MicroRNA研究概況以及MicroRNA芯片技術(shù)簡(jiǎn)述MicroRNA的研究

1、MicroRNA 研究概況以及 MicroRNA 芯片技術(shù)簡(jiǎn)述 一、 MicroRNA 的研究概況 1. MicroRNA MicroRNA（miRNA , miR）是由約21-25個(gè)核苷酸組成的分子， microRNA 通過(guò)抑制 mRNA 的翻譯或者促進(jìn)其降解而起到負(fù)性調(diào)控的作用。最初 miRNA 的功能在植物學(xué)、癌癥、病毒性感染和發(fā)育生物學(xué)中得到了驗(yàn)證。但最近的研 究發(fā)現(xiàn)，患有心臟疾病的小鼠對(duì)照正常狀態(tài) miRNAs 失調(diào)，并且在肥大的心臟 中也檢測(cè)到了數(shù)種 miRNA 的上調(diào)或者下調(diào)， 同時(shí)體外實(shí)驗(yàn)也證實(shí)了它們對(duì)心肌 細(xì)胞形態(tài)的影響。 2. MicroRNA 的研究進(jìn)展 miRNA現(xiàn)象的

2、最早報(bào)道是在 佃80年的Genetics和Cell上。佃93年在線蟲(chóng)中發(fā)現(xiàn)的lin-4 是第一個(gè)被確定的 miRNA 31，它的基因產(chǎn)物是 21 個(gè)核苷酸的 RNA 分子并且部分序列互 補(bǔ)于lin-14 mRNA的3 UTR區(qū)域。這些互補(bǔ)序列使lin-4間斷地與lin-14 mRNA結(jié) 合。奇怪的是，lin-4沒(méi)有明顯地改變lin-14 mRNA的量，但是Lin-14蛋白表達(dá) 卻明顯降低。2000年又在線蟲(chóng)中發(fā)現(xiàn)了與 lin-4相似的miRNA let-7，它們參與線蟲(chóng) 發(fā)育的時(shí)空調(diào)節(jié)。 miRNA基因首先被RNA聚合酶H轉(zhuǎn)錄為較長(zhǎng)的初始轉(zhuǎn)錄本，該轉(zhuǎn)錄本含有數(shù) 千個(gè)核苷酸，稱其為 pri-mi

3、RNA。在pri-miRNA內(nèi)，miRNA位于由大約70個(gè)核苷酸 構(gòu)成的環(huán)柄結(jié)構(gòu)內(nèi)。在動(dòng)物體內(nèi)，該環(huán)柄結(jié)構(gòu)在細(xì)胞核內(nèi)被RNA酶川Drosha和其輔助 蛋白 Pasha/DGCR8 識(shí)別和切割，形成 pre-miRNA 。之后， pre-miRNA 迅速被核質(zhì) /細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白Exportin5轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞質(zhì)，被位于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的 RNA酶川Dicer 進(jìn)一步切割。產(chǎn)生一個(gè)類似于 siRNA 的 miRNA ：miRNA* 復(fù)合體，隨后，該雙鏈體 解旋為成熟的 miRNA和miRNA*，成熟的miRNA在一種 ATP-依賴的沉默復(fù)合體 （RISC ） 中，形成非對(duì)稱的 RISC 復(fù)合物。而 miRNA

4、* 則可能類似于 siRNA 被 Argonaute 蛋白處理 掉。成熟miRNA通過(guò)與特定靶基因 mRNA的3 UTR完全或不完全的堿基互補(bǔ)方式 引導(dǎo) RISC 與目的 mRNA 結(jié)合，從而降解靶 mRNA 或抑制靶 mRNA 的翻譯（見(jiàn)圖 1），其 中以抑制翻譯為主。 另外最近發(fā)現(xiàn) miRNA 與靶 mRNA 結(jié)合后， 可使靶 mRNA 被外切酶降 解。 miRhjA ww- Cytaplswi Nucleus PtBHTiiRN 串 EjpwlinJ. (OQnnc (rnRW-fnHJMA-) Tianhboiral repression nhRNA dsiMsga tOttht 圖1

5、 miRNA的形成和功能模式圖 miRNA是一類進(jìn)化上保守、在生命中起著重要調(diào)控作用的分子。多種 miRNA在同一個(gè)細(xì)胞中的表達(dá)使得細(xì)胞處在一種內(nèi)在的miRNA環(huán)境中，這個(gè) 環(huán)境控制著成千上萬(wàn)的編碼基因的 mRNA水平，使得各種蛋白的表達(dá)處在一個(gè) 適合的水平。miRNA的發(fā)現(xiàn)豐富了人們對(duì)蛋白質(zhì)合成控制的認(rèn)識(shí)，補(bǔ)充了在 RNA水平對(duì)靶mRNA分子進(jìn)行更迅速和有效的調(diào)節(jié)， miRNA的發(fā)現(xiàn)也是對(duì)中 心法則中RNA次要的中介角色的重要補(bǔ)充。 miRNA在基因組中的數(shù)量（預(yù)計(jì) 在人類基因中含量1%，參與至少10%基因的表達(dá)調(diào)控）和表達(dá)水平（一些 miRNAs在每個(gè)細(xì)胞中的拷貝數(shù)1000），說(shuō)明miRN

6、A是一種含量豐富的 RNA 種類。而且每個(gè)miRNA具有調(diào)節(jié)數(shù)百個(gè)mRNA的潛能；因此在各類小分子RNA 中，miRNA具有最廣泛的基因調(diào)節(jié)功能，它能對(duì)基因活動(dòng)的各個(gè)層面進(jìn)行調(diào)節(jié)。 miRNA的靶基因一般為動(dòng)植物中發(fā)育基因，表明 miRNA在控制生物發(fā)育方面 有不容忽視的作用。miRNA可參與生命過(guò)程中的一系列重要進(jìn)程，包括早期胚 胎發(fā)育、細(xì)胞增殖、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞死亡、脂肪代謝等方面。 隨著近年來(lái)研究的不斷深入，人們開(kāi)始認(rèn)識(shí)到小RNA分子在真核基因表達(dá) 調(diào)控中有著廣泛的作用。目前研究發(fā)現(xiàn)miRNA發(fā)揮功能的領(lǐng)域有：生物個(gè)體發(fā)育； 組織分化；病毒感染；參與癌基因作用。 隨著對(duì)miRNA研究的不斷

7、增加，已經(jīng)有大量的 miRNA為科研工作者們發(fā)現(xiàn)。 近年來(lái), 更是隨著生物信息學(xué)的不斷進(jìn)步，通過(guò)預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)了更多的miRNA，但是這些預(yù)測(cè)的結(jié)果還 必須要通過(guò)實(shí)驗(yàn)的驗(yàn)證才能為事實(shí)所接受。 目前 miRNA 的研究領(lǐng)域主要包括 miRNA 表達(dá)譜和 miRNA 功能分析。由于 miRNA 在眾多程序的調(diào)控，諸如生物發(fā)育、細(xì)胞增殖、凋亡以及與腫瘤發(fā)生相關(guān)等領(lǐng)域發(fā) 揮作用， miRNA 的鑒定和定性研究成為迅速發(fā)展的一大研究領(lǐng)域。最典型的鑒定 miRNAs 的方法是檢測(cè) miRNA 的表達(dá)譜， 如果發(fā)現(xiàn)某一種 miRNA 在某種特定組織或細(xì)胞中特異性 表達(dá)的話， 此 miRNA 將被假定在此特定組織或

8、細(xì)胞中發(fā)揮某種調(diào)控作用。同樣， 如果某一 種 miRNA 在生物特殊發(fā)育階段表達(dá)的話，則它有可能是調(diào)控發(fā)育進(jìn)程一個(gè)主要分子。 miRNA 的表達(dá)譜可以通過(guò)克隆特定組織、細(xì)胞或者某個(gè)生物體特定發(fā)育階段的 miRNA 并 測(cè)序完成， 或者通過(guò)芯片檢測(cè)得以完成。 克隆和測(cè)序 miRNA 是目前最常用的一種方法， 雖 然相當(dāng)費(fèi)時(shí)費(fèi)力，但卻可以發(fā)現(xiàn)新的miRNA ；而芯片檢測(cè)雖然是一種高通量的檢測(cè)方法， 但只能檢測(cè)已知的 miRNAs 表達(dá)水平。 隨著成百上千的 miRNA 被鑒定出來(lái)，通過(guò)抑制細(xì)胞中 mRNA 的表達(dá)水平來(lái)研究 miRNA 的功能迅速發(fā)展為一個(gè)重要的研究領(lǐng)域。在此期間， miRNA 在

9、生理狀態(tài)下的靶標(biāo) 須待鑒定， 因此在探索 miRNA 功能的過(guò)程中運(yùn)用人工合成的 miRNA 抑制劑成為一種重要 的研究工具。 miRNA 的活性可以通過(guò)對(duì)與內(nèi)源性 miRNA 互補(bǔ)的磷酰二胺嗎啉代反義寡核 苷酸( morpholino phosphorodiamidate anti-sense oligonucleotides )的化學(xué)修飾阻斷。另 外，反義阻斷的核苷酸( locked-nucleic acid, LNA )具有更高的結(jié)合親和力，通常被用來(lái)抑 制人體細(xì)胞的 miRNA 。 LNA 修飾的探針也用來(lái)檢測(cè) miRNAs 的定位和表達(dá)方式。 二、 MicroRNA 芯片技術(shù)簡(jiǎn)述 1

10、. 樣品 RNA 抽提 a. 實(shí)驗(yàn)對(duì)象為組織樣品，取適量(50-100mg)新鮮組織樣品或正確保存的 組織樣品，冰凍粉碎組織，加1ml的RNA抽提試劑Trizol,勻漿后抽提RNA。 b. 實(shí)驗(yàn)對(duì)象為細(xì)胞樣品，每份樣品取 1X1071X108細(xì)胞，加1ml的RNA 抽提試劑Trizol，樣品為貼壁細(xì)胞，每10cm2培養(yǎng)皿Trizol使用量為1ml，裂解 后抽提 RNA。 2. RNA 質(zhì)量檢測(cè) a.測(cè)定RNA在分光光度計(jì)260nm、280nm和230nm的吸收值，以計(jì)算濃 度并評(píng)估純度。 b. 用甲醛電泳試劑進(jìn)行變性瓊脂糖凝膠電泳，檢測(cè) RNA 純度及完整性。 c.提供RNA QC報(bào)告。 注意：用于芯片檢測(cè)的RNA樣品，必須是高質(zhì)量的，完整的，沒(méi)有 RNase 污染（降解的樣品不能用于標(biāo)記和芯片檢測(cè)），沒(méi)有基因組污染。 3. 制備熒光標(biāo)記探針 熒光基團(tuán)標(biāo)記miRNA