生姜硫磺熏蒸前后HPLC特征色譜圖的建設(shè)機(jī)制

1、生姜硫磺熏蒸前后HPLC特征色譜圖的建設(shè)機(jī)制生姜為姜科植物姜Zingiber officinale Rosc.的新鮮根莖，味辛，性微溫，歸肺、脾、胃經(jīng)，功效解表散寒、溫中止嘔、化痰止咳、解魚蟹毒，主治風(fēng)寒感冒、胃寒嘔吐、寒痰咳嗽【1】。硫磺熏蒸作為一種傳統(tǒng)的中藥材養(yǎng)護(hù)方法，具有干燥、增白、防蟲、防腐和防霉變等作用，藥材硫磺熏蒸后，其化學(xué)成分組成結(jié)構(gòu)和含量會(huì)發(fā)生改變。有實(shí)驗(yàn)表明，硫熏過程中殘留的大量二氧化硫會(huì)刺激呼吸道黏膜，引起氣管炎、支氣管炎等呼吸道疾病和肝臟損傷，實(shí)驗(yàn)小鼠吸入二氧化硫或食用二氧化硫衍生物可導(dǎo)致神經(jīng)系統(tǒng)DNA損傷【5】。經(jīng)過反復(fù)熏蒸后，藥材表面吸附的硫及內(nèi)部生成的亞硫酸鹽會(huì)對(duì)人

2、體造成很大的傷害。2004年，原國家食品藥品監(jiān)督管理局關(guān)于對(duì)中藥材采用硫磺熏蒸問題的復(fù)函禁止采用硫磺熏制中藥材，2005年和2010年版中華人民共和國藥典都刪除了中藥加工中使用硫磺熏蒸的方法。目前，針對(duì)硫磺熏蒸中藥材的研究報(bào)道較多，如比色法和滴定法、離子色譜法、熒光法、高效液相色譜（HPLC）-質(zhì)譜法、氣相色譜-質(zhì)譜法等。但是，關(guān)于生姜硫磺熏蒸前后的指紋圖譜結(jié)構(gòu)改變和活性成分含量變化方面的研究較少。本研究采用HPLC-二極管陣列檢測(cè)器（DAD），建立并對(duì)比生姜硫磺熏蒸前后的指紋圖譜結(jié)構(gòu)差異，首次對(duì)硫磺熏蒸前后生姜中主要活性成分進(jìn)行定量檢測(cè)，以期客觀評(píng)價(jià)硫磺熏蒸對(duì)生姜質(zhì)量的影響，也為生姜硫熏品的

3、定性鑒別方法開發(fā)提供重要依據(jù)。1 儀器與試藥Agilent HP1200高效液相色譜儀（包括四元泵、Agilent Chem station工作站、DAD檢測(cè)器），美國Agilent公司。PB60-2E型電子天平，梅特勒-托利多儀器上海有限公司；AL204萬分之一電子分析天平，梅特勒公司；DGF30/14-4900型電熱鼓風(fēng)干燥箱，南京實(shí)驗(yàn)儀器廠；KQ-100型超聲波清洗機(jī)，昆山超聲儀器有限公司；TGL-16G離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠。生姜采自浙江衢州頂佳農(nóng)園，經(jīng)南京中醫(yī)藥大學(xué)生藥教研室吳德康教授鑒定姜科植物姜Zingiber officinale Rosc.的新鮮根莖；6-姜酚對(duì)照品（批號(hào)

4、110839-200403）購自中國食品藥品檢定研究院；工業(yè)硫磺購自南京南澳科技有限公司，實(shí)驗(yàn)用水由Milli-Q超純水系統(tǒng)制備，其他試劑為分析純。2 方法與結(jié)果2.1 生姜硫熏品的制備硫磺熏蒸過程在干燥器中進(jìn)行，將硫磺點(diǎn)燃灼燒至熔融發(fā)煙，轉(zhuǎn)移至干燥器底部，取生姜薄片（厚度5 mm）適量，放入干燥器上層，硫磺用量為生姜量的20%，密封干燥器，硫熏12 h后取出。2.2 對(duì)照品溶液的制備取6-姜酚對(duì)照品約5 mg，精密稱定，置10 mL棕色容量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得。2.3 供試品溶液的制備將生姜非硫熏品及生姜硫熏品分別粉碎，放入研缽中研磨，稱取0.1 g，精密稱定，置50 m

5、L具塞錐形瓶中，乙醇定容后，超聲（功率200 W，頻率40 kHz）30 min，補(bǔ)足減失的質(zhì)量，14 000 r/min離心20 min，取上清液，作為供試品溶液。2.4 色譜條件色譜柱：ZORBAX SB-C18（4.6 mmx150 mm，5 μm）；乙腈（A）-水（B）為流動(dòng)相，梯度洗脫（0→4 min，15%→20%A；4→6 min，20%→35%A；6→20 min，35%→70% A；20→25 min，70%→77%A；25→30 min，77%→85%A；30&rarr

6、;35 min，85%→100%A；35→40 min，100%A）；柱溫25 ；檢測(cè)波長(zhǎng)280 nm；體積流量1 mL/min；進(jìn)樣量20 μL。2.5 方法學(xué)考察2.5.1 線性關(guān)系考察 精密稱取6-姜酚適量，配制成濃度分別為5、10、20、40、50 μg/mL的對(duì)照品溶液，以進(jìn)樣濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程Y=10.997X-3.678 3，r=0.999 7，線性范圍為550 μg/mL。2.5.2 精密度試驗(yàn) 取同一份供試品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)得各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積均RSD3.0%，結(jié)果表明符合特征色譜技

7、術(shù)要求。2.5.3 重復(fù)性試驗(yàn) 分別取生姜硫熏品和生姜非硫熏品，按2.3;項(xiàng)下方法制備供試品溶液6份并測(cè)定，共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積均RSD3.0%，符合特征色譜技術(shù)要求。2.5.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 分別取生姜硫熏品和生姜非硫熏品，按2.3;項(xiàng)下方法制備供試品溶液，分別在0、2、4、6、8、10、12、24 h進(jìn)樣，測(cè)得各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積均RSD3.0%，結(jié)果表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。2.5.5 加樣回收率試驗(yàn) 取生姜硫熏品粉末0.1 g，精密稱定，置50 mL具塞錐形瓶中，精密量取5 μg/mL對(duì)照品溶液1 mL，加入錐形瓶中，按2.3;項(xiàng)下方法制備，按上述色

8、譜條件測(cè)定，所得加樣回收率為98.84% （n=6），RSD=2.72%。2.6 特征色譜的建立2.6.1 特征色譜的制備 精密吸取供試品溶液10 μL，注入高效液相色譜儀測(cè)定，記錄40 min色譜圖，即得。色譜圖見圖1。2.6.2 峰歸屬 取對(duì)照品溶液20 μL，注入高效液相色譜儀，在上述色譜條件下進(jìn)樣分析，將各色譜峰的保留時(shí)間與對(duì)照品進(jìn)行比對(duì)，特征色譜中8號(hào)峰為6-姜酚。其他色譜峰經(jīng)對(duì)照品對(duì)照，未發(fā)現(xiàn)已知化合物。2.7 特征色譜化學(xué)成分組成結(jié)構(gòu)差異性分析2.7.1 共有色譜峰的峰面積變化 根據(jù)特征色譜中，檢出生姜硫磺前后的17個(gè)共有色譜峰，其中1、2、49、1216號(hào)色譜峰的峰

9、面積在硫磺熏蒸前后無顯著變化，3號(hào)色譜峰的峰面積下降了50.68%，10號(hào)峰下降了64.41%，11號(hào)峰下降了67.68%，17號(hào)下降了21.23%，見表1。2.7.2 6-姜酚含量變化 6-姜酚是生姜中的主要活性成分，也是藥典規(guī)定的指標(biāo)性成分。硫磺熏蒸前后，生姜中6-姜酚的含量并沒有明顯變化，見表2。3 討論生姜經(jīng)硫磺熏蒸后，主要活性成分6-姜酚含量并無明顯變化，仍符合2010年版中華人民共和國藥典要求。因此，若僅以6-姜酚作為考察指標(biāo)，就無法判別生姜硫熏品的品質(zhì)優(yōu)劣。故仍需建立更為合理、有效的定性定量檢測(cè)方法。本研究從生姜硫熏前后樣品特征圖譜中發(fā)現(xiàn)了17個(gè)共有峰，硫磺熏蒸前后色譜峰峰面積變

10、化表明，經(jīng)硫磺熏蒸后，生姜中的化學(xué)成分組成發(fā)生了很大變化，有的成分含量甚至降低了60%以上?？梢?，硫磺熏蒸可能造成生姜中大量化學(xué)成分的破壞和損失，必將影響生姜的品質(zhì)，最終導(dǎo)致其藥理活性和臨床功效降低。另外，生姜硫磺熏蒸后，還可能產(chǎn)生了新的化合物，或殘留有害物質(zhì)。本研究的檢測(cè)方法有限，未能全面反映硫熏前后生姜中全部成分的變化情況，如硫磺及金屬元素殘留、硫酸化等多種未知成分的識(shí)別、藥理作用差異等。后續(xù)研究將采用超高液相色譜與串聯(lián)四級(jí)桿飛行時(shí)間質(zhì)譜儀聯(lián)用技術(shù)和電感耦合等離子體質(zhì)譜技術(shù)，進(jìn)一步全面闡述硫磺熏蒸前后生姜中化學(xué)成分的差異性，并嘗試建立其鑒別檢測(cè)方法，為生姜硫熏品的控制提供技術(shù)支撐。參考文獻(xiàn)

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