胚胎冷凍保存

1、冷凍保存技術(shù)-胚胎 冷凍保存 胚胎冷凍保存是將胚胎保存在-196超低溫的液氮 （或其他抗凍保護劑）中做長期保存?？墒古咛ヒ浦膊?受時間地點的限制，從而達到提高胚胎移植效率，長期 保存優(yōu)良基因的目的。胚胎冷凍技術(shù)為建立優(yōu)良品種的 胚胎庫提供了條件，還可以長期保存珍貴或瀕臨滅絕的 動物資源。 研究和優(yōu)化胚胎冷凍保存技術(shù)對胚胎工程的發(fā)展有重要 的意義。 v胚胎冷凍保存原理 v胚胎凍存的損傷機制 v抗凍保護劑 v胚胎冷凍方法 v人類胚胎冷凍案例 胚胎冷凍保存原理 v冷凍保存冷凍保存,是將體外培養(yǎng)物懸浮在加有或小加是將體外培養(yǎng)物懸浮在加有或小加 冷凍保護劑的溶液中，以一定的冷凍速度降冷凍保護劑的溶液中，

2、以一定的冷凍速度降 至零下某一溫度，對其長期保存的過程至零下某一溫度，對其長期保存的過程。此 時細胞的代謝活動被完全抑制，使細胞的生 命在靜比狀態(tài)下保存來，從而達到長期保存 的目的。 胚胎凍存的損傷機制 v胚胎的冷凍實際上是一個脫水過程，冷凍保存的關(guān)冷凍保存的關(guān) 鍵是設(shè)法減少細胞內(nèi)冰晶對胚胎造成的損傷鍵是設(shè)法減少細胞內(nèi)冰晶對胚胎造成的損傷。正常 胚胎細胞內(nèi)水分含量達80%以上，在冷凍過程中， 胚胎細胞中的水分將從細胞中游離出來冷凍成冰晶， 一方而對胚胎細胞造成機械性損傷即冰晶損傷，另 一方而導(dǎo)致未結(jié)冰的細胞內(nèi)溶液滲透壓急劇增高， 造成蛋自質(zhì)變性即溶液損傷，二者最后都導(dǎo)致胚胎 小可逆性變化而死亡

3、。 抗凍保護劑 v胚胎冷凍的關(guān)鍵是減少細胞內(nèi)冰晶形成對胚 胎的損傷。對于胚胎的冷凍和解凍，一50- 15是一個致死溫度區(qū)。在這個溫度區(qū)細胞 容易形成大的冰晶。加入抗凍保護劑能避免加入抗凍保護劑能避免 冰晶的形成。冰晶的形成。 v分類：滲透型冷凍保護劑 非滲透性冷凍保護劑 滲透型冷凍保護劑 v屬于細胞內(nèi)冷凍保護劑，一般小分子物質(zhì)，在0 以上很容易通過細胞膜進入細胞質(zhì)。 v機理：在進行胚胎冷凍時，保護劑使水分子從細胞 內(nèi)滲透出，減少了細胞內(nèi)冰晶的形成；同時保護劑 與水分子形成氫鍵，降低了凍結(jié)部分的電解質(zhì)濃度 從而減少了冷凍過程對細胞的損傷。 v常見的滲透型冷凍保護劑有：甘油、二甲基要亞砜 （DMS

4、O）、丙二醇和乙二醇等。 非滲透型冷凍保護劑 v屬于細胞外冷凍保護劑，一般為高分子物質(zhì)， 能夠溶解于水，但不能進入細胞。 v機理：非滲透型冷凍保護劑主要通過該改變 滲透壓引起細胞脫水，發(fā)揮非特異性保護作 用。 v常見的非滲透型冷凍保護劑包括：單糖（如 葡萄糖）、二糖（如蔗糖）、三糖（如棉子 糖）、聚乙烯吡咯烷酮等。 冷凍方法 v冷凍保護液常用pH7.27.4的磷酸鹽緩沖液（PBS） 來配制，也可用生理鹽水或M199來配制。 v現(xiàn)有保存方法有3種：程序冷凍法：一步冷凍法和 玻璃化冷凍化。 v在實際應(yīng)用中，緩慢冷凍法經(jīng)常只使用一種抗凍保 護劑；快速冷凍和玻璃化冷凍常應(yīng)用多種抗冷凍保 護劑，如甘油、

5、丙二醇和乙二醇或者乙二醇和丙二 醇，再加入葡萄糖、蔗糖或半乳糖。 程序冷凍法 v也叫慢速冷凍法、逐步降溫法。 v所用冷凍保護劑一般為： 二甲亞砜（DMSO）、氨基酸、丙三醇（甘油）、 1,2-丙二醇等。該法采用較低濃度的冷凍保護劑， 對胚胎毒性損害小，解凍后存活率較高。但因其操 作繁瑣，降溫速度慢，致使所需時間長，需要特殊 的降溫裝置，在不具備實驗條件的場所不能使用此 法進行胚胎冷凍。目前國內(nèi)外均較少使用。 v影響因素包括：抗凍保護劑的選擇與濃度、植冰和 降溫速度、解凍方法、抗凍的脫出等 v大致基本步驟如下： v將采集到的胚胎在含20%小牛血清的PBS溶液中洗滌2次 v講洗滌過的胚胎在室溫條件

6、下加入含1.4mol|L甘油和20%小 牛血清的PBS的冷凍中平衡20min v將胚胎和冷凍液裝入0.25ml胚胎冷凍細管中，封口，并在細 管外標記供體號、胚胎數(shù)量、等級、冷凍日期等 v將裝入胚胎的習(xí)慣放入冷凍儀中，在0平衡10min，以 1|min的速度降至-7-6，并在此溫度下誘發(fā)潔凈，平衡 10min，然后0.3的速度降溫至-38-35，投入液氮保存 v解凍時從冷凍液中取出裝胚胎的細管，在空氣中平衡10s， 立即至于37水浴解凍，1min后取出完成解凍過程 v將細管中的冷凍液及胚胎推出，在現(xiàn)實鏡下找到胚胎并移入 解凍液。采用三步法脫除甘油，每步57min。最后用PBS 液將胚胎洗35遍，

7、供移植備用。 一步冷凍法 v也叫一步細管法。 v該方法是由慢速冷凍法改進而來，細管內(nèi)的 冷凍液和蔗糖液是分開的，因此，在細管內(nèi) 用蔗糖液可一步脫除甘油抗凍劑，從而利于 在生產(chǎn)中推廣應(yīng)用。 玻璃化冷凍法 v將胚胎在適當(dāng)?shù)睦鋬霰Ｗo劑混合液中作短暫處理后， 直接投入液氮。冷凍保護劑在急劇降溫到很低溫度 時能被濃縮而不結(jié)晶，而且液體的粘性增強，由液 態(tài)變?yōu)橥该鞯墓虘B(tài)，形成玻璃化。 v用這種方法冷凍，無需凍前分步添加抗凍劑和凍后 分步脫除抗凍劑的繁瑣步驟，簡化了冷凍過程，是 一種簡便、快速、有效的冷凍方法，不需要冷凍儀 器。 v是近年來發(fā)展起來的一種新的方法。 v大致基本步驟如下： v將胚胎在含20%小

8、妞血清的PBS溶液中清洗兩次 v將洗滌過的胚胎在室溫條件下加入含1.4mol|L甘油 和20%小牛血清的PBS的冷凍液中平衡10min v將胚胎專一到含有10%甘油+20%小牛血清的PBS 溶液中，立即轉(zhuǎn)入胚胎冷凍細管 v將細管在液氮冠頸部預(yù)冷5min后投入液氮中保存 v解凍時將液氮中取出細管，在空氣中平衡7s，迅速 投入20溫水中，搖動細胞管使其解凍均勻 v將解凍后的胚胎移入含1.0mol|L蔗糖+20%小牛的 PBS溶液中平衡10min，出去保護劑；再用含20小 牛血清的PBS溶液洗滌2次后用于移植 人類胚胎冷凍案例 v一. 研究對象:白2 000年1月至20 O 1年7月止，于本室進行I

9、V F- E T治療的患者 22例共行冷凍胚胎移植24個周期，年齡24 31歲，平均年齡(28士2. 96)歲，不 孕年限110年，平均不孕年限( 3. 5士2. 23)年。其中臨床激素替代周期7個周期， 白然周期17個周期。 v 二、胚胎冷凍:22例患者按本室常規(guī)進行IVF一ET治療。胚胎移植術(shù)后，從剩 余胚胎中選擇優(yōu)質(zhì)胚胎分別放入含25%人血白蛋白的DPBS緩沖液5分鐘、1. 5M PROH液10分鐘、1. 5M PROH+0. 1M Sucrose液5分鐘，然后迅速裝管，總操 作時問不超過20分鐘。最后將胚胎迅速放入程序冷凍儀( Cryo L一863，澳大利 亞)中進行程序冷凍，程序為:

10、從22開始，以一2 0C/分鐘的速度降至一6 0C,停 留5分鐘，進行人工植冰，然后繼續(xù)停留10分鐘，再以一0. 3的速度降至一 37，以一0.6/分鐘降至一40 ，然后將胚胎轉(zhuǎn)移入液氮中。 v 22例患者共進行了24個周期的胚胎凍融移植，共獲得臨床妊娠5例，臨床妊娠 率為22.7% 二. 20 06年2月一20 07年12月在我中心進行冷凍胚胎移植患者112例，年齡 2339歲，平均(30 88士3 72)歲。不孕年限117年，平均(4 79士3 24)年。其中 85例患者年齡50%為存活胚胎。 三. 1.研究對象 1999年12月一2001年12月在本生殖醫(yī)學(xué)中心，應(yīng)用卵細胞內(nèi)單精 子顯微

11、注射(ICSI)及常規(guī)體外受精(IVF)技術(shù)治療不育不孕癥的71個周期中，將胚 胎移植后剩余的優(yōu)質(zhì)胚胎進行冷凍保存。 2.治療方法術(shù)前檢查夫婦雙方的染色體核型正常，血液促黃體生成素(LH)水平 在正常范圍?；颊咂拮訌脑陆?jīng)黃體中期開始采用GnRH-a-FSH-HMG-hCG方案進 行超促排卵。采用常規(guī)NF和ICSI技術(shù)進行體外受精和胚胎移植。 3.胚胎冷凍采用慢速、逐步降沮的冷凍程序，以丙二醇、蔗糖為冷凍保護劑， 用CL一3000程序冷凍儀進行程序冷凍，然后將胚胎貯存于液氮中。冷凍程序:室 溫以一1 /min到一69C;浸潤I mln，植冰，再保溫9min;以一0. 39C/min到一3290; 一0. 29C/min到一369C;一19C/min到一759C結(jié)束。 4.胚胎解凍及移植胚胎復(fù)蘇的方法采用快速解凍法。解凍液以PBS、丙二醉、 蔗糖為原料以適當(dāng)?shù)谋壤M行配制。在女方自然月經(jīng)周期尿LH峰的第3天或第4 天將冷凍胚胎復(fù)蘇，將復(fù)蘇后胚胎在墻養(yǎng)箱中培養(yǎng)2一4b,選擇有半數(shù)以上細胞成 活的胚胎進行移植。移植2周后進行妊振試驗,4周后B超檢查有無孕囊及胎心搏動。 5.結(jié)果 在71個胚胎冷凍貯存周期中，25個周期已經(jīng)妊振。在另外46個周期 中，進行冷凍胚胎復(fù)蘇后移植的有24個