超氧化物歧化酶SOD提取

1、1實驗材料：玉米籽粒。2試劑：注意配好每一試劑時，應(yīng)立即轉(zhuǎn)入試劑瓶當(dāng)中，不要將試劑放在容量瓶當(dāng)中存放，一定要及時將試劑瓶貼好相應(yīng)的標(biāo)簽，標(biāo)明溶液的濃度、pH值、體積、試劑名稱、配制時間、配制人。配制時一定要標(biāo)清，使用時注意不要將其弄掉，這一點將給您帶來無比的快捷和方便。在未經(jīng)老師允許的情況下，不要隨意倒掉實驗室內(nèi)的任何藥品或試劑。（1）1次氯酸鈉：用移液管準(zhǔn)確吸取4mL次氯酸鈉，置于500mL大燒杯中，再用量筒準(zhǔn)確量取400mL自來水稀釋該次氯酸鈉。（2）提取緩沖液：0.05mol/L磷酸氫二鉀磷酸二氫鉀緩沖液，pH7.8。具體配制方法如下：首先是1mol/LpH7.8的磷酸鉀緩沖液母液的配制

2、。a.1mol/LKH2PO4溶液：稱取13.6gKH2PO4，置于50mL小燒杯中，用少量蒸餾水溶解后，移入100mL容量瓶中，用蒸餾水定容至刻度。b.1mol/LK2HPO4溶液：稱取22.8gK2HPO4，置于50mL小燒杯中，用少量蒸餾水溶解后，可稍加熱，移入100mL容量瓶中，用蒸餾水定容至刻度。c.取5mLa液與55mLb液混合后，調(diào)節(jié)pH為7.8，該液即為1mol/L的磷酸鉀緩沖液母液。d.0.05mol/LpH7.8磷酸鉀緩沖液的配制（內(nèi)含1mmol/LEDTA及0.1%-巰基乙醇）：稱取EDTA2Na2H2O0.372g置于50mL小燒杯中，用少量蒸餾水溶解后，移入1000m

3、L容量瓶中，用移液管吸取1mL-巰基乙醇置入該1000mL容量瓶中，用50mL量筒量取50mLc液至該1000mL容量瓶中，用蒸餾水定容至刻度。（3）測試緩沖液：0.026mol/LMet磷酸鈉緩沖液具體配制方法：首先是0.1mol/LpH7.8Na2HPO4NaH2PO4緩沖液母液的配制。a.稱取Na2HPO412H2O（MW=358.14）35.814g于100mL小燒杯中，加少量蒸餾水溶解后，移入1000mL容量瓶中，用蒸餾水定容至刻度。b.稱取NaH2PO42H2O（MW=156.01）1.56g于50mL小燒杯中，加少量蒸餾水溶解后，移入100mL容量瓶中，用蒸餾水定容至刻度。c.量

4、取915mLa液與85mLb液混合后，該液即為0.1mol/LpH7.8的磷酸鈉緩沖液母液。d.稱取L-Met（MW=149.2）0.1941g于50mL小燒杯中，用少量0.1mol/LpH7.8磷酸鈉緩沖液溶解后，移入50mL容量瓶中，用0.1mol/LpH7.8磷酸鈉緩沖液定容至刻度。（4）7.510-4mol/L氯化硝基四氮唑藍（NBT）稱取NBT（MW=817.7）0.0613g于50mL小燒杯中，用少量蒸餾水溶解后，移至100mL容量瓶中，用蒸餾水定容至刻度（最好現(xiàn)用現(xiàn)配，也可貯于冰箱中用23d）。（5）210-5mol/L核黃素溶液a.稱取EDTA（MW=292）0.00292g于

5、50mL小燒杯中，用少量蒸餾水溶解。b.稱取核黃素（MW=376.36）0.0735g于50mL小燒杯中，用少量蒸餾水溶解。c.合并a液和b液，移入100mL容量瓶中，并充分用蒸餾水洗凈上述a和b兩個小燒杯，將洗液移入該容量瓶中，再用蒸餾水定容至刻度（含EDTA0.1mmol，核黃素2mmol）。貯于冰箱中，避光保存。d.測定酶活臨用前，將c液稀釋100倍，即為210-5mol/L核黃素溶液。（6）苯甲酸鈉：1瓶。（7）BaCl2：1瓶。（8）（NH4）2SO4：500g/瓶，1瓶/大組。3儀器：天平3臺，膠體磨1臺，超濾器（0.5m2）1臺，恒溫培養(yǎng)箱1臺，高速冷凍離心機1臺，可見分光光度計

6、5臺，光照箱3臺，移液管架5個，移液管（10mL，5mL，2mL，1mL，0.5mL，0.2mL各10支），微燒杯（10-15mL）130個，量筒（100mL，50mL，1000mL各3個），容量瓶（100mL，50mL各10個），燒杯（100mL，250mL各5個），125mL棕色試劑瓶12個，125mL白色試劑瓶10個，1000mL白色試劑瓶6個，1000mL棕色試劑瓶5個，紗布等。四、操作方法1SOD粗提液的制備取200g玉米籽粒用自來水洗凈后，用1次氯酸鈉400mL漂洗10min消毒后，然后用自來水徹底洗凈，置于器皿中，于28恒溫培養(yǎng)箱中浸泡吸脹24h后，用自來水洗凈，去掉多余的水分，

7、用四層紗布蒙好，置于28恒溫培養(yǎng)箱中發(fā)芽24h后，用自來水洗凈，再用蒸餾水潤洗一次后，進行扒胚，不要求胚的完整性，將胚置于大研缽中，用0.05mol磷酸氫二鉀磷酸二氫鉀提取緩沖液50mL，另外加入1g苯甲酸鈉，在研缽中充分研磨，再加0.05mol磷酸氫二鉀磷酸二氫鉀提取緩沖液50mL，勻漿，在室溫下輕輕攪拌4次/h，浸提1h，8500r/min離心20min，棄沉淀，所得上清液用四層紗布過濾以除去漂浮物，即為酶的粗提液。將上述粗酶液稱量總體積后，再留取10mL粗酶液，用于測定鹽析前的酶活力及比活力和實驗九的電泳。2SOD濃縮（1）鹽析將上述剩余的酶粗提液先以40%（NH4）2SO4飽和1h，8

8、500r/min離心20min去除沉淀，留取上清液，再用90%（NH4）2SO4鹽析24h，8500r/min離心40min，棄去上清液，沉淀用0.05mol/LpH7.8磷酸氫二鉀磷酸二氫鉀提取緩沖液5mL重溶，以蒸餾水透析過夜。將透析液8500r/mim離心20min后，棄沉淀，留取上清液，并量取其體積，即為酶濃縮液。用于測定透析后的酶活力及比活力與濃縮倍數(shù)及回收率，以及用于實驗九的電泳。（2）超濾濃縮取酶粗提液經(jīng)0.5m2超濾器（膜的截留分子量為1萬）濃縮后，量取體積，計算酶活力、比活力、濃縮倍數(shù)及回收率。3SOD活性測定表反應(yīng)體系中各試劑及酶液的取量注：酶液為鹽析前的和透析后的兩個樣品

9、，一個為粗酶液，一個為濃縮液。取8個微燒杯，編好號后，以反應(yīng)系統(tǒng)總體積為3.0mL計算，按上表加入各試劑及酶液。試劑加入后充分混勻，取1號微燒杯放入暗處作為空白（調(diào)零時用）。其它7個微燒杯放入4500Lux日光燈照射下啟動反應(yīng)，15min后遮光終止反應(yīng)。在560nm波長下測定光密度，以2，3號杯的OD值計算出不同酶液量在其反應(yīng)系統(tǒng)中抑制NBT光還原的相關(guān)百分率。然后以所加酶液量為橫坐標(biāo)，以抑制百分率為縱坐標(biāo)作圖，畫出兩者的相關(guān)曲線，找出50%抑制率的酶液量，此酶液量即為一個酶活力單位。五、結(jié)果計算總酶活力（U/g）=酶液總體積（mL）稀釋倍數(shù)抑制50%的酶液量（mL）樣品重（g）抑制率=D1-D2100%注：此實驗的簡易流程為：配制各藥品和試劑篩種洗凈消毒洗凈吸脹洗凈發(fā)芽洗凈扒胚研磨提取離心留