分子醫(yī)學(xué)技能-免疫：酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)ELISA

1、酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn) (ELISA) 目的和要求目的和要求 v掌握ELISA的原理、操作過程及注意事項(xiàng) v了解ELISA實(shí)驗(yàn)結(jié)果的讀取和分析 實(shí)驗(yàn)原理實(shí)驗(yàn)原理 v借助酶標(biāo)記抗體（或抗原）在體外與抗 原（或抗體）結(jié)合，通過相應(yīng)底物被酶 解后出現(xiàn)顯色反應(yīng)。反應(yīng)顏色深淺與抗 原（或抗體）量的多少有關(guān)。 v特點(diǎn)：靈敏、特異 v類型： 雙抗體夾心法、競爭法、間接法等 雙抗夾心法雙抗夾心法ELISA 競爭法競爭法 ELISAELISA 實(shí)驗(yàn)材料實(shí)驗(yàn)材料 vBSA包被的測定板 v酶標(biāo)抗鼠IgG抗體 v待檢血清，陽性血清，陰性血清 v洗滌液： PBS吐溫-20 v底物液：鄰苯二胺（OPD） v終止液：10% H2

2、S04 實(shí)驗(yàn)步驟實(shí)驗(yàn)步驟 加入加入稀釋稀釋好的待測血清每孔好的待測血清每孔100100l， 3737 孵育孵育3030 minmin 加入加入100100l l酶標(biāo)抗體酶標(biāo)抗體, 37, 37 孵育孵育3030 minmin 洗板洗板3 3次次, ,每次每次1 1 minmin 洗板洗板3 3次次, ,每次每次1 1 minmin 實(shí)驗(yàn)步驟實(shí)驗(yàn)步驟 加入加入100100l l四甲基聯(lián)苯胺四甲基聯(lián)苯胺 （TMB)TMB)底物液避光室溫孵育底物液避光室溫孵育 1010 minmin 終止反應(yīng)終止反應(yīng): :每孔加每孔加1 1滴滴10 10 硫酸硫酸 結(jié)果觀察結(jié)果觀察 注意事項(xiàng)注意事項(xiàng) u加樣加樣：應(yīng)

3、將所加物加在：應(yīng)將所加物加在ELISAELISA板孔的底部，并板孔的底部，并 注意不可濺出，不可產(chǎn)生氣泡。注意不可濺出，不可產(chǎn)生氣泡。 u洗板洗板：每次洗液加入后，應(yīng)靜置：每次洗液加入后，應(yīng)靜置1 1分鐘使清洗分鐘使清洗 更加徹底。末次洗板盡量將水甩干。更加徹底。末次洗板盡量將水甩干。 u液體全部加完后，可將酶標(biāo)板在桌子上平行輕液體全部加完后，可將酶標(biāo)板在桌子上平行輕 輕晃動輕晃動3030秒，秒，混勻混勻液體。液體。 u底物有底物有毒性毒性，終止液對皮膚有腐蝕性，盡量避，終止液對皮膚有腐蝕性，盡量避 免接觸。免接觸。 將待測血清將待測血清1:1001:100稀釋后，再做倍比稀釋到各孔，稀釋后，再做倍比稀釋到各孔， 每孔每孔100l100l，見表。注意，見表。注意混勻混勻。 1: 100 1: 200 1: 400 1: 800 1: 1600 1: 3200 1: 6400 1: 12800 1:256 00 1:512 00 陽性陽性 血清血清 陰性陰性 血清血清 100ul 血清稀釋及加樣血清稀釋及加樣 1: 100 1: 200 1: 400 1: 800 1: 1600 1: 3200 1: 6400 1: 12800 1:256 00 1:512 00 免疫免疫 前前 空白空白 （?。ㄏ?釋液釋液 100） 198+ 2