ; 干細(xì)胞與端粒酶陰性的細(xì)胞相比干細(xì)胞與端粒酶陰性的細(xì)胞相比, ,其端粒縮其端?？s 短的速度慢得多短的速度慢得多, ,經(jīng)端粒酶抑制劑作用后經(jīng)端粒酶抑制劑作用后, ,干細(xì)干細(xì) 胞中端?？s短的速度有所加快胞中端?？s短的速度有所加快, ,一旦去除抑制劑一旦去除抑制劑, , 端?？s短的速度又降低。端?？s短的速度又降低。 端粒酶抑制劑的研究進(jìn)展端粒酶抑制劑的研究進(jìn)展 一、以端粒酶酶一、以端粒酶酶RNA為靶標(biāo)為靶標(biāo) 通過(guò)阻斷端粒酶通過(guò)阻

26、斷端粒酶RNA的模板作用對(duì)端粒酶活性的抑的模板作用對(duì)端粒酶活性的抑 制制 1、反義寡核苷酸是端粒酶抑制劑研究領(lǐng)域中的 熱點(diǎn),它是與靶RNA 配對(duì)的一段短鏈DNA。按堿基 配對(duì)原理與靶RNA 形成雜合體,被動(dòng)和主動(dòng)地抑制 RNA 的轉(zhuǎn)錄。 2、核酶對(duì)端粒酶活性的抑制，核酶是具有特 殊核酸內(nèi)切酶活性的小分子RNA，通過(guò)催化中心的 反義序列識(shí)別靶位。核酶有望成為廣譜，低毒，高 效的抗癌新藥。 二、抑制端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶活性二、抑制端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶活性 1、hTERT 突變突變 在體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)中,hTERT 突變后端粒酶活性 均明顯被抑制。 端粒酶抑制劑誘導(dǎo)端粒進(jìn)行性縮短,當(dāng)細(xì)胞端粒 縮短到臨界點(diǎn)時(shí)細(xì)胞進(jìn)

27、入凋亡期。 2、逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑、逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑 ( reverse transcriptase inhibitors ,RTI) 由于端粒酶是 RNA 依賴的DNA聚合酶,所以RTI可以成為腫瘤治 療藥物。其中對(duì)于齊多夫定的研究最多。 3 3、靶向、靶向hTERT mRNAhTERT mRNA的的ASODNASODN 針對(duì)hTERTmRNA 設(shè)計(jì)的ASODN 能選擇性地與靶基 因雜交,阻斷靶基因的表達(dá)。 三、三、G四聯(lián)體的穩(wěn)定四聯(lián)體的穩(wěn)定 端粒3端突出鏈富含鳥(niǎo)苷,在體外可形成四鏈 DNA 結(jié)構(gòu),稱為G四聯(lián)體。形成G四聯(lián)體后端粒酶 活性受到抑制。因此,能穩(wěn)定G四聯(lián)體的藥物就可 能是有效的端粒酶抑

28、制劑。已發(fā)現(xiàn)很多此類化合 物,這些藥物可以抑制端粒酶,但尚無(wú)縮短端粒的報(bào) 道。 四、小分子抑制劑四、小分子抑制劑 通過(guò)分子結(jié)構(gòu)模擬軟件進(jìn)行擬合分析，或通 過(guò)其他高通量模式快速篩選端粒酶的小分子抑制 劑是近年來(lái)發(fā)展較快的一個(gè)領(lǐng)域,此方法是基于化 學(xué)結(jié)構(gòu)的生物信息學(xué)策略去搜尋先導(dǎo)化合物,用這 一策略已發(fā)現(xiàn)了幾個(gè)端粒酶抑制劑(例如FJ5002) , 但其作用機(jī)制尚不清楚。 Li et al, Cancer Res 2004; Li et al, 2005; Bagheri et al 2006 Telomerase knock-down in cancer cells RAPIDLY inhibit

29、s cancer cell growth p53 is not required for this NO telomere uncapping or DNA damage response Metastasis is reduced HOW? RAPIDLY downregulates cell cycle and tumor progression genes Glucose metabolism downregulated Cell differentiation program induced? Very short telomeres lead to chromosomal insta

30、bility by cycles of BRIDGE BREAKAGE FUSION Anaphase bridges End-to-end fusion Telomere shortening1 2 3 VIDEO Dicentric chromosome in a metaphase spread of cells from a human pancreatic carcinoma cell line (centromes in pink) MORE cell divisions senescence With more telomerase, less loss of DNA each

31、cell division cell divisions Faster senescence Telomeres and Disease CAD, Myocardial Infarction Diabetes Vascular dementia Obesity, insulin resistance Alzheimers Disease Rheumatoid Arthritis Bone Density Samani et al, Lancet, 2001; Brouilette et al, 2003; Arterioscler Thromb Vasc Biol 2003; Sampson,

32、 2006, Diabetes Care; von Zglinicki, 2000, Lab Invest. Jeanclos et al, 2000, Hypertension; Valdes et al, . Lancet 2005; Gardner, 2005, Circulation; Valdes et al, 2006, Osteoporosis Int. Steer et al., 2007 Annals Rheum Disease; Cawthon, 2003, Lancet Three Markers of Cellular Aging Telomerase activity

33、 Telomere length Cellular Oxidative stress Psychological Stress, Risks of Cardiovascular Disease and Telomeres/Telomerase/Oxidative Stress Telomere maintenance and risk of cardiovascular disease In the largest epidemiological study of risk factors for cardiovascular disease, six prominent factors we

34、re shown to be: smoking poor lipid profile high blood pressure diabetes abdominal obesity psychological stress (Yusef et al, Lancet 2004:304). A link in vivo In the largest epidemiological study of risk factors for cardiovascular disease, six prominent factors were shown to be: smoking poor lipid pr

35、ofile high blood pressure diabetes abdominal obesity psychological stress (Yusef et al, Lancet 2004:304). Chronic stress was associated with three markers of cellular aging Lower telomerase activity Higher oxidative index Shorter telomere length Telomere maintenance and risk of cardiovascular diseas

36、e *Epel et al, 2004 * A link in vivo In the largest epidemiological study of risk factors for cardiovascular disease, six prominent factors were shown to be: smoking poor lipid profile high blood pressure diabetes abdominal obesity psychological stress (Yusef et al, Lancet 2004:304). smoking cholest

37、erol/blood lipids resting cardiovascular activity fasting insulin and glucose adiposity psychological stress Chronic stress was associated with three markers of cellular aging Lower telomerase activity Higher oxidative index Shorter telomere length Telomere maintenance and risk of cardiovascular dis

38、ease *Epel et al, 2004 * A link in vivo In the largest epidemiological study of risk factors for cardiovascular disease, six prominent factors were shown to be: smoking poor lipid profile high blood pressure diabetes abdominal obesity psychological stress (Yusef et al, Lancet 2004:304). smoking chol

39、esterol/blood lipids resting cardiovascular activity fasting glucose adiposity psychological stress Stress was associated with three markers of cellular aging Lower telomerase activity Higher oxidative index Telomere length Telomere maintenance and risk of cardiovascular disease *Epel et al, 2006 A

40、link in vivo Example: Telomerase and whether currently smoking 0.001.00 Currently smoking 0.0000 0.0500 0.1000 0.1500 0.2000 0.2500 0.3000 telomerase units (10,000 cells) p 10kb10kb）, ,隨細(xì)胞有隨細(xì)胞有 絲分裂，端?？s短是個(gè)緩慢的過(guò)程，這種情況下端絲分裂，端?？s短是個(gè)緩慢的過(guò)程，這種情況下端 粒酶抑制劑是否有效尚待進(jìn)一步證實(shí)。粒酶抑制劑是否有效尚待進(jìn)一步證實(shí)。 二、研究展望二、研究展望 大量實(shí)驗(yàn)表明，端粒酶可有效

41、地調(diào)控端粒的大量實(shí)驗(yàn)表明，端粒酶可有效地調(diào)控端粒的 長(zhǎng)度，而端粒的長(zhǎng)度直接對(duì)細(xì)胞的增殖或凋亡起作長(zhǎng)度，而端粒的長(zhǎng)度直接對(duì)細(xì)胞的增殖或凋亡起作 用，從而決定人體壽命的長(zhǎng)短。隨著對(duì)端粒、端粒用，從而決定人體壽命的長(zhǎng)短。隨著對(duì)端粒、端粒 酶結(jié)構(gòu)和端粒酶激活及調(diào)節(jié)機(jī)制的深入研究酶結(jié)構(gòu)和端粒酶激活及調(diào)節(jié)機(jī)制的深入研究, ,端粒端粒 酶與人類衰老和腫瘤發(fā)生、發(fā)展的關(guān)系將進(jìn)一步明酶與人類衰老和腫瘤發(fā)生、發(fā)展的關(guān)系將進(jìn)一步明 確確; ; 如何將端粒酶檢測(cè)作為腫瘤診斷標(biāo)記仍是今后如何將端粒酶檢測(cè)作為腫瘤診斷標(biāo)記仍是今后 研究的方向。研究的方向。 同時(shí)進(jìn)一步探討端粒、端粒酶和衰老因素、長(zhǎng)同時(shí)進(jìn)一步探討端粒、端粒酶

42、和衰老因素、長(zhǎng) 壽因素之間的關(guān)系，以及開(kāi)展克隆人端粒基因等科壽因素之間的關(guān)系，以及開(kāi)展克隆人端粒基因等科 研課題對(duì)于研究人體衰老與抗衰老有著十分重要的研課題對(duì)于研究人體衰老與抗衰老有著十分重要的 意義。意義。 第三節(jié)第三節(jié) 端粒酶細(xì)胞周期中細(xì)胞增殖、凋亡的影響端粒酶細(xì)胞周期中細(xì)胞增殖、凋亡的影響 一、端粒酶對(duì)細(xì)胞周期的影響一、端粒酶對(duì)細(xì)胞周期的影響 端粒酶活性與細(xì)胞周期密切相關(guān)。細(xì)胞周期所端粒酶活性與細(xì)胞周期密切相關(guān)。細(xì)胞周期所 處階段不同處階段不同,端粒酶活性亦不同端粒酶活性亦不同, 端粒酶活性與細(xì)胞端粒酶活性與細(xì)胞 周期周期CDK-CKIs 網(wǎng)絡(luò)調(diào)控系統(tǒng)有關(guān)網(wǎng)絡(luò)調(diào)控系統(tǒng)有關(guān) 。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)永生

43、。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)永生 化細(xì)胞株在細(xì)胞周期各個(gè)時(shí)相都有端粒酶活性化細(xì)胞株在細(xì)胞周期各個(gè)時(shí)相都有端粒酶活性,而靜而靜 息細(xì)胞中活性降低息細(xì)胞中活性降低,隨著腫瘤細(xì)胞進(jìn)入隨著腫瘤細(xì)胞進(jìn)入G1/S 期期,端粒端粒 酶活性逐漸升高酶活性逐漸升高,在復(fù)制在復(fù)制S 期端粒酶活性最高期端粒酶活性最高,而在而在 G2/M期端粒酶活性逐漸喪失期端粒酶活性逐漸喪失,當(dāng)培養(yǎng)細(xì)胞處于無(wú)血當(dāng)培養(yǎng)細(xì)胞處于無(wú)血 清而進(jìn)入清而進(jìn)入G0 期時(shí)期時(shí),端粒酶活性不受影響。在人乳腺端粒酶活性不受影響。在人乳腺 癌中癌中,端粒酶的高活性水平伴有端粒酶的高活性水平伴有cylinD 或或cyclin E 的的 高表達(dá)高表達(dá),某些周期蛋白可能參與端

44、粒酶活性的調(diào)控某些周期蛋白可能參與端粒酶活性的調(diào)控。 各種基因毒性或環(huán)境應(yīng)激所致細(xì)胞各種基因毒性或環(huán)境應(yīng)激所致細(xì)胞DNA雙鏈雙鏈 破壞時(shí)可使野生型破壞時(shí)可使野生型p53活化活化, 進(jìn)而引起細(xì)胞周期停進(jìn)而引起細(xì)胞周期停 滯或誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡滯或誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡, 使細(xì)胞得以避免表型惡性轉(zhuǎn)化。使細(xì)胞得以避免表型惡性轉(zhuǎn)化。 端粒雙鏈端粒雙鏈DNA 的破壞是否也能活化的破壞是否也能活化p53依賴的信依賴的信 號(hào)傳導(dǎo)通路呢號(hào)傳導(dǎo)通路呢?kusumoto等在構(gòu)建的端粒酶和等在構(gòu)建的端粒酶和p53 單或雙缺陷鼠體內(nèi)研究證實(shí)單或雙缺陷鼠體內(nèi)研究證實(shí), 端粒端粒DNA的丟失可以的丟失可以 誘導(dǎo)活化誘導(dǎo)活化p53和和p2

45、1WAF1, 并導(dǎo)致細(xì)胞周期停滯，并導(dǎo)致細(xì)胞周期停滯， 而而p53的缺失則可促進(jìn)端粒序列的丟失的缺失則可促進(jìn)端粒序列的丟失, 增大染色增大染色 體的融合頻率。端粒功能的缺失以及相繼出現(xiàn)的體的融合頻率。端粒功能的缺失以及相繼出現(xiàn)的 基因不穩(wěn)定與基因不穩(wěn)定與p 53缺陷相協(xié)同而激活細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化缺陷相協(xié)同而激活細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化 過(guò)程。過(guò)程。 二、端粒酶對(duì)細(xì)胞增殖的影響二、端粒酶對(duì)細(xì)胞增殖的影響 曾一度認(rèn)為端粒酶活性是細(xì)胞惡變或永生的標(biāo)志曾一度認(rèn)為端粒酶活性是細(xì)胞惡變或永生的標(biāo)志, , 然而然而, ,不但在正常組織的永生化細(xì)胞不但在正常組織的永生化細(xì)胞( (如造血干細(xì)胞、精如造血干細(xì)胞、精 子子) ,)

46、,而且在非永生的、正常生理狀態(tài)下增殖活躍的細(xì)而且在非永生的、正常生理狀態(tài)下增殖活躍的細(xì) 胞胞( (如受抗原刺激的如受抗原刺激的T T及及B B淋巴細(xì)胞、口腔和食道粘膜上淋巴細(xì)胞、口腔和食道粘膜上 皮、皮膚基底層角質(zhì)形成細(xì)胞、宮頸上皮、小腸上皮皮、皮膚基底層角質(zhì)形成細(xì)胞、宮頸上皮、小腸上皮) ) 也可檢出端粒酶活性。但也可檢出端粒酶活性。但Lehner Lehner 等用定量等用定量RT-PCR RT-PCR 法在法在 子宮內(nèi)膜癌、增生期子宮內(nèi)膜、分泌期子宮內(nèi)膜及萎縮子宮內(nèi)膜癌、增生期子宮內(nèi)膜、分泌期子宮內(nèi)膜及萎縮 性子宮內(nèi)膜檢測(cè)到性子宮內(nèi)膜檢測(cè)到hTERT mRNA hTERT mRNA 表達(dá)

47、值差異顯著?？梢?jiàn)表達(dá)值差異顯著?？梢?jiàn), , 不同增殖程度的子宮內(nèi)膜均表達(dá)端粒酶活性不同增殖程度的子宮內(nèi)膜均表達(dá)端粒酶活性, ,但其程度但其程度 不同。因此不同。因此, ,借助端粒酶定性檢測(cè)判斷良惡性增殖借助端粒酶定性檢測(cè)判斷良惡性增殖, ,其意其意 義明顯不如定量檢測(cè)。義明顯不如定量檢測(cè)。 已有多次報(bào)道已有多次報(bào)道:改變實(shí)驗(yàn)條件可使多種端粒酶活改變實(shí)驗(yàn)條件可使多種端粒酶活 性陰性細(xì)胞表達(dá)端粒酶活性性陰性細(xì)胞表達(dá)端粒酶活性,并獲得永生并獲得永生;反之反之,抑制某抑制某 些增殖活躍組織的端粒酶活性能抑制細(xì)胞增殖。些增殖活躍組織的端粒酶活性能抑制細(xì)胞增殖。 另有人發(fā)現(xiàn)另有人發(fā)現(xiàn):端粒酶通過(guò)調(diào)節(jié)端粒長(zhǎng)

48、度和生長(zhǎng)促端粒酶通過(guò)調(diào)節(jié)端粒長(zhǎng)度和生長(zhǎng)促 進(jìn)因子基因表達(dá)來(lái)影響細(xì)胞增殖進(jìn)因子基因表達(dá)來(lái)影響細(xì)胞增殖 。提示端粒酶是細(xì)胞。提示端粒酶是細(xì)胞 生長(zhǎng)、增殖中的重要機(jī)制。生長(zhǎng)、增殖中的重要機(jī)制。 但少數(shù)永生化的腫瘤細(xì)胞株和一些軟組織腫瘤但少數(shù)永生化的腫瘤細(xì)胞株和一些軟組織腫瘤 雖然沒(méi)有端粒酶活性雖然沒(méi)有端粒酶活性,但仍有較長(zhǎng)端粒但仍有較長(zhǎng)端粒,提示還存在不提示還存在不 依賴端粒酶的端粒延長(zhǎng)機(jī)制依賴端粒酶的端粒延長(zhǎng)機(jī)制 。 此外用識(shí)別此外用識(shí)別hTR 3端不同序列的三種核酶作用端不同序列的三種核酶作用 于腫瘤細(xì)胞于腫瘤細(xì)胞,4周內(nèi)端粒酶活性降低周內(nèi)端粒酶活性降低,端?？s短端?？s短,增殖速增殖速 度沒(méi)有改

49、變。度沒(méi)有改變。 其他研究如黑素瘤細(xì)胞其他研究如黑素瘤細(xì)胞,8周內(nèi)端粒酶活性降低周內(nèi)端粒酶活性降低, 但是傳代超過(guò)但是傳代超過(guò)20 代后代后,端粒長(zhǎng)度不縮短端粒長(zhǎng)度不縮短,細(xì)胞持續(xù)增殖。細(xì)胞持續(xù)增殖。 說(shuō)明除了端粒、端粒酶引起細(xì)胞增殖的作用外，還說(shuō)明除了端粒、端粒酶引起細(xì)胞增殖的作用外，還 有其他引起細(xì)胞的增殖機(jī)制。有其他引起細(xì)胞的增殖機(jī)制。 三、三、 端粒酶對(duì)細(xì)胞凋亡的影響端粒酶對(duì)細(xì)胞凋亡的影響 啟動(dòng)凋亡的某些基因位于端粒結(jié)構(gòu)附近啟動(dòng)凋亡的某些基因位于端粒結(jié)構(gòu)附近, 完整的端粒完整的端粒 結(jié)構(gòu)可以抑制這些基因的表達(dá)結(jié)構(gòu)可以抑制這些基因的表達(dá), 而維持端粒長(zhǎng)度主要依而維持端粒長(zhǎng)度主要依 賴于端

50、粒酶。賴于端粒酶。 Holt等在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)等在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn), 通過(guò)異位表達(dá)端粒酶通過(guò)異位表達(dá)端粒酶,而使端而使端 粒長(zhǎng)度保持穩(wěn)定的某些正常細(xì)胞對(duì)凋亡的抵抗力增強(qiáng)；粒長(zhǎng)度保持穩(wěn)定的某些正常細(xì)胞對(duì)凋亡的抵抗力增強(qiáng)； 用實(shí)驗(yàn)方法使端粒酶陽(yáng)性細(xì)胞端粒延長(zhǎng)用實(shí)驗(yàn)方法使端粒酶陽(yáng)性細(xì)胞端粒延長(zhǎng), 子代細(xì)胞生存子代細(xì)胞生存 和抗凋亡能力將增強(qiáng)；端粒酶陽(yáng)性永生化細(xì)胞要比端和抗凋亡能力將增強(qiáng)；端粒酶陽(yáng)性永生化細(xì)胞要比端 粒酶陰性永生化細(xì)胞有更強(qiáng)的抗凋亡生存能力。這些粒酶陰性永生化細(xì)胞有更強(qiáng)的抗凋亡生存能力。這些 與兩個(gè)主要的凋亡途徑與兩個(gè)主要的凋亡途徑核內(nèi)鈣依賴核酸內(nèi)切酶誘導(dǎo)核內(nèi)鈣依賴核酸內(nèi)切酶誘導(dǎo) 途徑和途徑和Caspese家族中家族中IL-1B轉(zhuǎn)換酶活化途徑存在缺陷轉(zhuǎn)換酶活化途徑存在缺陷 有關(guān)。此外有關(guān)。此外, 研究發(fā)現(xiàn)誘導(dǎo)研究發(fā)現(xiàn)誘導(dǎo)hTERT 顯性突變顯性突變,降低腫瘤降低腫瘤 細(xì)胞內(nèi)源性端粒酶活性細(xì)胞內(nèi)源性端粒酶活性, 腫瘤細(xì)胞端粒將持續(xù)縮短腫瘤細(xì)胞端粒將持續(xù)縮短, 繼繼 之異常有絲分裂增多之異常有絲分裂增多, 并最終出現(xiàn)大量凋亡細(xì)胞。并最終出現(xiàn)大量凋亡細(xì)胞。 端端 粒粒 端粒端粒 是位于真核細(xì)胞線性染色體末端的是位于真核細(xì)胞線性染色體末端的 特殊結(jié)構(gòu)特殊結(jié)構(gòu), ,由一段重復(fù)串聯(lián)的由一段重復(fù)串聯(lián)的DNADNA序列與端序列與端 粒結(jié)合蛋白構(gòu)成；粒結(jié)合蛋白構(gòu)成； 端粒端粒具有穩(wěn)定