抗生素的生物效價(jià)測(cè)定法(管碟法

1、抗生素的生物效價(jià)測(cè)定法測(cè)定抗生素效價(jià)的方法比較多，一般可以分為物理學(xué)方法、化學(xué)方法、生物學(xué)方法、和兩種方法配合等四大類(lèi)，可根據(jù)具體情況選擇使用。生物學(xué)方法以抗生素的殺菌力作為衡量效價(jià)的標(biāo)準(zhǔn)，其原理恰好和臨床應(yīng)用于的要求一致這是它的優(yōu)點(diǎn)；又其靈敏度較高，需用檢品的量較小，也是其它方法所不及的?？股氐纳镄r(jià)測(cè)定法，常用的有稀釋法、比濁法和擴(kuò)散法（或稱(chēng)滲透法）。稀釋法 這一方法是用培養(yǎng)基將檢品抗生素稀釋到各種濃度，并依次分裝到一系列的容器內(nèi)，再加入等量“試驗(yàn)菌種”菌種菌液，并放在37 保溫箱內(nèi)培養(yǎng)一定時(shí)間，觀察何種稀釋度適能抑制細(xì)菌的生長(zhǎng)，該稀釋度即為測(cè)定終點(diǎn)（或以細(xì)菌生長(zhǎng)所引起的PH改變及溶血

2、現(xiàn)象等生化反應(yīng)作為測(cè)定終點(diǎn)），再與同樣處理的標(biāo)準(zhǔn)抗生素的終點(diǎn)作比較，即可求得檢品的效價(jià)。這種方法可以使用液體培養(yǎng)基，也可以使用固體培養(yǎng)基。所用的材料及培養(yǎng)基都必須嚴(yán)格無(wú)菌，并要注意無(wú)菌操作。由于測(cè)定終點(diǎn)是以有無(wú)細(xì)菌生長(zhǎng)來(lái)判斷的，因此所得結(jié)果公是一個(gè)范圍。比濁法 原理及操作大致與稀釋法相同。比濁法也是將不同量的檢品及標(biāo)準(zhǔn)品分別加入培養(yǎng)基中，觀察其對(duì)“試驗(yàn)菌種”的效應(yīng)即細(xì)菌生長(zhǎng)所引起的混濁。這一方法和稀釋法的區(qū)別有二：a.比濁法的稀釋間隔的密度比較近，準(zhǔn)確度高一些；b.比濁法不以細(xì)菌有無(wú)生長(zhǎng)的區(qū)分為終點(diǎn)，而是將標(biāo)準(zhǔn)品濃度和細(xì)菌生長(zhǎng)所引起的混濁度求得一定的比例，再由檢品的細(xì)菌生長(zhǎng)混濁度推算檢品的效價(jià)

3、。這一方法易受雜質(zhì)的影響，并且不適用于有色或混濁的檢品。擴(kuò)散法 使用固體培養(yǎng)基，在培養(yǎng)基凝固以前將“試驗(yàn)菌種”混合進(jìn)去，在這樣備妥的培養(yǎng)表面，可以用種種設(shè)計(jì)使檢品液或含有抗生素的物質(zhì)與有菌種的培養(yǎng)基接觸。經(jīng)過(guò)培育后，由于抗生素向培養(yǎng)基中擴(kuò)散，凡抑菌濃度所能達(dá)到之下細(xì)菌不能生長(zhǎng)因而形成透明的抑菌范圍，此種范圍一般都呈圓形，稱(chēng)為“抑菌圈”。擴(kuò)散法有幾種，或中一種叫管碟擴(kuò)散法（筒稱(chēng)管碟法）為國(guó)際上常用的方法，在我國(guó)也作為法定的抗生素檢定法。下面我們將詳細(xì)地討論管碟法的原理和實(shí)驗(yàn)方法。一、 管碟法測(cè)定的設(shè)計(jì)原理及計(jì)算方法管碟法所用的管子系用瓷、鋁或玻璃制成，較好的用不銹鋼制成，它是內(nèi)徑為6+0.1毫米

4、、外徑為8+0.1毫米、高10+0.1毫米的圓筒形管子，管子的重量盡可能相等。攤布固體培養(yǎng)基的容器可用雙碟，亦可用平底下班盤(pán)。管子放在混有菌種的固體培養(yǎng)基上時(shí)，可用人工放置，也可用特定的管子放置器放置。操作步驟，一般是將固體培養(yǎng)基放在水浴上融化，倒在雙碟上，待其凝固，然后在上面再倒一層混有菌種融化培養(yǎng)基。待菌層培養(yǎng)基凝固后，在表面上放置管子，向管子中加滿(mǎn)抗生素的稀釋液，在37培養(yǎng)1618小時(shí)，然后量取抑菌圈并進(jìn)行計(jì)算。（一） 抑菌圈的形式 小管中的抗生素向培養(yǎng)基中擴(kuò)散（呈球面擴(kuò)散），在此同時(shí)試驗(yàn)菌也開(kāi)始生長(zhǎng)?？股貪舛雀哂谝志鷿舛戎幵囼?yàn)菌不長(zhǎng)，因此出現(xiàn)抑菌圈，其圈之邊緣處恰好為抗生素的最低抑

5、菌濃度。抑菌圈的半徑（r）與下列因素有關(guān)：(1)抗生素在管中的量（M）；（2）抗生素的擴(kuò)散系數(shù)（D）；（3）細(xì)菌生長(zhǎng)達(dá)到肉眼可見(jiàn)的時(shí)間（T）；（4）培養(yǎng)基的厚度（H）。其中的定量關(guān)系可用分子擴(kuò)散定律來(lái)推導(dǎo)，得到如下所示的公式：logM= (1/9.21DT)r2 + log(CTH) （11-1）式中 D 擴(kuò)散系數(shù)，毫米2/小時(shí)；T 抗生素?cái)U(kuò)散時(shí)間（接近細(xì)菌生長(zhǎng)到肉眼可見(jiàn)的時(shí)間），小時(shí)；M 在管中抗生素總量，單位；r 管中心到抑菌圈邊緣的距離，毫米；L 管的高度，毫米；H 培養(yǎng)基的厚度，毫米；C 最低抑菌濃度，單位/毫米。由于此公式相當(dāng)于直線方程式（y=ax+b），（logM相當(dāng)于y,1/9.

6、21DT相當(dāng)于斜率a,log(C4DTH)相當(dāng)于截矩b），因此設(shè)logM為縱標(biāo)，r2為橫坐標(biāo)時(shí)可得截矩為log(C4DTH),斜率為1/9.21DT的直線。（二） 測(cè)定設(shè)計(jì)原理與計(jì)算公式 由公式可知logM與r2成直線關(guān)系，即抗生素總量的對(duì)數(shù)值與抑菌圈半徑的平方值成直線關(guān)系，因此抗生素的量可從抑菌圈大小來(lái)推算。這就是說(shuō)，抗生素總量的多少受最低抑菌濃度(C)、培養(yǎng)基厚度(H)、擴(kuò)散系數(shù)(D)、和細(xì)菌生長(zhǎng)時(shí)間(T)的影響，例如培養(yǎng)基厚度減少到H/2時(shí)則抑菌圈增大，可計(jì)算如下：培養(yǎng)基厚度為H時(shí) logM= (1/9.21DT)r2 + log(C4DTH) 培養(yǎng)基厚度為H/2時(shí) logM= (1/9

7、.21DT)r2 + log(C4DTH/2) 兩式相減，化簡(jiǎn)可得： r12=9.21DTlog2+r2 由于(9.21DT)為斜率的倒數(shù)、r2為原抑菌圈半徑的平方值，均為已知，則增大的圈（r1）即可算出。同理，若知細(xì)菌最低抑菌一半時(shí)，則抑菌圈的半徑（r2）也將增大： r22=(9.21DT)log2+r2從上可知，抗生素總量的對(duì)數(shù)值與抑菌圈的平方成直線關(guān)系，因此可作定量測(cè)定。但由于抑菌圈的大小還受C、H、D、T的影響，所以應(yīng)消除這些影響才能準(zhǔn)確測(cè)定。要消除這些影響，可用標(biāo)準(zhǔn)品同時(shí)對(duì)照測(cè)定（即所謂相對(duì)效價(jià)設(shè)計(jì)法），計(jì)算方法如下。設(shè)：標(biāo)準(zhǔn)品的高單位抑菌圈為SH 標(biāo)準(zhǔn)品的低單位抑菌圈為SL 樣品高

8、單位的抑菌圈為UH 樣品低單位的抑菌圈為UL則小管聽(tīng)標(biāo)準(zhǔn)品總量（M）與樣品總量（M）分別為：因log(C4DTH)為截距，在同一雙碟上其數(shù)值是相等的，因此兩者相減，它就被消去了。因（1/9.21DT）為直線的斜率，所以樣品與標(biāo)準(zhǔn)品的效價(jià)比即等于斜率乘樣品的抑菌圈的平方值與標(biāo)準(zhǔn)品抑菌圈平方值之差數(shù)。此即管碟法的標(biāo)準(zhǔn)曲線法的基礎(chǔ)，如要消除斜率（1/9.21DT）的影響，可用二劑量法，即標(biāo)準(zhǔn)品用二劑量（SH及SL）,樣品也用二劑 量（UH及UL）代入公式并計(jì)算之，即可消除斜率的影響。計(jì)算方法如下：在這個(gè)分式中無(wú)斜率因素，即在樣品與標(biāo)推品對(duì)比測(cè)定時(shí)斜率可被消除。此即為管碟法的二劑量法的計(jì)算公式（應(yīng)用詳

9、見(jiàn)二劑量法）。由于(UH)2、(SH)2、(UT)2、(ST)2計(jì)算太麻煩，經(jīng)實(shí)驗(yàn)證明也可近似地用（UH）、（SH）、（UT）、（ST）來(lái)代替。（三） 圖解法計(jì)算原理及作計(jì)算圖的方法管碟測(cè)定時(shí)常用圖解法來(lái)計(jì)算結(jié)果。用圖解法計(jì)算結(jié)果就是把公式用圖來(lái)表示，其原理如下：即當(dāng)V=ob、W=ab及l(fā)ogK=cd時(shí)，則（即od線段表示效對(duì)數(shù)值）.在方格紙上在W坐標(biāo)上取logK100值（例如logK為log2時(shí)，其值為0.301100），平行于V坐標(biāo)劃一平行線。然后在此線段上取0.0043100介于，此點(diǎn)b值即為效價(jià)101%值。因log(101%)為0.0043，為了便于劃線，故乘100。同理C點(diǎn)為效價(jià)10

10、2%值，d點(diǎn)為99%值，依此類(lèi)推。為了便于觀察，也可延長(zhǎng)ob或oc或od線段把效價(jià)值表示在圖的上方。如此可作成一放射圖形。當(dāng)logK=log4時(shí)，同理可在W坐標(biāo)上取log4100值，然后平行于V劃平行線，取0.0043100點(diǎn)，即為效價(jià)101%值，取0.0086100點(diǎn)，即為102%，依此類(lèi)推，也同樣可能表示在圖表的上方，成放射圖形（圖11-3）.當(dāng)K=4時(shí)，二劑量效價(jià)計(jì)算放射圖見(jiàn)(11-4).二、 管碟法的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方法根據(jù)上述原理，可知效價(jià)的對(duì)數(shù)值與抑菌圈關(guān)徑的平方值（抑菌圈直徑）成直線關(guān)系，其直級(jí)方程式為logy=ax+b.當(dāng)與標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)照測(cè)定時(shí)，b可消除成為log=a(x-x),也即效價(jià)的

11、對(duì)數(shù)值等于斜率乘樣品與標(biāo)準(zhǔn)品的抑菌圈差數(shù)，可以此作為標(biāo)準(zhǔn)曲線法測(cè)定效價(jià)。當(dāng)樣品與標(biāo)準(zhǔn)品各用二劑量對(duì)比測(cè)定時(shí)，則斜率因數(shù)也可以消除，成為log=V/WlogK而求得效價(jià)比值（）。現(xiàn)將此兩種方法分述于下。（一） 標(biāo)準(zhǔn)曲線法材料 雙碟直徑為90毫米；不銹鋼小管外徑為8+0、1毫米，內(nèi)徑為6+0、1毫米，高為10+0.1毫米。鋼管重量差異不得相差+0.05克。培養(yǎng)基 各種抗生素測(cè)定效價(jià)所用的培養(yǎng)基不完全相同，中國(guó)藥典中均有規(guī)定。菌種 各種抗生素測(cè)定效價(jià)所用的菌種也不完全相同，中國(guó)藥典中均有規(guī)定。標(biāo)準(zhǔn)品 由藥品生物制品檢定所統(tǒng)一分發(fā)。每一種抗生素標(biāo)準(zhǔn)品的單位也由該所規(guī)定一般都以容易精制達(dá)到高純度的衍生物

12、作為標(biāo)準(zhǔn)品。例如青霉素以青霉素G鈉鹽作為標(biāo)準(zhǔn)品；鏈霉素以鏈霉素鹽酸鹽的氯化鈣復(fù)鹽作為標(biāo)準(zhǔn)品；卡那霉素以含一分子結(jié)晶水的一硫酸卡那霉素作為標(biāo)準(zhǔn)品等。當(dāng)然如抗生素本身能達(dá)到較高純度，就即可以作為標(biāo)準(zhǔn)品，如制霉菌素等。 方法 在雙碟上量入加熱融化的底層培養(yǎng)基21毫升，并在碟底平均攤布，放置使其凝固 ，即為底層。另取上層培養(yǎng)基加熱融化后，冷到50加入適量菌液，搖勻后，于每碟中各加4毫升，使在底層上平均攤布，即為菌層。冷卻后，適當(dāng)安置小管六枚，用陶瓦蓋覆蓋備用。標(biāo)準(zhǔn)曲線的制法 用緩沖液（各種抗生素所用緩沖液不完全相同）將標(biāo)準(zhǔn)品稀釋為多種濃度，在備妥之雙碟上各放適度間隔六枚小管，三枚裝中心點(diǎn)濃度之標(biāo)準(zhǔn)液，

13、另三枚空間管，使裝液管與空間管互相間隔，以三碟為一組，在三個(gè)雙碟的九個(gè)空間管中各裝入一種濃度的標(biāo)準(zhǔn)液，其它濃度的標(biāo)準(zhǔn)液也如此裝入。培養(yǎng)后量取抑菌圈之直徑，求取每組三碟的中心點(diǎn)濃度的抑菌圈直徑平均值、各組抑菌圈直徑的平均值和所有中心點(diǎn)濃度的抑菌圈直徑的平均值。依下法求得各種濃度之坐標(biāo)，試以某一濃度的坐標(biāo)為例：設(shè)中心點(diǎn)濃度的所有直徑平均值為20毫米，而某一組碟中心點(diǎn)濃度的九個(gè)抑菌圈直徑平均為19.8毫米，則20-19.8=0.2，即為“更正數(shù)”；若某一濃度之九個(gè)直徑平均為19.0毫米，則19.0+0.2=19.2毫米作為某一濃度之坐標(biāo)值。依同法求得各種濃度之?dāng)?shù)值后，取雙周半對(duì)數(shù)圖紙，以濃度為縱坐標(biāo)

14、，將各點(diǎn)貫串即成標(biāo)準(zhǔn)曲線，在應(yīng)用時(shí)取直線范圍內(nèi)的各點(diǎn)。樣品效價(jià)的求法 先估計(jì)效價(jià)。按估計(jì)效價(jià)用緩沖液稀釋到與標(biāo)準(zhǔn)液的中心點(diǎn)相同的濃度。在備妥已放六枚小管之雙碟上裝滿(mǎn)其中三管，另三管裝滿(mǎn)中心點(diǎn)濃度的標(biāo)準(zhǔn)液，令樣品與標(biāo)準(zhǔn)液互相間隔。共用三碟。裝妥后全部放入培養(yǎng)，然后量取抑菌圈直徑，求9個(gè)標(biāo)準(zhǔn)液抑菌圈直徑的平均值及9個(gè)樣品液抑菌圈的平均值。同樣找出“更正數(shù)”，將樣品抑菌圈直徑的平均值進(jìn)行校正，即自標(biāo)準(zhǔn)曲線讀取樣品的單位。為了精確起見(jiàn)，也可用公式計(jì)算。設(shè)樣品的直線關(guān)系為logy=ax+b;標(biāo)準(zhǔn)品的直線關(guān)系為logy=ax+b,則兩式相減即得： log(y/y)=a(x-x)即log效價(jià)=（斜率）（樣品

15、抑菌圈直徑標(biāo)準(zhǔn)品抑菌圈直徑）在上式中，只要斜率已知，則log效價(jià)即可求出。斜率可從標(biāo)準(zhǔn)曲線上直接用量角儀量出直線的傾角，其正切即為斜率。（二） 二劑量法（即四點(diǎn)法）材料 培養(yǎng)基、菌種、標(biāo)準(zhǔn)品及雙碟制備同標(biāo)準(zhǔn)曲線法。方法 取備妥的雙碟四點(diǎn)，各于碟底用蠟筆作SH、SL、UH及UL四個(gè)標(biāo)志。將標(biāo)準(zhǔn)液稀釋為每毫升含某一濃度（此濃度應(yīng)取在標(biāo)準(zhǔn)曲線的直線范圍內(nèi)），及為濃度1/3或1/4的濃度（均應(yīng)取在標(biāo)準(zhǔn)曲線的直線范圍內(nèi)）。于碟內(nèi)SH管量入高單位標(biāo)準(zhǔn)液，于碟內(nèi)SL管量入低單位標(biāo)準(zhǔn)液。在UH管內(nèi)量入高單位的樣品液，在UL管內(nèi)量入低單位的樣品液。經(jīng)培養(yǎng)后量取抑菌圈直徑。樣品效價(jià)的計(jì)算，可用前述的放線圖或用前述

16、的式（26-14）求得值，然后按下式計(jì)算即得。 樣品效價(jià)=估計(jì)效價(jià)三、 管碟法精確測(cè)定抗生素效價(jià)的基本條件抗生素效價(jià)測(cè)定的及方法已見(jiàn)上述。如要精確測(cè)定抗生素的效價(jià)，必須具備下列幾項(xiàng)條件。（1） 抑菌圈要圓而邊緣清晰；（2） 抗生素抑菌圈直徑的直線關(guān)系范圍應(yīng)寬；（3） 標(biāo)準(zhǔn)品所作的直線應(yīng)互相平行；（4） 直線的斜率應(yīng)?。╨og效價(jià)坐標(biāo)，抑菌圈直徑為橫坐標(biāo)時(shí)），直線的截距應(yīng)小達(dá)到上述幾點(diǎn)要求，就能精確測(cè)定抗生素的效價(jià)，這也是建立一個(gè)良好的測(cè)定方法必須具備的基本條件。怎樣才能達(dá)到這些基本要求呢？現(xiàn)逐點(diǎn)討論于下。（一）抑菌圈圓與清晰的條件 抑菌圈常有破裂現(xiàn)象，有時(shí)甚至無(wú)圈，或有圈而不圓，或呈饅頭形、雞

17、蛋形等，其原因有幾種：1.在加小管時(shí)抗生素濺出，或小管底不平漏出，或工作服上有抗生素粉末飛入，以及雙碟未洗去殘余的抗生素、或小管污染抗生素時(shí)，均會(huì)發(fā)生圈破裂及奇形怪狀的現(xiàn)象；抗生素測(cè)定時(shí)抗生素是最主要的東西，查也是最應(yīng)防止污染的東西，務(wù)必建立“無(wú)抗生素操作”的觀念，當(dāng)培養(yǎng)基污染抗生素時(shí)，甚至可能全部無(wú)抑菌圈現(xiàn)象；2.菌種太老，或污染雜菌，或在倒上層培養(yǎng)基時(shí)溫度太高，或溫度正常而放置時(shí)間太久等等，也均可使抑菌圈破裂或有的好有的壞，甚至有完全無(wú)圈等現(xiàn)象產(chǎn)生；特別是以霉菌及細(xì)菌作試驗(yàn)菌時(shí)，很容易因上層培養(yǎng)基溫度過(guò)高而燙死，以致造成抑菌圈破裂或無(wú)圈現(xiàn)象；3.當(dāng)雙碟上的小管彼此間隔太小而抑菌圈較大時(shí)，則

18、圈與圈之間彼此影響，形成饅頭形抑菌圈，如圖11-5所示，由于在a處有低于抑菌濃度之抗生素，當(dāng)二個(gè)抑菌圈太近時(shí)，則低于抑菌濃度的抗生素濃度加大，使該處之圈放大而呈為饅頭形；有時(shí)二個(gè)抑菌圈并不太近，也會(huì)發(fā)生這種現(xiàn)象，例如四環(huán)類(lèi)抗生素，當(dāng)PH過(guò)低或過(guò)高時(shí)，圈外的抗生素較多，因此彼此影響較大，也呈饅頭形；4.當(dāng)抗生素中含鹽濃度太高或PH太低時(shí)，有的抗生素如新霉素A、鏈霉素等就無(wú)抑菌圈，或抑菌圈呈雞蛋形，如圖11-6中a處的鹽較濃或PH較低，故呈雞蛋形；5.有時(shí)因雙碟接近溫箱底部溫度較高，細(xì)菌生長(zhǎng)較快，也會(huì)使溫度較高處的抑菌圈變小而不圓；6.有時(shí)因培養(yǎng)基厚薄不勻，也會(huì)影響抑菌圈不呈圓形。 抑菌圈的邊緣應(yīng)

19、清晰，不然會(huì)影響結(jié)果。但有時(shí)抑菌圈不清晰，原因很多，概括起來(lái)可以認(rèn)為是抑菌圈形成時(shí)的動(dòng)力學(xué)現(xiàn)象不均一引起的。例如當(dāng)菌種中有二種最低抑菌濃度不同的菌種時(shí)，則形成了雙圈。較耐藥的菌種抑菌圈較小，敏感的菌種抑菌圈較大，并使抑菌圈邊緣形成不清晰的鋸齒形，其范圍的大小可由前述的動(dòng)力學(xué)公式推算求得。 設(shè)一種菌株的最低抑菌濃度為C，另一種菌株的最低抑菌濃度為C，則代入動(dòng)力學(xué)公式中成為： r2/9.21DT=logM-logM(C4DTH) (11-15) r2/9.21DT=logM-logM(C4DTH) (11-16） 由此即能求出二種菌所形成的抑菌圈不清晰地帶的寬度為921DT(logc-logc)。

20、此式中9.21DT為斜率的倒數(shù)，為已知數(shù)。 又如培養(yǎng)基中含有雜質(zhì)，會(huì)影響擴(kuò)散，其擴(kuò)散系數(shù)不只一個(gè)而是二個(gè)或二個(gè)以上，則同理可計(jì)算出抑菌圈不清晰地帶為921DT(logDlogD)。 又如抗生素有二種組分，含量較多的組分具有抑菌作用(無(wú)殺菌作用)，含量少的具有殺菌作用，則能形成二圈，外圈模糊，呈模糊邊緣。這種模糊邊緣的寬度也可以同理算出為9.21DT(logMlogM)。 抗生素抑菌圈邊緣不清晰與抗生素種類(lèi)有關(guān)。有的抗生素如竹桃霉素，對(duì)不少試驗(yàn)菌主要為抑菌作用(不是殺菌作用)，其抑菌圈邊緣因殺菌作用弱抑菌作用強(qiáng)而不清晰，也即最低抑菌濃度(C)不均一，其中以抑菌作用為主，殺菌作用為次，同理可以動(dòng)力

21、學(xué)公式計(jì)算其不清晰邊緣的寬度。 由抑菌圈邊緣不清晰的原因，即可找出使抑菌圈清晰的辦法。為了避免有二種最低抑菌濃度的菌種，則可用分離單菌落的方法純化菌種，使其成為只有一種最低抑菌濃度的菌種。為了避免培養(yǎng)基不均一，特別是瓊脂的不均一，則應(yīng)把瓊脂適當(dāng)純化(如多洗幾次，或換批號(hào)或換產(chǎn)地)。為了避免抗生素的抑菌作用大于殺菌作用，則可更換試驗(yàn)菌，因?yàn)槟骋豢股貙?duì)某一試驗(yàn)菌有較高的殺菌作用。例如竹桃霉素對(duì)臘狀芽孢桿菌或蕈狀桿菌有較高的殺菌作用，抑菌圈就非常清晰。抗生素的殺菌作用與抑菌作用也可因培養(yǎng)基的成分不同而異，例如氯霉素，當(dāng)培養(yǎng)基中含有維生素B族時(shí)，則殺菌作用較強(qiáng)，抑菌圈就較清晰?？傊?，抑菌圈不清晰的問(wèn)

22、題可通過(guò)純化菌種、改進(jìn)培養(yǎng)基、更換菌種、改變稀釋抗生素用的緩沖液pH及濃度來(lái)解決。 (二)抗生素濃度與抑菌圈的直線關(guān)系 抗生素濃度的對(duì)數(shù)值與抑菌圈半徑的平方值之間的關(guān)系是直線關(guān)系。如果為了計(jì)算方便起見(jiàn)以抑菌圈直徑來(lái)計(jì)算，這樣直線關(guān)系的范圍就較窄，但不妨礙一般成品的測(cè)定。若樣品的效價(jià)很難估計(jì)，則仍以抑菌圈半徑的平方值來(lái)計(jì)算較為合適，因這樣做直線范圍較寬。直線范圍有時(shí)較窄，其原因是抗生素受到破壞或者被菌種或培養(yǎng)基所吸附，應(yīng)考慮去除這種影響因素，使直線范圍增長(zhǎng)。 (三)標(biāo)準(zhǔn)品與樣品所作的直線平行問(wèn)題 標(biāo)準(zhǔn)品與樣品所作的直線應(yīng)互相平行，計(jì)算公式是在假定兩者平行而斜率相等的前提下推算出來(lái)的，若斜率不相等

23、就不能這樣計(jì)算。所以實(shí)驗(yàn)得出的直線應(yīng)互相平行才能得到精確的數(shù)據(jù)。 直線不平行除操作誤差外，主要是標(biāo)準(zhǔn)品的質(zhì)不相同而造成的。若標(biāo)準(zhǔn)品中有生物活性的物質(zhì)或影響生物活性的物質(zhì)與樣品中所含者不同時(shí)，直線就不平行。若用來(lái)稀釋標(biāo)準(zhǔn)品的緩沖液(如pH、濃度)與樣品不同時(shí)，直線也不平行。所以要直線平行，就要考慮這些因素，并盡可能品質(zhì)一致、條件一致。若樣品中含有維生素C，則在標(biāo)準(zhǔn)晶中也應(yīng)加入等量的維生素C。若樣品(如四環(huán)素等)稀釋液放置過(guò)程中能轉(zhuǎn)化成差向異構(gòu)體(只有原抗生素5活性)，則標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液的放置時(shí)間也應(yīng)相同，如此等等。 (四)直線的斜率與截距問(wèn)題 標(biāo)準(zhǔn)直線的斜率當(dāng)log效價(jià)為縱座標(biāo)、抑菌圈直徑為橫座標(biāo)時(shí)

24、，斜率愈小愈好。因?yàn)樾甭视?，則效價(jià)差別很小時(shí)抑菌圈大小的差別卻很大，這樣測(cè)定結(jié)果就較為精確。 斜率減小的條件可從動(dòng)力學(xué)公式中斜率為1/9.21DT來(lái)推論；若擴(kuò)散快，即擴(kuò)散系數(shù)D值大，則斜率小，若細(xì)菌生長(zhǎng)時(shí)間T值大，則斜率小。即斜率大小主要是D、T這二個(gè)因素決定的，加大D值或增長(zhǎng)T值，斜率就可減小。 D值與抗生素的分子大小，及培養(yǎng)基或菌種是否吸附抗生素有關(guān)?？股胤肿拥拇笮〔荒芨淖儯挥性谖缴隙嗉涌紤]。吸附與培養(yǎng)基及稀釋用的緩沖液的pH及鹽濃度很有關(guān)系。改變緩沖液的pH及鹽濃度，?？山鉀Q擴(kuò)散太慢的問(wèn)題。如加吐溫80等擴(kuò)散劑，則可使有些多肽類(lèi)抗生素的擴(kuò)散速度增快。 有的菌種生長(zhǎng)慢，有的菌種(如

25、臘狀芽孢桿菌)生長(zhǎng)雖快，但當(dāng)培養(yǎng)基的pH調(diào)到4.5時(shí)也生長(zhǎng)緩慢，直線斜率就小。增加T值的方法較易，培養(yǎng)基的營(yíng)養(yǎng)差、培養(yǎng)溫度低等，均可使T值增加。但T值太大，得出結(jié)果太慢，抑菌圈的清晰度也受到影響?？焖俜〞r(shí)間很短，但斜率很大，精密度較差，這一對(duì)矛盾要正確處理解決。 直線的截距應(yīng)小，因?yàn)橥瑯訚舛鹊目股仄浣鼐嘈〉乃@示的抑菌圈大。截距的大小決定于動(dòng)力學(xué)公式中l(wèi)og(C4DTH)的數(shù)值。如培養(yǎng)基厚度減小一半時(shí)，截距就減小，抑菌圈就增大，計(jì)算方法見(jiàn)式(263)。即培養(yǎng)基厚度減小一半時(shí)，增大的抑菌圈半徑的平方值為原抑菌圈半徑的平方值加上斜率的倒數(shù)乘log2的值。 截距小，抑菌圈增大，利用這一原理設(shè)計(jì)的薄

26、層法，可測(cè)定微量的抗生物質(zhì)。如樹(shù)葉中微量鏈霉素的測(cè)定，血液中微量抗生素的測(cè)定等。由于微量抗生素顯示很大的抑菌圈，樣品可高度稀釋?zhuān)@樣，雜質(zhì)的影響就大大減小。若該雜質(zhì)在高度稀釋后仍有抗菌性能，則此雜質(zhì)也為抗生物質(zhì)。 四、管碟法實(shí)驗(yàn)操作時(shí)應(yīng)注意的事項(xiàng) 影響抗生素管碟測(cè)定的因素很多，例如影響菌生長(zhǎng)時(shí)間(T)的因素有營(yíng)養(yǎng)、pH、菌液數(shù)量、菌種性質(zhì)等，影響擴(kuò)散系數(shù)(D)的因素有瓊脂品種及純度、培養(yǎng)基成分、無(wú)機(jī)鹽的量、細(xì)菌吸附情況、pH；溫度及菌量，以及菌層的厚薄和菌層中含糖量(糖在培養(yǎng)時(shí)會(huì)產(chǎn)酸)、抗生素分子的大小等，影響最低抑菌濃度(C)的有菌的濃度、營(yíng)養(yǎng)、溫度，pH、菌種種類(lèi)及類(lèi)型(如粗糙型；光滑型)、菌種性能(如耐藥株、敏感株