植物基因的克隆與轉(zhuǎn)化-3-轉(zhuǎn)基因植物中報告基因的檢測方法

1、植物基因的克隆與轉(zhuǎn)化3轉(zhuǎn)基因植物中報告基因的檢測方法科技知識講座植物基因的克隆與轉(zhuǎn)化(3)轉(zhuǎn)基因植物中報告基因的檢測方法李成云(云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所,昆明650223) 檢測轉(zhuǎn)基因植物有許多方法。根據(jù)檢測的基因功能來劃分,可分為調(diào)控基因(包括啟動子、終止子等)檢測法、標記基因檢測法及目的基因直接檢測法。根據(jù)檢測的不同階段區(qū)分,有dna檢測法,rna檢測法及蛋白質(zhì)檢測法。dna檢測法只能檢測到外源基因是否已經(jīng)整合到植物基因組中,而后兩種檢測方法檢測到的是外源基因是否能在受體植物中表達;根據(jù)rna檢測法得到的結(jié)果可判定外源基因是否轉(zhuǎn)錄,蛋白質(zhì)檢測法則可檢測出外源基因是否翻譯。還可根據(jù)檢測

2、所用的具體方法劃分,有pcr檢測法、化學(xué)組織檢測法、酶聯(lián)免疫吸附法、s onth2 ern雜交法、nouthern雜交法、western雜交法及生物測定檢測法等。但這些劃分也并非是絕對的,如用pcr既可檢測調(diào)控基因,也可檢測標記基因和目的基因。其中較為常見及簡便的方法是報告基因檢測法,這些基因一般編碼一個特殊的酶,這些酶所催化的反應(yīng)很容易用普通的生化反應(yīng)檢測出來。而在正常的非轉(zhuǎn)基因植物中,這些酶及其所催化的反應(yīng)幾乎完全不存在。目前常用的報告基因主要有卡那霉素抗性基因(npt-),-葡萄苷酶基因(g us),熒光素酶基因,胭脂堿和章魚堿合成酶基因,氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶基因(cat基因),除草劑抗性基

3、因(pat),二氫葉酸還原酶基因(dhfr)等。這些基因由于其檢測簡單方便,在大多數(shù)植物中背景小而得到廣泛應(yīng)用。本文對這些報告基因的檢測原理及方法作一簡要介紹。 npt-基因的檢測:抗卡那霉素基因編碼新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶(npt-),是一個小分子量的酶(分子量為25000),它由轉(zhuǎn)座子tn5編碼,催化許多氨基酸糖苷類的磷酸化反應(yīng),諸如新霉素、卡那霉素、慶大霉素和g418等。這個反應(yīng)將atp的-磷酸基轉(zhuǎn)到抗生素分子上,從而阻止了它們的靶位點核糖體的相互作用,起到解毒作用。在轉(zhuǎn)基因植物、動物和原核生物中, npt-基因廣泛地被作為選擇標記,用來研究基因的表達及其調(diào)節(jié)。在含蛋白酶抑制劑的緩沖液中研磨轉(zhuǎn)化

4、的植物材料,制取細胞的提取物。將提取物點在非變性的聚丙烯酰胺凝膠上以避免酶的不可逆變性。電泳后,將膠從膠槽中取出,放在反應(yīng)緩沖液里平衡,然后在聚丙烯酰胺凝膠上面注入一層含卡那霉素和(-32p) atp底物的瓊脂糖固定。npt-酶接觸底物后,酶促反應(yīng)在凝膠夾層中進行并得到具有放射性的磷酸卡那霉素。通過s outhern轉(zhuǎn)移將磷酸化的卡那霉素轉(zhuǎn)移到磷酸纖維素濾紙上?；痉肿涌敲顾睾土姿峥敲顾乜梢越Y(jié)合在濾紙上,atp則不能。經(jīng)過洗滌除去背景的atp。通過放射自顯影顯示出放射性的卡那霉素,從而確定在聚丙烯酰胺凝膠上哪些條帶上的蛋白質(zhì)具有npt-的活性。進一步的定量分析可以將濾紙上反映出npt-活性

5、的條帶切下用閃爍計數(shù)器進行測量。g us基因的檢測: e.coli-葡萄糖苷酸酶的編碼序列已經(jīng)發(fā)展成為轉(zhuǎn)化植物的報告基因系統(tǒng)。-葡萄糖苷酸酶是一個水解酶。采用一些商業(yè)上提供的特種-葡萄糖苷酸酶作為底物,其反應(yīng)產(chǎn)物可用分光光532000年第6期 云南農(nóng)業(yè)科技 度、熒光(靈敏度較分光光度檢測法為高)和組織化學(xué)(該方法可觀察到外源基因在特點器官、組織,甚至單個細胞內(nèi)的表達情況,它催化的底物為x-gluc,產(chǎn)物為藍色化合物)的方法檢測。-葡萄糖苷酸酶的基因已經(jīng)被克隆和測序,并編碼穩(wěn)定的酶,這個酶具有令人滿意的性質(zhì),可以用來進行嵌合基因的構(gòu)建及分析,它提供的嵌合基因系統(tǒng)很容易得到好的質(zhì)量和高的靈敏度。尤

6、其在組織化學(xué)分析中應(yīng)用這個標記基因,可以判定嵌合基因在不同細胞類型、器官和發(fā)育階段的活性定位。由于絕大多數(shù)植物沒有檢測到葡萄糖苷酸酶的背景活性,因此這個基因被廣泛應(yīng)用于基因調(diào)控的研究中。 熒光素酶基因檢測系統(tǒng):熒光素酶基因是一種動物蛋白基因,目前研究較多的是熒光蟲熒光素酶及細菌產(chǎn)生的熒光素酶。熒光素酶催化的底物是6-羥基喹啉類,在鎂離子、atp及氧的作用下酶使底物脫羧,生成激活態(tài)的氧化熒光素,發(fā)射光子后,轉(zhuǎn)變?yōu)槌B(tài)的氧化熒光素。由于這類酶的活性不需要轉(zhuǎn)錄后修飾,無二硫鍵,不需要輔酶因子和結(jié)合金屬,因此幾乎可以在任何宿主細胞中表達。熒光素酶基因作為一個報告基因還有一個優(yōu)點,即檢測的靈敏度高,檢測

7、迅速而且操作方便,對于研究低水平表達的基因有較大的意義。由于生物中普遍缺少內(nèi)源熒光,因此該基因幾乎不存在背景干擾問題。熒光素酶與反應(yīng)底物混合后所產(chǎn)生的熒光持續(xù)數(shù)秒到數(shù)分鐘即消失。檢測需要閃爍計數(shù)器和熒光計。熒光素酶的可檢測濃度在理想狀況下少于10-20m ol/l。胭脂堿和章魚堿檢測:冠癭堿合成酶基因存在于農(nóng)桿菌t i質(zhì)?；騬i質(zhì)粒上,該基因與t i質(zhì)粒的致瘤作用無關(guān),故在構(gòu)建載體時,有時將該基因保留作為報告基因使用。該基因的啟動子是真核性的,在農(nóng)桿菌中該基因并不表達,整合到植物染色體上后即行表達,編碼與冠癭堿合成有關(guān)的酶,催化冠癭堿合成。目前已發(fā)現(xiàn)的催化冠癭堿合成的酶主要有兩種,一種是胭脂堿

8、合成酶,另一種是章魚堿合成酶。其檢測原理是通過紙電泳分析篩選出存在胭脂堿和章魚堿的轉(zhuǎn)化植物材料。將植物材料直接擠壓在電泳圖譜紙上,進行電泳。在電場作用下,胭脂堿和章魚堿可以同正常組織中含有的精氨酸分離開,用菲醌這一敏感的熒光染料進行染色,即可進行觀察。cat基因(即氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶基因)的檢測:氯霉素最早是從放線菌中分離出來的抗菌素,它能夠選擇性地與原核細胞50s 亞基或真核細胞線粒體核糖體大亞基結(jié)合,抑制蛋白質(zhì)生物合成。cat基因編碼氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶,該酶催化乙酰c oa轉(zhuǎn)向氯霉素形成乙?；a(chǎn)物,乙?；说穆让顾夭辉倬哂新让顾氐幕钚?失去干擾蛋白質(zhì)合作的作用。真核細胞不具有氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶基

9、因,無該酶的內(nèi)源性活性,因而cat基因可以作為真核細胞轉(zhuǎn)化的標記基因及報告基因,cat基因轉(zhuǎn)化的植物細胞能夠產(chǎn)生對氯霉素的抗性,而非轉(zhuǎn)基因植物則不具有這種抗性。cat基因的活性可以通過反應(yīng)底物乙酰c oa的減少或反應(yīng)產(chǎn)物乙?；让顾丶斑€原型c oash的生產(chǎn)來測定,目前常用的方法有硅膠g薄層層析法及dt nb分光光度計法。cat基因不僅用來檢測外源基因是否轉(zhuǎn)化成功,而且在研究轉(zhuǎn)化的外源基因在植物體內(nèi)的表達調(diào)控中起重要作用,是目前研究基因表達調(diào)控最常用的報告基因之一。pat基因的檢測:pat基因為抗除草劑基因,它編碼ppt乙酰轉(zhuǎn)移酶(pat)。ppt是一種谷氨酸結(jié)構(gòu)類似物,能競爭地抑制植物體內(nèi)谷

10、氨酰胺合成酶(g s)的活性。當ppt 存在時,g s活性被抑制,細胞內(nèi)nh+4積累,細胞中毒而死亡。pat基因編碼的ppt 乙酰轉(zhuǎn)移酶可以催化乙酰基有乙酰c oa分子上轉(zhuǎn)移到ppt分子的游離氨基上,使ppt 乙?；?乙酰化了的ppt失去對g s的抑制63云南農(nóng)業(yè)科技 2000年第6期 國外養(yǎng)魚新法種種 變溫養(yǎng)魚法莫斯科農(nóng)業(yè)大學(xué)的試驗養(yǎng)殖場,水生物專家們經(jīng)過試驗,成功地開發(fā)出變換水溫養(yǎng)魚的新方法,可在不改變魚飼料的前提下,大大加快魚苗的生長速度。這種方法是在育魚苗的池中,安裝一個調(diào)控加熱器,通過對池水加熱,使池水溫度略高于普通水溫110115,并在停止加溫、水溫降至正常后,再繼續(xù)進行加熱。這樣

11、,依次循環(huán),使池水的水溫經(jīng)常在110115的范圍內(nèi)變化,從而使魚苗的生產(chǎn)速度加快40%左右,同時,可使魚苗出水后對水溫的適應(yīng)性更強,死亡率降低2%3%。 激素養(yǎng)魚法加拿大的生物學(xué)家埃德瓦爾特多納爾德森,將從小雞和小牛身上提取的生長激素荷爾蒙,加入到鮭魚魚苗的飼料中去,可使魚的生長速度快1倍,日增重指數(shù)可達到2138%,而使用普通飼料,日增重指數(shù)僅為1148%。美國科學(xué)家還從魚身上提取生長激素,植入另一條魚,可使植入生長激素的魚體內(nèi),產(chǎn)生比原來多1倍的生長激素,從而使魚的生長速度大大地加快,日增重可提高50%以上。咸水養(yǎng)魚法新加坡國立大學(xué)的科學(xué)家,采用鹽度為3%的淡咸水飼養(yǎng)鯉魚仔魚,可明顯地提高

12、鯉魚仔魚的成活率、生育率和生長率。如果在淡咸水中飼養(yǎng)的鯉魚仔魚的飼料里,再加入110-8的甲狀尿素,制成微型膠囊后飼喂,還可增進其食欲,加快其生長速度。音樂養(yǎng)魚法日本的許多養(yǎng)魚場讓魚聽音樂,以促進魚生長。在此基礎(chǔ)上,還開發(fā)出便于捕獲的新的音樂養(yǎng)魚法。這種新的音樂養(yǎng)魚法,就是在魚卵人工孵化以后,每次喂幼魚餌料時,都伴放一種音樂,使幼魚形成聽到這種音樂,就到進食地點進食的習(xí)慣。將幼魚放在大面積魚池進行飼養(yǎng)后,每次投食,繼續(xù)伴放這種音樂,使魚集中到進食地點。所以,到捕撈成魚時,只要一伴放這種音樂,魚就和往常一樣,到進食地點來,得以順利地將其捕撈。選擇養(yǎng)魚法美國佛羅里達州泊爾梅特水產(chǎn)公司的專家,采用選

13、擇性繁殖技術(shù),經(jīng)過8年時間, 28代的選擇性繁殖,將稱為迪拉彼亞的魚,培育成一種無刺的肉用魚。這種無刺的肉用魚,只有一根脊椎,魚刺已全部退化,食用時肉中不再帶刺。其成魚的個體重約兩磅,肉味鮮美。一尾雌魚一年可繁魚苗約6000尾。目前,這種無刺的肉用魚,已經(jīng)推廣到美國的35個州和一些外國的水產(chǎn)公司進行養(yǎng)殖。揚州市寶應(yīng)葉挺東路17號信息部(225800)何人作用,因而轉(zhuǎn)化了pat基因的植物表現(xiàn)出對除草劑ppt的抗性。目前ppt來源有兩種:一種是化學(xué)合成的,稱為basta;另一種是通過微生物發(fā)酵產(chǎn)生的含有ppt的三肽,稱為bialaphose。pat基因也有兩種,一種是來自streptomyces

14、hygrocopicus的bar基因(因其抗basta而得名),另一種是來自s.viri2 dochrgtnes的pat基因,bar和pat都編碼pat。bar基因可以作為轉(zhuǎn)化體篩選標記,又因其檢測的靈敏度高,所以也用作報告基因。bar基因的表達產(chǎn)物pat活性測定方法有硅膠g薄層層析法及dt nb比色分析法。dhfr基因的檢測:dhfr基因又稱氨甲喋呤抗性基因,編碼二氫葉酸還原酶。二氫葉酸還原酶在dna生物合成中起重要作用。氨甲喋呤與二氫葉酸結(jié)構(gòu)類似,競爭性抑制二氫葉酸還原酶活性。植物細胞的二氫葉酸還原酶對氨甲喋呤極為敏感。以氨甲喋呤作為選擇劑篩選轉(zhuǎn)化細胞時,非轉(zhuǎn)化的植物細胞在含有一定濃度氨甲喋呤的培養(yǎng)基上不能正常生長,而轉(zhuǎn)化細胞中