流式細(xì)胞儀檢測凋亡和細(xì)胞周期等應(yīng)用

1、什么是流式細(xì)胞儀 流式細(xì)胞儀實(shí)物 BD FACSVantageBD-Calibur 凡是能被熒光素標(biāo)記的細(xì)胞或顆粒都可用流式細(xì)凡是能被熒光素標(biāo)記的細(xì)胞或顆粒都可用流式細(xì) 胞儀檢測。胞儀檢測。 前提這種熒光素能被流式細(xì)胞儀所配置的激光光前提這種熒光素能被流式細(xì)胞儀所配置的激光光 源激發(fā)源激發(fā) 在生物檢測技術(shù)中流式細(xì)胞儀是不可多得的在生物檢測技術(shù)中流式細(xì)胞儀是不可多得的一機(jī)一機(jī) 多用多用的儀器。的儀器。 4. 應(yīng)用范圍應(yīng)用范圍 二、流式細(xì)胞儀的工作原理和基本結(jié)構(gòu)二、流式細(xì)胞儀的工作原理和基本結(jié)構(gòu) 待測細(xì)胞以待測細(xì)胞以單個(gè)細(xì)胞的懸液單個(gè)細(xì)胞的懸液，經(jīng)特，經(jīng)特 異性熒光染料染色，放入樣品管，異性熒光染

2、料染色，放入樣品管， 吸入流動室。吸入流動室。 流動室充滿流動室充滿鞘液鞘液，作用：約束樣品，作用：約束樣品 在噴嘴中心，防止樣品靠近噴孔在噴嘴中心，防止樣品靠近噴孔 壁堵塞噴孔。細(xì)胞排成單列由噴壁堵塞噴孔。細(xì)胞排成單列由噴 嘴中心噴出，形成細(xì)胞液柱。嘴中心噴出，形成細(xì)胞液柱。 液柱與激光束相交，細(xì)胞上的熒光染料被激發(fā)產(chǎn)生熒光。液柱與激光束相交，細(xì)胞上的熒光染料被激發(fā)產(chǎn)生熒光。 熒光信號變成電信號輸出到計(jì)算機(jī)，軟件分析。熒光信號變成電信號輸出到計(jì)算機(jī)，軟件分析。 基本結(jié)構(gòu)基本結(jié)構(gòu) 三、 流式細(xì)胞儀可檢測到的細(xì)胞參數(shù) 顆粒度顆粒度 細(xì)胞大小細(xì)胞大小 =前向角散射光（前向角散射光（FSCFSC）細(xì)

3、胞相對大小及其表面積細(xì)胞相對大小及其表面積 =側(cè)向角散射光（側(cè)向角散射光（SSCSSC）細(xì)胞顆粒度及細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞器的細(xì)胞顆粒度及細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞器的 相對復(fù)雜性相對復(fù)雜性 血液涂片血液涂片 外周全血細(xì)胞散射光雙參數(shù)點(diǎn)圖外周全血細(xì)胞散射光雙參數(shù)點(diǎn)圖 熒光染料被激發(fā)而發(fā)射的光信號。熒光染料被激發(fā)而發(fā)射的光信號。 定量染色定量染色 熒光信號大小熒光信號大小 被標(biāo)記組分含量的定量被標(biāo)記組分含量的定量 多熒光標(biāo)記胞內(nèi)多種組分，實(shí)現(xiàn)多參數(shù)測量多熒光標(biāo)記胞內(nèi)多種組分，實(shí)現(xiàn)多參數(shù)測量 二色鏡 1 2 3 帶通濾波片 光電倍增管 激光束 細(xì)胞 收集透鏡 前向 散射 光 側(cè)向散射 光，熒光 光信號分離，導(dǎo)向光信號分離，導(dǎo)

4、向 各探測通道接收并轉(zhuǎn)化為電信號。各探測通道接收并轉(zhuǎn)化為電信號。 光信號收集光信號收集 三三 數(shù)據(jù)處理及數(shù)據(jù)處理及流式報(bào)告 FSC SSC FL1 FL2 FL3 對數(shù)對數(shù) 線性線性 線性線性 線性線性 對數(shù)對數(shù) 脈沖處理，模數(shù)轉(zhuǎn)換 光信號 電信號 記錄數(shù)據(jù)，顯示結(jié)果 （面積，峰高，寬度） n流式報(bào)告的圖一般分為四種，即散點(diǎn)圖、直方流式報(bào)告的圖一般分為四種，即散點(diǎn)圖、直方 圖、密度圖和二維等高圖等。最常用的為散點(diǎn)圖、密度圖和二維等高圖等。最常用的為散點(diǎn) 圖和直方圖。圖和直方圖。 n幾個(gè)概念：幾個(gè)概念： n%Gated：陽性細(xì)胞百分比。反映細(xì)胞群體中陽性細(xì)胞百分比。反映細(xì)胞群體中 陽性細(xì)胞的數(shù)量

5、。陽性細(xì)胞的數(shù)量。 nMean：平均熒光強(qiáng)度，與被檢測物質(zhì)的表達(dá)平均熒光強(qiáng)度，與被檢測物質(zhì)的表達(dá) 量有關(guān)，在正態(tài)分布時(shí)一般用該值。量有關(guān)，在正態(tài)分布時(shí)一般用該值。 nGeo Mean：幾何平均熒光強(qiáng)度，在陽性細(xì)胞幾何平均熒光強(qiáng)度，在陽性細(xì)胞 為偏態(tài)分布時(shí)一般用該值。為偏態(tài)分布時(shí)一般用該值。 散點(diǎn)圖 密度圖 二維等高圖 直方圖 圖 報(bào)告中常見的幾種流式細(xì)胞圖 R1 File: 4Acquisition Date: 06-Mar-03 QuadEvents% Gated X MeanY Mean UL2542.4037.47461.36 UR106710.08816.86468.89 LL5291

6、49.9819.574.41 LR397537.55418.809.87 圖 Annexin V/PI雙標(biāo)記分析細(xì)胞凋亡和壞死 流式細(xì)胞儀數(shù)據(jù)分析流式細(xì)胞儀數(shù)據(jù)分析 =點(diǎn)圖分析點(diǎn)圖分析 流式細(xì)胞儀數(shù)據(jù)分析流式細(xì)胞儀數(shù)據(jù)分析 =直方圖分析直方圖分析 圖中100101（M1）為陰性細(xì)胞，101以上的（M2）為陽性細(xì)胞 五、 流式細(xì)胞術(shù)的應(yīng)用 （Propidium iodide碘化丙啶），碘化丙啶）， 單參數(shù)直方圖 圖中2N代表G0/G1期細(xì)胞，4N代表G2/M期細(xì)胞，兩者中間代表 S期細(xì)胞。這是以2倍體和4倍體細(xì)胞為主的流式DNA圖 DNA細(xì)胞周期分析細(xì)胞周期分析 細(xì)胞周期細(xì)胞周期 200 400

7、 600 8001000 DNA含量含量 細(xì)細(xì) 胞胞 數(shù)數(shù) 量量 2倍體倍體 異倍體異倍體 4倍體倍體 腫瘤組織中的各種腫瘤組織中的各種DNA倍體倍體 含量與凋亡關(guān)系含量與凋亡關(guān)系 nDNA亞亞G1峰的檢測：利用峰的檢測：利用PI染色，檢測具有染色，檢測具有 亞亞G1期期DNA含量的細(xì)胞比例，代表凋亡細(xì)胞數(shù)。含量的細(xì)胞比例，代表凋亡細(xì)胞數(shù)。 n凋亡過程中，細(xì)胞內(nèi)核酸酶的釋放，將凋亡過程中，細(xì)胞內(nèi)核酸酶的釋放，將DNA降降 解，分解成小的片段，在標(biāo)本制備中的固定處解，分解成小的片段，在標(biāo)本制備中的固定處 理時(shí)，細(xì)胞膜的完整性被破壞，使細(xì)胞內(nèi)降解理時(shí)，細(xì)胞膜的完整性被破壞，使細(xì)胞內(nèi)降解 的的DNA

8、片段從細(xì)胞內(nèi)流出，造成總體片段從細(xì)胞內(nèi)流出，造成總體DNA含含 量減少，成為亞量減少，成為亞2倍體。倍體。 二）腫瘤診斷與抗腫瘤藥物研究二）腫瘤診斷與抗腫瘤藥物研究 1. 腫瘤診斷腫瘤診斷 2倍體倍體 異倍體異倍體 4倍體倍體 腫瘤組織中的各種腫瘤組織中的各種DNA倍體倍體 2. 凋亡研究凋亡研究 Annexin V Assay R1 File: 4Acquisition Date: 06-Mar-03 QuadEvents% Gated X MeanY Mean UL2542.4037.47461.36 UR106710.08816.86468.89 LL529149.9819.574.41

9、 LR397537.55418.809.87 圖 Annexin V/PI雙標(biāo)記分析細(xì)胞凋亡和壞死 Date acquired: 14-Jan-03 File: 7Gy 4hr.001 Source: dongbo DIPLOID: 100.00 % Dip G0-G1: 73.12 % at 48.16 Dip G2-M: 9.59 % at 96.33 Dip S: 17.29 % G2/G1: 2.00 Dip %CV: 6.04 Apoptosis: 13.66 % Mean: 27.48 R1 圖圖 FCM測試細(xì)胞周測試細(xì)胞周 期分布和凋亡期分布和凋亡 根據(jù)凋亡細(xì)胞的特點(diǎn)來檢測根據(jù)凋

10、亡細(xì)胞的特點(diǎn)來檢測 n在形態(tài)上，早期細(xì)胞核固縮，染色體邊集在核在形態(tài)上，早期細(xì)胞核固縮，染色體邊集在核 膜內(nèi)側(cè)顯新月體形、核碎裂；細(xì)胞漿和細(xì)胞器膜內(nèi)側(cè)顯新月體形、核碎裂；細(xì)胞漿和細(xì)胞器 密度增高、細(xì)胞體積變?。患?xì)胞膜皺折卷曲，密度增高、細(xì)胞體積變?。患?xì)胞膜皺折卷曲， 但早期細(xì)胞膜的完整性未受到破壞但早期細(xì)胞膜的完整性未受到破壞 n凋亡細(xì)胞的凋亡細(xì)胞的FSC ？SSC ？ n細(xì)胞壞死時(shí)，細(xì)胞腫脹，細(xì)胞壞死時(shí)，細(xì)胞腫脹，F(xiàn)SC ？，？，SSC ？ 三）三） R1 M1 M1 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞表型 流式細(xì)胞術(shù)白血病免疫分型是利用熒光素流式細(xì)胞術(shù)白血病免疫分型是利用熒光素 標(biāo)記的單克隆抗體作分子探針

11、，多參數(shù)標(biāo)記的單克隆抗體作分子探針，多參數(shù) 分析白血病細(xì)胞的免疫表型，了解被測分析白血病細(xì)胞的免疫表型，了解被測 白血病細(xì)胞所屬細(xì)胞系列及其分化程度。白血病細(xì)胞所屬細(xì)胞系列及其分化程度。 FCM分析白血病免疫表型分析白血病免疫表型, 快速、特異、快速、特異、 準(zhǔn)確，重復(fù)性好，能區(qū)分細(xì)胞起源、劃準(zhǔn)確，重復(fù)性好，能區(qū)分細(xì)胞起源、劃 分其分化發(fā)育階段等，對白血病的診斷分其分化發(fā)育階段等，對白血病的診斷 與分型、治療方案選擇與預(yù)后判斷、發(fā)與分型、治療方案選擇與預(yù)后判斷、發(fā) 病機(jī)理研究等有重要價(jià)值。病機(jī)理研究等有重要價(jià)值。 四）四）白血病的免疫分型白血病的免疫分型 五）五） 細(xì)胞內(nèi)蛋白的分析：細(xì)胞內(nèi)蛋白

12、的分析： 熒光信號熒光信號 熒光樣本制備熒光樣本制備 雙色直接染色雙色直接染色 端粒（熒光蛋白）端粒（熒光蛋白） 六）細(xì)胞內(nèi)鈣離子測定六）細(xì)胞內(nèi)鈣離子測定 1 110106 6/ml/ml的細(xì)胞懸液，的細(xì)胞懸液， 加入終濃度為加入終濃度為1-5mol/ml Fluo-3/AM1-5mol/ml Fluo-3/AM，充分混勻，充分混勻， 室溫避光作用室溫避光作用6060分鐘。分鐘。 以以HEPESHEPES緩沖的緩沖的HanksHanks平衡鹽溶液洗三次，重懸于平衡鹽溶液洗三次，重懸于 0.5ml0.5ml同樣的溶液，上流式細(xì)胞儀檢測。同樣的溶液，上流式細(xì)胞儀檢測。 根據(jù)報(bào)告中給出的樣品熒光強(qiáng)度

13、計(jì)算細(xì)胞內(nèi)鈣離子根據(jù)報(bào)告中給出的樣品熒光強(qiáng)度計(jì)算細(xì)胞內(nèi)鈣離子 的濃度。的濃度。 FCM檢測胞內(nèi)鈣離子、 膜電位和線粒體功能 M1陰性界限劃分完全是根據(jù)陰性對照！如下圖：紅色部分代表陰性對照，即： 所檢測的物質(zhì)在陰性組中的基礎(chǔ)表達(dá)量，可以理解為背景、靜息狀態(tài)下、基礎(chǔ) 水平、未受刺激時(shí)等。藍(lán)色部分即陽性組，也就是接受刺激后，功能狀態(tài)下、 藥物作用后等。 六六. 分選：分選： 488 nm laser +- Fluorescence Activated Cell Sorting Charged Plates Single cells sorted into test tubes FALS Senso

14、r Fluorescence detector 流式細(xì)胞儀是一種特殊的顯微鏡流式細(xì)胞儀是一種特殊的顯微鏡 流式細(xì)胞儀流式細(xì)胞儀顯微鏡顯微鏡 流動的細(xì)胞流動的細(xì)胞靜止的細(xì)胞樣本靜止的細(xì)胞樣本 數(shù)量大數(shù)量大數(shù)量少數(shù)量少 高速分選高速分選樣本難以再利用樣本難以再利用 細(xì)胞群體特征量分布細(xì)胞群體特征量分布揭示細(xì)胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)信息揭示細(xì)胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)信息 流式細(xì)胞儀流式細(xì)胞儀蛋白電泳蛋白電泳 多參數(shù)多參數(shù)單參數(shù)單參數(shù) 量化的分布量化的分布平均值平均值 容易檢測各個(gè)參數(shù)間的容易檢測各個(gè)參數(shù)間的 相關(guān)性相關(guān)性 不容易不容易 三、 流式細(xì)胞儀可檢測到的細(xì)胞參數(shù) 顆粒度顆粒度 細(xì)胞大小細(xì)胞大小 =前向角散射光（前向角散

15、射光（FSCFSC）細(xì)胞相對大小及其表面積細(xì)胞相對大小及其表面積 =側(cè)向角散射光（側(cè)向角散射光（SSCSSC）細(xì)胞顆粒度及細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞器的細(xì)胞顆粒度及細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞器的 相對復(fù)雜性相對復(fù)雜性 三三 數(shù)據(jù)處理及數(shù)據(jù)處理及流式報(bào)告 FSC SSC FL1 FL2 FL3 對數(shù)對數(shù) 線性線性 線性線性 線性線性 對數(shù)對數(shù) 脈沖處理，模數(shù)轉(zhuǎn)換 光信號 電信號 記錄數(shù)據(jù)，顯示結(jié)果 （面積，峰高，寬度） 圖中100101（M1）為陰性細(xì)胞，101以上的（M2）為陽性細(xì)胞 六）細(xì)胞內(nèi)鈣離子測定六）細(xì)胞內(nèi)鈣離子測定 1 110106 6/ml/ml的細(xì)胞懸液，的細(xì)胞懸液， 加入終濃度為加入終濃度為1-5mol/ml

16、 Fluo-3/AM1-5mol/ml Fluo-3/AM，充分混勻，充分混勻， 室溫避光作用室溫避光作用6060分鐘。分鐘。 以以HEPESHEPES緩沖的緩沖的HanksHanks平衡鹽溶液洗三次，重懸于平衡鹽溶液洗三次，重懸于 0.5ml0.5ml同樣的溶液，上流式細(xì)胞儀檢測。同樣的溶液，上流式細(xì)胞儀檢測。 根據(jù)報(bào)告中給出的樣品熒光強(qiáng)度計(jì)算細(xì)胞內(nèi)鈣離子根據(jù)報(bào)告中給出的樣品熒光強(qiáng)度計(jì)算細(xì)胞內(nèi)鈣離子 的濃度。的濃度。 M1陰性界限劃分完全是根據(jù)陰性對照！如下圖：紅色部分代表陰性對照，即： 所檢測的物質(zhì)在陰性組中的基礎(chǔ)表達(dá)量，可以理解為背景、靜息狀態(tài)下、基礎(chǔ) 水平、未受刺激時(shí)等。藍(lán)色部分即陽性組，也就是接受刺激后，功能狀態(tài)下、 藥物作用后等。 六六. 分選：分選： 488 nm laser +- Fluorescenc