DNA粗提取與鑒定實(shí)驗(yàn)

1、DNADNA粗提取與鑒定實(shí)驗(yàn)粗提取與鑒定實(shí)驗(yàn) 1 內(nèi)容內(nèi)容 課題分析課題分析1 實(shí)驗(yàn)操作原理實(shí)驗(yàn)操作原理5 材料器具材料器具3 實(shí)驗(yàn)理論基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)理論基礎(chǔ)4 教學(xué)建議教學(xué)建議 2 實(shí)驗(yàn)步驟實(shí)驗(yàn)步驟 6 一、課題分析一、課題分析 n1 1. .教學(xué)教學(xué)目標(biāo)目標(biāo) （1 1）分析）分析DNADNA的性質(zhì)及提取的基本思路。的性質(zhì)及提取的基本思路。 （2 2）探究不同手段提?。┨骄坎煌侄翁崛NADNA的實(shí)驗(yàn)過程。的實(shí)驗(yàn)過程。 （3 3）掌握）掌握DNADNA提取的過程并靈活運(yùn)用。提取的過程并靈活運(yùn)用。 n2 2. .背景描述背景描述 生物體的性狀之所以能夠遺傳給后代，是由于其體內(nèi)具有生物體的性狀之所以

2、能夠遺傳給后代，是由于其體內(nèi)具有DNADNA或或RNARNA 這些遺傳物質(zhì)，這些遺傳物質(zhì)，DNADNA是遺傳物質(zhì)已經(jīng)通過實(shí)驗(yàn)證實(shí)是遺傳物質(zhì)已經(jīng)通過實(shí)驗(yàn)證實(shí)。 那么那么DNADNA究竟什么樣究竟什么樣？ 本本課題通過嘗試對植物或動(dòng)物組織中的課題通過嘗試對植物或動(dòng)物組織中的DNADNA進(jìn)行粗提取，了解進(jìn)行粗提取，了解DNADNA的的 理化性質(zhì)，理解理化性質(zhì)，理解DNADNA提取以及鑒定的原理，在一定層面感性認(rèn)知提取以及鑒定的原理，在一定層面感性認(rèn)知DNADNA。 一、課題分析一、課題分析 脫氧核苷酸脫氧核苷酸 腺嘌呤腺嘌呤 一、課題分析一、課題分析 dAMPdAMP dTMPdTMP dCMPdC

3、MPdGMPdGMP 胸腺嘧啶胸腺嘧啶 腺嘌呤腺嘌呤鳥鳥嘌呤嘌呤 5 核苷酸結(jié)構(gòu)核苷酸結(jié)構(gòu) 6 一、課題分析一、課題分析 n 脫氧核糖（五碳糖）與磷酸分子借由酯鍵相連，組成其長鏈骨架，脫氧核糖（五碳糖）與磷酸分子借由酯鍵相連，組成其長鏈骨架， 排列在外側(cè)，四種堿基排列在內(nèi)側(cè)。每個(gè)糖分子都與四種堿基里的排列在外側(cè)，四種堿基排列在內(nèi)側(cè)。每個(gè)糖分子都與四種堿基里的 其中一種相連，這些堿基沿著其中一種相連，這些堿基沿著DNADNA長鏈所排列而成的序列，可組成長鏈所排列而成的序列，可組成 遺傳密碼遺傳密碼，指導(dǎo)蛋白質(zhì)的合成。，指導(dǎo)蛋白質(zhì)的合成。 7 一、課題分析一、課題分析 n 讀取讀取密碼的過程稱為密

4、碼的過程稱為轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)錄。 n 是是以以DNADNA雙鏈中的一條單鏈為模雙鏈中的一條單鏈為模 板轉(zhuǎn)錄出一段稱為板轉(zhuǎn)錄出一段稱為mRNAmRNA（信使信使 RNARNA）的核酸分子）的核酸分子。 n 多數(shù)多數(shù)RNARNA帶有合成蛋白質(zhì)的訊息，帶有合成蛋白質(zhì)的訊息， 另有一些本身就擁有特殊功能，另有一些本身就擁有特殊功能， 例如例如rRNArRNA、snRNAsnRNA與與siRNAsiRNA。 8 一、課題分析一、課題分析 n 在在細(xì)胞內(nèi)，細(xì)胞內(nèi)，DNADNA能與蛋白質(zhì)結(jié)能與蛋白質(zhì)結(jié) 合形成合形成染色體染色體，整組染色體則，整組染色體則 統(tǒng)稱為統(tǒng)稱為染色體組染色體組。 n 人正常人正常的人體細(xì)胞中含

5、有的人體細(xì)胞中含有4646條條 染色體染色體。 n 染色體在染色體在細(xì)胞分裂細(xì)胞分裂之前會先在之前會先在 分裂間期分裂間期完成復(fù)制，細(xì)胞分裂完成復(fù)制，細(xì)胞分裂 間期又可劃分為：間期又可劃分為：G1G1期期-DNA-DNA合合 成前期、成前期、S S期期-DNA-DNA合成期、合成期、G2-G2- DNADNA合成后期。合成后期。 9 一、課題分析一、課題分析 n DNADNA是高分子聚合物，是高分子聚合物，DNADNA溶液為高分子溶液，具有很高的粘度，溶液為高分子溶液，具有很高的粘度， 可被可被甲基綠甲基綠染成綠色染成綠色。 n DNADNA對紫外線（對紫外線（260nm260nm）有吸收作用

6、，利用這一特性，可以對）有吸收作用，利用這一特性，可以對DNADNA 進(jìn)行含量測定進(jìn)行含量測定。 n 當(dāng)當(dāng)核酸變性時(shí)，吸光度升高，稱為核酸變性時(shí)，吸光度升高，稱為增色效應(yīng)增色效應(yīng)；當(dāng)變性核酸重新；當(dāng)變性核酸重新 復(fù)性時(shí)，吸光度又會恢復(fù)到原來的水平復(fù)性時(shí)，吸光度又會恢復(fù)到原來的水平。 n 較高較高溫度、有機(jī)溶劑、酸堿試劑、尿素、酰胺等都可以引起溫度、有機(jī)溶劑、酸堿試劑、尿素、酰胺等都可以引起DNADNA 分子變性，即分子變性，即DNADNA雙鏈堿基間的氫鍵斷裂，雙螺旋結(jié)構(gòu)解開雙鏈堿基間的氫鍵斷裂，雙螺旋結(jié)構(gòu)解開也也 稱為稱為DNADNA的解螺旋。的解螺旋。 10 洋蔥內(nèi)表皮細(xì)胞洋蔥內(nèi)表皮細(xì)胞 D

7、NA被甲基綠染成綠色，被甲基綠染成綠色，RNA被派洛寧染成紅色被派洛寧染成紅色 11 二、教學(xué)建議二、教學(xué)建議 n 科學(xué)科學(xué)的探究一般過程為的探究一般過程為“發(fā)現(xiàn)問題發(fā)現(xiàn)問題提出假設(shè)提出假設(shè)設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)預(yù)預(yù) 測結(jié)果測結(jié)果得出結(jié)論得出結(jié)論”。 n 通過通過本實(shí)驗(yàn)的設(shè)計(jì)的具體的實(shí)施，是學(xué)員能夠接受科學(xué)的訓(xùn)練，本實(shí)驗(yàn)的設(shè)計(jì)的具體的實(shí)施，是學(xué)員能夠接受科學(xué)的訓(xùn)練， 在訓(xùn)練過程中舉一反三，從理論到實(shí)踐認(rèn)知在訓(xùn)練過程中舉一反三，從理論到實(shí)踐認(rèn)知DNADNA的提取過程和操的提取過程和操 作原理作原理。 n 從從DNADNA的物質(zhì)組成，到的物質(zhì)組成，到DNADNA的復(fù)制時(shí)期，聯(lián)系生物學(xué)現(xiàn)象。在理的復(fù)制時(shí)期

8、，聯(lián)系生物學(xué)現(xiàn)象。在理 解解DNADNA的理化性質(zhì)的基礎(chǔ)上，利用其理化性質(zhì)對的理化性質(zhì)的基礎(chǔ)上，利用其理化性質(zhì)對DNADNA進(jìn)行分離。進(jìn)行分離。 12 三、材料器具三、材料器具 n 材料材料：新鮮：新鮮菠菜菠菜4kg4kg。 n 試劑試劑：氯化鈉：氯化鈉1000g1000g、SDS 500gSDS 500g、無水乙醇、無水乙醇4000ml4000ml、 二二苯胺苯胺200ml200ml。 n 器材器材：200ml200ml燒杯燒杯6060個(gè)、試管個(gè)、試管100100支、研缽支、研缽3030個(gè)、玻璃個(gè)、玻璃 棒棒3030個(gè)、紗布個(gè)、紗布2 2包、不銹鋼藥勺包、不銹鋼藥勺3030個(gè)、濾紙個(gè)、濾紙5

9、 5包。包。 n 儀器儀器：天平：天平2 2臺、水浴鍋臺、水浴鍋2 2個(gè)、漏斗個(gè)、漏斗3030個(gè)。個(gè)。 13 n DNADNA是大分子高分子聚合物，是大分子高分子聚合物，DNADNA溶液為溶液為高分子溶液高分子溶液， 具有很高的粘度。具有很高的粘度。DNADNA對紫外線有吸收作用，當(dāng)核酸對紫外線有吸收作用，當(dāng)核酸 變性時(shí)，吸光值升高；變性時(shí)，吸光值升高； n 當(dāng)變性核酸可復(fù)性時(shí)，吸光值又會恢復(fù)到原來水平。當(dāng)變性核酸可復(fù)性時(shí)，吸光值又會恢復(fù)到原來水平。 溫度、有機(jī)溶劑、酸堿度、尿素、酰胺等試劑都可以溫度、有機(jī)溶劑、酸堿度、尿素、酰胺等試劑都可以 引起引起DNADNA分子分子變性變性，即使得，即使

10、得DNADNA雙鍵間的氫鍵斷裂，雙雙鍵間的氫鍵斷裂，雙 螺旋結(jié)構(gòu)解開。螺旋結(jié)構(gòu)解開。 四、實(shí)驗(yàn)理論基礎(chǔ)四、實(shí)驗(yàn)理論基礎(chǔ) 14 n 1 1、DNADNA對酶、高溫和洗滌劑的耐受對酶、高溫和洗滌劑的耐受性性 蛋白酶蛋白酶能水解蛋白質(zhì)，但是對能水解蛋白質(zhì)，但是對DNADNA沒有影響沒有影響； 大多數(shù)大多數(shù)蛋白質(zhì)不能忍受蛋白質(zhì)不能忍受60608080的高溫，而的高溫，而DNADNA在在8080以上才會以上才會 變性變性； 洗滌劑洗滌劑可以溶解細(xì)胞的細(xì)胞膜，去除脂質(zhì)和蛋白質(zhì)可以溶解細(xì)胞的細(xì)胞膜，去除脂質(zhì)和蛋白質(zhì), ,但對但對DNADNA沒沒 有影響。有影響。 四、實(shí)驗(yàn)理論基礎(chǔ)四、實(shí)驗(yàn)理論基礎(chǔ) 15 n

11、2 2、DNADNA的溶解度的溶解度 DNADNA和蛋白質(zhì)等其他成分在不同和蛋白質(zhì)等其他成分在不同 濃度的濃度的NaClNaCl溶液溶液中溶解度不同，中溶解度不同， 利用這一特點(diǎn)，選擇適當(dāng)?shù)柠}利用這一特點(diǎn)，選擇適當(dāng)?shù)柠} 濃度就能使?jié)舛染湍苁笵NADNA充分溶解，而使充分溶解，而使 雜質(zhì)沉淀，或者相反。雜質(zhì)沉淀，或者相反。 四、實(shí)驗(yàn)理論基礎(chǔ)四、實(shí)驗(yàn)理論基礎(chǔ) n 3 3、DNADNA在酒精溶液中的溶解性在酒精溶液中的溶解性 DNADNA不溶于酒精溶液，但是細(xì)胞中的某些物質(zhì)則可以溶于酒精。不溶于酒精溶液，但是細(xì)胞中的某些物質(zhì)則可以溶于酒精。 利用這一原理，可以將利用這一原理，可以將DNADNA與蛋白

12、質(zhì)進(jìn)一步分離。與蛋白質(zhì)進(jìn)一步分離。 16 n 1 1、實(shí)驗(yàn)材料的選取、實(shí)驗(yàn)材料的選取 凡是凡是含有含有DNADNA的生物材料都可以考慮，但選用的生物材料都可以考慮，但選用DNADNA含量相對較高含量相對較高 的生物組織，更具有操作性，根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康倪x取適當(dāng)?shù)牟牧虾偷纳锝M織，更具有操作性，根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康倪x取適當(dāng)?shù)牟牧虾?方法方法。 魚卵魚卵、豬肝、菜花、香蕉、雞血、哺乳動(dòng)物的紅細(xì)胞、獼猴桃、豬肝、菜花、香蕉、雞血、哺乳動(dòng)物的紅細(xì)胞、獼猴桃、 洋蔥、豌豆、菠菜、在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)的大腸桿菌。洋蔥、豌豆、菠菜、在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)的大腸桿菌。 五、實(shí)驗(yàn)操作原理五、實(shí)驗(yàn)操作原理 17 n 2 2、細(xì)胞破碎

13、、細(xì)胞破碎 動(dòng)物細(xì)胞動(dòng)物細(xì)胞：沒有：沒有細(xì)胞壁破碎較易，例如，在雞血細(xì)胞液中加入一定量的蒸細(xì)胞壁破碎較易，例如，在雞血細(xì)胞液中加入一定量的蒸 餾水餾水 ，同時(shí)用玻璃棒攪拌，過濾后收集濾液即可。同時(shí)用玻璃棒攪拌，過濾后收集濾液即可。 原理：蒸餾水對于細(xì)胞來說是一種原理：蒸餾水對于細(xì)胞來說是一種低滲低滲液體，水分可以大量進(jìn)入血細(xì)胞內(nèi)，液體，水分可以大量進(jìn)入血細(xì)胞內(nèi)， 使血細(xì)胞脹裂，再加上攪拌的機(jī)械作用，就加速了細(xì)胞的破裂使血細(xì)胞脹裂，再加上攪拌的機(jī)械作用，就加速了細(xì)胞的破裂( (細(xì)胞膜和核細(xì)胞膜和核 膜的破裂膜的破裂) )，從而釋放出，從而釋放出DNADNA。 植物細(xì)胞植物細(xì)胞：需要先用一定的洗滌

14、劑和氯化鈉溶解細(xì)胞膜，洗滌劑是一些離：需要先用一定的洗滌劑和氯化鈉溶解細(xì)胞膜，洗滌劑是一些離 子去污劑，能子去污劑，能溶解細(xì)胞膜溶解細(xì)胞膜，有利于，有利于DNADNA的釋放，氯化鈉有利于的釋放，氯化鈉有利于DNADNA的溶解。的溶解。 研磨：使研磨：使DNADNA充分釋放，洗滌劑等更容易充分接觸細(xì)胞膜。用充分釋放，洗滌劑等更容易充分接觸細(xì)胞膜。用液氮研磨液氮研磨可有可有 效的防止效的防止DNADNA降解。降解。 五、實(shí)驗(yàn)操作原理五、實(shí)驗(yàn)操作原理 18 n 2 2、細(xì)胞破碎、細(xì)胞破碎 n DNADNA降解的原因：降解的原因： 溫度溫度：高溫：高溫, ,易加速磷酸二酯鍵的水解易加速磷酸二酯鍵的水解

15、。 濕度濕度：參與磷酸二酯鍵的水解：參與磷酸二酯鍵的水解 、影響、影響DNADNA螺旋的形成結(jié)構(gòu)螺旋的形成結(jié)構(gòu)。 pHpH值：氫離子參與與催化磷酸二酯鍵的水解值：氫離子參與與催化磷酸二酯鍵的水解 、過高或過低的、過高或過低的pHpH 值都易破壞氫鍵值都易破壞氫鍵 。 氧氧化反應(yīng)：氧化堿基中的含氮雜環(huán)化反應(yīng)：氧化堿基中的含氮雜環(huán), ,使其變性使其變性, ,從而進(jìn)一步改變從而進(jìn)一步改變 一級與二級的一級與二級的DNADNA構(gòu)象構(gòu)象。 DNADNA降解降解酶：水解酶：水解DNADNA。 五、實(shí)驗(yàn)操作原理五、實(shí)驗(yàn)操作原理 19 n 3 3、DNADNA的純化的純化 細(xì)胞破碎細(xì)胞破碎后主要含有蛋白、多糖

16、和后主要含有蛋白、多糖和RNARNA等雜質(zhì)。可根據(jù)等雜質(zhì)?？筛鶕?jù)DNADNA的的性性 質(zhì)進(jìn)行質(zhì)進(jìn)行純化。首先可通過純化。首先可通過過濾過濾、離心離心等方法去除不溶解的等方法去除不溶解的雜質(zhì)，雜質(zhì)， 然后然后再進(jìn)一步純化再進(jìn)一步純化。 氯化鈉氯化鈉中的溶解度，氯化鈉濃度為中的溶解度，氯化鈉濃度為2mol/l2mol/l時(shí)時(shí)DNADNA溶解度最大溶解度最大，可，可 在此濃度下先溶解在此濃度下先溶解DNADNA，然后過濾去除不溶解的雜質(zhì)，然后在，然后過濾去除不溶解的雜質(zhì)，然后在 DNADNA溶解度最低的氯化鈉溶液中（溶解度最低的氯化鈉溶液中（0.14mol/l0.14mol/l）使）使DNADNA析

17、出，再過析出，再過 濾去除溶解在氯化鈉溶液中的雜質(zhì)。濾去除溶解在氯化鈉溶液中的雜質(zhì)。 五、實(shí)驗(yàn)操作原理五、實(shí)驗(yàn)操作原理 20 n 3 3、DNADNA的純化的純化 利用利用蛋白酶蛋白酶降解蛋白質(zhì)，加入嫩肉粉（木瓜蛋白酶）、蛋白酶降解蛋白質(zhì)，加入嫩肉粉（木瓜蛋白酶）、蛋白酶K K 等，降解蛋白質(zhì)等，降解蛋白質(zhì)。 適當(dāng)適當(dāng)溫度溫度降解蛋白質(zhì)，降解蛋白質(zhì)，65-7065-70，DNADNA不會被變性，蛋白會變性。不會被變性，蛋白會變性。 不溶于水的不溶于水的有機(jī)溶劑有機(jī)溶劑，酚、氯仿等，酚、氯仿等，DNADNA不溶于這類試劑，蛋白不溶于這類試劑，蛋白 質(zhì)可溶解在其中，通過靜止或離心使有機(jī)試劑和水分離

18、，去除質(zhì)可溶解在其中，通過靜止或離心使有機(jī)試劑和水分離，去除 雜質(zhì)。雜質(zhì)。 DNADNA結(jié)合柱結(jié)合柱，硝酸纖維素膜等，在酸性條件下可結(jié)合，硝酸纖維素膜等，在酸性條件下可結(jié)合DNADNA，中性，中性 和堿性條件下結(jié)合能力差。通過和堿性條件下結(jié)合能力差。通過DNADNA的等電點(diǎn)調(diào)節(jié)其所帶電荷為的等電點(diǎn)調(diào)節(jié)其所帶電荷為 正電或負(fù)電，通過孔徑去除大分子和小分子。正電或負(fù)電，通過孔徑去除大分子和小分子。 五、實(shí)驗(yàn)操作原理五、實(shí)驗(yàn)操作原理 21 n 4 4、DNADNA的析出的析出 溶溶于水的有機(jī)溶劑可使于水的有機(jī)溶劑可使DNADNA析出，水更容易和有機(jī)試劑結(jié)合，使析出，水更容易和有機(jī)試劑結(jié)合，使 DNA

19、DNA析出，如一定濃度析出，如一定濃度乙醇、異丙醇乙醇、異丙醇（乙醇濃度一般在（乙醇濃度一般在48-67.5%48-67.5%， 異丙醇濃度在異丙醇濃度在36%36%以上，濃度越高效果越好），低溫效果更好以上，濃度越高效果越好），低溫效果更好 （雜質(zhì)較多），同時(shí)，可在一定程度上出去溶于該有機(jī)試劑的（雜質(zhì)較多），同時(shí)，可在一定程度上出去溶于該有機(jī)試劑的 雜質(zhì)雜質(zhì)。 n 5 5、DNADNA的的溶解溶解 一般采用一般采用TETE（Tris-EDTATris-EDTA，pH8.0pH8.0）緩沖液或）緩沖液或去離子水。去離子水。 五、實(shí)驗(yàn)操作原理五、實(shí)驗(yàn)操作原理 22 n 6 6、 DNADNA的的

20、鑒定鑒定 DNADNA與與二苯胺（二苯胺（沸水?。境煞兴。境伤{(lán)色；藍(lán)色； 可可被被甲基綠甲基綠染成綠色染成綠色； DNADNA對紫外線（對紫外線（260nm260nm）有吸收作用）有吸收作用； DNADNA可與溴化乙錠（可與溴化乙錠（EBEB）花青素類染料結(jié)合，可在紫外光下激發(fā)）花青素類染料結(jié)合，可在紫外光下激發(fā) 熒光熒光。 五、實(shí)驗(yàn)操作原理五、實(shí)驗(yàn)操作原理 23 1.1.植物材料的植物材料的研磨研磨：稱稱取新鮮植物材料（菠菜）取新鮮植物材料（菠菜）100g100g，表面清洗后，表面清洗后， 在研缽中充分研磨，可加入石英砂，將植物組織充分研磨（可加入在研缽中充分研磨，可加入石英砂，將植物組織充分研磨（可加入 適量的提取緩沖液）。適量的提取緩沖液）。 2.2.將研磨好的樣品取出置于將研磨好的樣品取出置于200ml200ml燒杯中，加入燒杯中，加入100ml 10%100ml 10%的的SDSSDS輕輕 輕混勻，輕混勻，6565水浴水浴10-15min10