通則0512高效液相色譜法精編版

1、最新資料推薦高效液相色譜法:系采用高壓輸液泵將規(guī)定的流動(dòng)相泵入裝有填充劑的色譜柱，對(duì)供試品進(jìn)行分離測(cè)定的色譜方法。注入的供試品，由流動(dòng)相帶入色譜柱內(nèi)，各組分在柱內(nèi)被分離，并進(jìn)入檢測(cè)器檢測(cè),由積分儀或數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)記錄和處理色譜信號(hào)。1.對(duì)儀器的一般要求和色譜條件高效液相色譜儀由高壓輸液泵、進(jìn)樣器、色譜柱、檢測(cè)器、積分儀或數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)組成。色譜柱內(nèi)徑一般為3.9 4.6mm,填充劑粒徑為 3 10卩n。超高液相色譜儀：是適應(yīng)小粒徑(約 2卩m填充劑的耐超高壓、小進(jìn)樣量、低死體積、高靈敏度檢測(cè)的高效液相色譜儀。(1) 色譜柱反相色譜柱:以鍵和非極性基團(tuán)的載體為填充劑填充而成的色譜柱。常見(jiàn)的載體有硅膠

2、、聚合物復(fù)合硅膠和聚合物等;常用的填充劑優(yōu)十八烷基硅烷鍵合硅膠、辛基硅烷鍵合硅膠和苯基鍵合硅膠等。正相色譜柱:用硅膠填充劑，或鍵合極性基團(tuán)的硅膠填充而成的色譜柱。常見(jiàn)的填充劑有硅膠、氨基鍵合硅膠 和 氰基鍵合硅膠等。氨基鍵合硅膠和氰基鍵合硅膠也可用作反向色譜。離子交換色譜柱：用離子交換填充劑填充而成的色譜柱。有陽(yáng)離子交換色譜柱和陰離子交換色譜柱。手性分離色譜柱：用手性填充劑填充而成的色譜柱。16色譜柱的內(nèi)徑和長(zhǎng)度，填充劑的形狀、粒徑與粒徑分布、孔徑、表面積、鍵合基團(tuán)的表面覆蓋度、載體表應(yīng)根據(jù)被分離物質(zhì)的性質(zhì)來(lái)選擇合適的色譜柱。面基團(tuán)殘留量，填充的致密與均勻程度等均影響色譜柱的性能,應(yīng)注意室溫變

3、化的影響。為改善分離效溫度會(huì)影響分離效果，品種正文中未指明色譜柱溫度時(shí)系指室溫,果可適當(dāng)提高色譜柱的溫度，但一般不宜超過(guò)60 Co殘余硅羥基未封閉的硅膠色譜柱,流動(dòng)相的pH值一般應(yīng)在28之間。殘余硅羥基已封閉的硅膠、聚合物復(fù)合硅膠或聚合物色譜柱可耐受更廣泛pH值的流動(dòng)相，適合于pH值小于2或大于8的流動(dòng)相。(2) 檢測(cè)器最常用的檢測(cè)器為紫外 -可見(jiàn)分光檢測(cè)器，包括二極管陣列檢測(cè)器,電化學(xué)檢測(cè)器和質(zhì)譜檢測(cè)器等。其他常見(jiàn)的檢測(cè)器有熒光檢測(cè)器、蒸發(fā)光散射檢測(cè)器、示差折光檢測(cè)器、紫外-可見(jiàn)分光檢測(cè)器、熒光檢測(cè)器、電化學(xué)檢測(cè)器為選擇性檢測(cè)器,其響應(yīng)值不僅與被測(cè)物質(zhì)的量有關(guān)，還與其結(jié)構(gòu)有關(guān);蒸發(fā)光散射檢測(cè)

4、器和示差折光檢測(cè)器為通用型檢測(cè)器,對(duì)所有物質(zhì)均有響應(yīng)，結(jié)構(gòu)相似的物質(zhì)在蒸發(fā)光散射檢測(cè)器的響應(yīng)值幾乎僅與被測(cè)物質(zhì)的量有關(guān)。紫外-可見(jiàn)分光檢測(cè)器、熒光檢測(cè)器、電化學(xué)檢測(cè)器和示差折光檢測(cè)器的響應(yīng)值與被測(cè)物質(zhì)的量在一定范圍內(nèi)呈線性關(guān)系,但蒸發(fā)光散射檢測(cè)器的響應(yīng)值與被測(cè)物質(zhì)的量通常呈指數(shù)關(guān)系，一般需經(jīng)對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換。不同的檢測(cè)器，對(duì)流動(dòng)相的要求不同。0401)項(xiàng)下對(duì)溶劑的要求;紫外-可見(jiàn)分光檢測(cè)器所用流動(dòng)相應(yīng)符合紫外-可見(jiàn)分光光度法(通則采用低波長(zhǎng)檢測(cè)時(shí)，還應(yīng)考慮有機(jī)溶劑的截止使用波長(zhǎng)，并選用色譜級(jí)有機(jī)溶劑。蒸發(fā)光散射檢測(cè)器和質(zhì)譜檢測(cè)器不得使用含不揮發(fā)性鹽的流動(dòng)相。(3)流動(dòng)相反相色譜系統(tǒng)的流動(dòng)相常用甲醇-水

5、系統(tǒng)和乙腈-水系統(tǒng)，用紫外末端波長(zhǎng)檢測(cè)時(shí)，宜選用乙腈-水系統(tǒng)，流動(dòng)相中應(yīng)盡可能不用緩沖鹽，如需用時(shí)，應(yīng)盡可能使用低濃度緩沖鹽。用十八烷基硅烷鍵合硅膠色譜柱時(shí)，流動(dòng)相中有機(jī)溶劑一般不低于5%否則導(dǎo)致柱效下降、色譜系統(tǒng)不穩(wěn)定。正相色譜系統(tǒng)的流動(dòng)相:常用兩種或兩種以上的有機(jī)溶劑，如二氯甲烷和正己烷等。品種正文項(xiàng)下規(guī)定的條件除填充劑種類、流動(dòng)相組分、檢測(cè)器類型不得改變外，其余如色譜柱內(nèi)徑與長(zhǎng)度、填充劑粒徑、流動(dòng)相流速、流動(dòng)相組分比例、柱溫、進(jìn)樣量、檢測(cè)器靈敏度等，均可適當(dāng)改變，以達(dá)到系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn)的要求。調(diào)整流動(dòng)相組分比例時(shí)，當(dāng)小比例組分的百分比例X小于等于33%寸，允許改變范圍為0.7X1.3X ;

6、當(dāng)X大于33%寸，允許改變范圍為 X-10%X+10%若需使用小粒徑（約 2卩m）填充劑，輸液泵的性能、進(jìn)樣體積、檢測(cè)池體積和系統(tǒng)的死體積等必須與之匹配；如有必要，色譜條件也應(yīng)作適當(dāng)?shù)恼{(diào)整。當(dāng)對(duì)其測(cè)定結(jié)果產(chǎn)生爭(zhēng)議時(shí)，應(yīng)以品種項(xiàng)下規(guī)定的色譜條件的測(cè)定結(jié)果為準(zhǔn)。當(dāng)必須使用特定牌號(hào)的色譜柱方能滿足分離要求時(shí)，可在該品種正文項(xiàng)下注明。2.系統(tǒng)適用性試驗(yàn)色譜系統(tǒng)的適用性試驗(yàn):通常包括 理論板數(shù)、分離度、靈敏度、拖尾因子和重復(fù)性等五個(gè)參數(shù)。色譜系統(tǒng)的適用性試驗(yàn)定義:按各品種正文項(xiàng)下要求對(duì)色譜系統(tǒng)進(jìn)行適用性試驗(yàn)即用規(guī)定的對(duì)照品溶液或系統(tǒng)適用性試驗(yàn)溶液在規(guī)定的色譜系統(tǒng)進(jìn)行試驗(yàn),必要時(shí)，可對(duì)色譜系統(tǒng)進(jìn)行適當(dāng)調(diào)整

7、，以符合要求。（1）色譜柱的理論板數(shù)（n）用于評(píng)價(jià)色譜柱的分離效能。由于不同物質(zhì)在同一色譜柱上的色譜行為不同，采用理論板數(shù)作為衡量柱效能的指標(biāo)時(shí),應(yīng)指明測(cè)定物質(zhì)，一般為待測(cè)物質(zhì)或內(nèi)標(biāo)物質(zhì)的理論板數(shù)。在規(guī)定的色譜條件下，注入供試品溶液或各品種項(xiàng)下規(guī)定的內(nèi)標(biāo)物質(zhì)溶液，記錄色譜圖,量岀供試品主成分色譜峰或內(nèi)標(biāo)物質(zhì)色譜峰的保留時(shí)間t R和峰寬（W或半高峰寬（W2 ），按下式計(jì)算色譜柱的理論板數(shù):n = 16(t R / W) 2 或 n = 5.54( t R / Wh/2 ) 2t R、W W h/2可用時(shí)間或長(zhǎng)度計(jì)（下同），但應(yīng)取相同單位。（2）分離度（R）用于評(píng)價(jià)待測(cè)物質(zhì)與被分離物質(zhì)之間的分離程

8、度，是衡量色譜系統(tǒng)分離效能的關(guān)鍵指標(biāo)?？梢酝ㄟ^(guò)測(cè)定待測(cè)物質(zhì)與已知雜質(zhì)的分離度,末色譜系統(tǒng)分離效能進(jìn)行評(píng)價(jià)與與調(diào)整。也可以通過(guò)測(cè)定待測(cè)物質(zhì)與某一降解產(chǎn)物的分離度,無(wú)論是定性鑒別還是定量測(cè)定,1.5。均要求待測(cè)物質(zhì)色譜峰與內(nèi)標(biāo)物質(zhì)色譜峰或特定的雜質(zhì)對(duì)照色譜峰及其他色譜峰之間有較好的分離度。除另有規(guī)定外，待測(cè)物質(zhì)色譜峰與相鄰色譜峰之間的分離度應(yīng)大于分離度的計(jì)算公式為:式中R2為相鄰兩色譜峰中后一峰的保留時(shí)間R1為相鄰兩色譜峰中前一峰的保留時(shí)間1、W及 W,h/2、Wh/2分別為此相鄰兩色譜峰的峰寬及半高峰寬（如圖）。當(dāng)對(duì)測(cè)定結(jié)果有異議時(shí)，色譜柱的理論板數(shù)（n和分離度（R）均以峰寬（W的計(jì)算結(jié)果為準(zhǔn)。

9、（3）靈敏度用于評(píng)價(jià)色譜系統(tǒng)檢測(cè)微量物質(zhì)的能力，通常以信噪比（S/N ）來(lái)表示。通過(guò)測(cè)定一系列不同濃度的供試品或?qū)φ掌啡芤簛?lái)測(cè)定信噪比。定量測(cè)定時(shí)，信噪比應(yīng)不小于10;定性測(cè)定時(shí)，信噪比應(yīng)不小于系統(tǒng)適用性試驗(yàn)中可以設(shè)置靈敏度實(shí)驗(yàn)溶液來(lái)評(píng)價(jià)色譜系統(tǒng)的檢測(cè)能力。(4)拖尾因子(T用于評(píng)價(jià)色譜峰的對(duì)稱性。拖尾因子計(jì)算公式為:2d,式中 W 0.05h為5%筆高處的峰寬;,di為峰頂在5%筆高處橫坐標(biāo)平行線的投影點(diǎn)至峰前沿與此平行線交點(diǎn)的距離(如圖)。以峰高作定量參數(shù)時(shí)，除另有規(guī)定外,T值應(yīng)在0.951.05之間。以峰面積作定量參數(shù)時(shí)，一般的峰拖尾或前伸不會(huì)影響峰面積積分,但嚴(yán)重拖尾會(huì)影響基線和色譜峰

10、起止的判斷和峰面積積分的準(zhǔn)確性,此時(shí)應(yīng)在各品種正文項(xiàng)下對(duì)拖尾因子作岀規(guī)定。(5) 重復(fù)性用于評(píng)價(jià)色譜系統(tǒng)連續(xù)進(jìn)樣時(shí)響應(yīng)值的重復(fù)性能。5 次,采用外標(biāo)法時(shí)，通常取各品種項(xiàng)下的對(duì)照品溶液，連續(xù)進(jìn)樣2.0%;除另有規(guī)定外，其峰面積測(cè)量值的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差應(yīng)不大于米用內(nèi)標(biāo)法時(shí),通常配制相當(dāng)于 80% 100%和120%勺對(duì)照品溶液，加入規(guī)定量的內(nèi)標(biāo)溶液,配成3種不同濃度的溶液，分別至少進(jìn)樣2 次,計(jì)算平均校正因子，其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差應(yīng)不大于2.0%。3.測(cè)定法（1） 內(nèi)標(biāo)法按各品種正文項(xiàng)下的規(guī)定，精密稱（量）取對(duì)照品和內(nèi)標(biāo)物質(zhì)，分別配成溶液,各精密量取適量，混合配成校正因子測(cè)定用的對(duì)照溶液。取一定量進(jìn)樣，記錄

11、色譜圖。測(cè)量對(duì)照品和內(nèi)標(biāo)物質(zhì)的峰面積或峰高,按下式計(jì)算校正因子:校正因H C =令密式中As為內(nèi)標(biāo)物質(zhì)的峰面積或峰高;R為對(duì)照品的峰面積或峰高;S為內(nèi)標(biāo)物質(zhì)的濃度;R為對(duì)照品的濃度。再取各品種項(xiàng)下含有內(nèi)標(biāo)物質(zhì)的供試品溶液，進(jìn)樣，記錄色譜圖, 測(cè)量供試品中待測(cè)成分和內(nèi)標(biāo)物質(zhì)的峰面積或峰高, 按下式計(jì)算含量:式中A X為供試品的峰面積或峰高;X為供試品的濃度;s為內(nèi)標(biāo)物質(zhì)的峰面積或峰高;S為內(nèi)標(biāo)物質(zhì)的濃度;為內(nèi)標(biāo)法校正因子。采用內(nèi)標(biāo)法，可避免因供試品前處理及進(jìn)樣體積誤差對(duì)測(cè)定結(jié)果的影響。（2）外標(biāo)法按各品種項(xiàng)下的規(guī)定，精密稱（量）取對(duì)照品和供試品，配制成溶液,分別精密取一定量，進(jìn)樣，記錄色譜圖,測(cè)

12、量對(duì)照品溶液和供試品溶液中待測(cè)物質(zhì)的峰面積（或峰高），按下式計(jì)算含量:含量t RAr式中各符號(hào)意義同上。由于微量注射器不易精確控制進(jìn)樣量，當(dāng)采用外標(biāo)法測(cè)定時(shí), 以手動(dòng)進(jìn)樣器定量環(huán)或自動(dòng)進(jìn)樣器進(jìn)樣為宜。（3）加校正因子的主成分自身對(duì)照法測(cè)定雜質(zhì)含量時(shí)，可采用加校正因子的主成分自身對(duì)照法。在建立方法時(shí)，按各品種項(xiàng)下的規(guī)定，精密稱（量）取待測(cè)物質(zhì)對(duì)照品和參比物質(zhì)對(duì)照品各適量, 配制待測(cè)物校正因子的溶液，進(jìn)樣，記錄色譜圖,按下式計(jì)算待測(cè)物的校正因子:校正因子=Ca / aaCb/Ab式中c A為待測(cè)物的濃度;A A為待測(cè)物的峰面積或峰高;B為參比物質(zhì)的濃度;B為參比物質(zhì)的峰面積或峰高。也可精密稱（量）

13、取主成分對(duì)照品和雜質(zhì)對(duì)照品各適量，分別配制成不同濃度的溶液,進(jìn)樣，記錄色譜圖,繪制主成分濃度和雜質(zhì)濃度對(duì)其峰面積的回歸曲線,以主成分回歸直線斜率與雜質(zhì)回歸直線斜率的比計(jì)算校正因子。校正因子可直接載入各品種項(xiàng)下，用于校正雜質(zhì)的實(shí)測(cè)峰面積。需作校正計(jì)算的雜質(zhì)，通常以主成分為參比，采用相對(duì)保留時(shí)間定位，其數(shù)值一并載入各品種項(xiàng)下。測(cè)定雜質(zhì)含量時(shí)，按各品種項(xiàng)下規(guī)定的雜質(zhì)限度,將供試品溶液稀釋成與雜質(zhì)限度相當(dāng)?shù)娜芤?，作為?duì)照溶液;進(jìn)樣，記錄色譜圖,必要時(shí)，調(diào)節(jié)縱坐標(biāo)范圍（以噪聲水平可接受為限）使對(duì)照溶液的主成分色譜峰的峰高約達(dá)滿量程的 10% 25%。除另有規(guī)定外，通常含量低于0.5%的雜質(zhì)，峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD應(yīng)小于10%；含量在0.5%2%勺雜質(zhì),峰面積的 RSD應(yīng)小于5%含量大于2%勺雜質(zhì)，峰面積的 RSD應(yīng)小于2%。然后，取供試品溶液和對(duì)照品溶液適量，分別進(jìn)樣,2 倍,除另有規(guī)定外，供試品溶液的記錄時(shí)間，應(yīng)為主成分色譜峰保留時(shí)間的測(cè)量供試品溶液色譜圖上各雜質(zhì)的峰面積,分別乘以相應(yīng)的校正因子后與對(duì)照溶液主成分的峰面積比較，計(jì)算各雜質(zhì)含量。(4) 不加校正因子的主成分自身對(duì)照法測(cè)定雜質(zhì)含量時(shí)，若無(wú)法獲得待測(cè)物質(zhì)的校正因子，或校正因子可以忽略,也可采用不加校正因子的主成分自身對(duì)照法。同上述(3 )法配制對(duì)照溶液、進(jìn)樣調(diào)節(jié)縱坐標(biāo)范圍和計(jì)算峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差