分子生物學(xué)教案

1、-作者xxxx-日期xxxx分子生物學(xué)教案【精品文檔】第一章 緒論重點：1. 分子生物學(xué)的基本含義 2. DNA的發(fā)現(xiàn) 3. 分子生物學(xué)與其他學(xué)科的關(guān)系難點：DNA的發(fā)現(xiàn)分子生物學(xué)的基本含義分子生物學(xué)是從分子水平研究生命本質(zhì)為目的的一門新興邊緣學(xué)科，它以核酸和蛋白質(zhì)等生物大分子的結(jié)構(gòu)及其在遺傳信息和細胞信息傳遞中的作用為研究對象，是當(dāng)前生命科學(xué)中發(fā)展最快并正在與其它學(xué)科廣泛交叉與滲透的重要前沿領(lǐng)域。分子生物學(xué)的發(fā)展為人類認識生命現(xiàn)象帶來了前所未有的機會，也為人類利用和改造生物創(chuàng)造了極為廣闊的前景。所謂在分子水平上研究生命的本質(zhì)主要是指對遺傳、 生殖、生長和發(fā)育等生命基本特征的分子機理的闡明，從

2、而為利用和改造生物奠定理論基礎(chǔ)和提供新的手段。這里的分子水平指的是那些攜帶遺傳信息的核酸和在遺傳信息傳遞及細胞內(nèi)、細胞間通訊過程中發(fā)揮著重要作用的蛋白質(zhì)等生物大分子。這些生物大分子均具有較大的分子量，由簡單的小分子核苷酸或氨基酸排列組合以蘊藏各種信息，并且具有復(fù)雜的空間結(jié)構(gòu)以形成精確的相互作用系統(tǒng)，由此構(gòu)成生物的多樣化和生物個體精確的生長發(fā)育和代謝調(diào)節(jié)控制系統(tǒng)。闡明這些復(fù)雜的結(jié)構(gòu)及結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系是分子生物學(xué)的主要任務(wù)。1.1 引言現(xiàn)代分子生物學(xué)研究的目標是要在分子水平上掌握細胞的功能并揭示生命是本質(zhì)。1.1.1 創(chuàng)世說與進化論多少年來，人們常常會反復(fù)提出下面3個與生命和一切生物學(xué)現(xiàn)象有關(guān)的問

3、題：（1）生命是怎樣起源的？（2）為什么“有其父必有其子”？（3）動、植物是怎樣從一個受精卵發(fā)育而來的？對這些問題的回答：創(chuàng)世說：西方：上帝先創(chuàng)造了世間萬物，后來又創(chuàng)造了男人亞當(dāng)，再從亞當(dāng)身上抽一根肋骨，這就成了女人夏娃，亞當(dāng)和夏娃繁衍了人類。中國：女媧團土造人進化論：1859年，偉大的英國生物學(xué)家達爾文（Charles Darwin）發(fā)表了著名的物種起源一書，確立了進化論的觀點。正是達爾文的生物進化學(xué)說，打破了上帝造人的傳統(tǒng)觀念，改變了社會對人類在整個世界中的地位的看法，極大地推動了人類思想的發(fā)展。達爾文用大量事實證明“物竟天擇，適者生存”的進化論思想，他認為世界上的一切生物都是可變的，并預(yù)

4、言從低級到高級的變化中必定有過渡物種存在。他指出物種的變異是由于大自然的環(huán)境和生物群體的生存競爭造成的，徹底否定了上帝創(chuàng)造萬物的舊思想，推翻了物種不變的神話，使生物學(xué)真正邁入實證自然科學(xué)的行列。1.1.2 細胞學(xué)說早期生物科學(xué)家的另一大貢獻是提出細胞理論（Cell Theory）。17世紀末，荷蘭籍顯微鏡專家Leeuwenhoek成功制作了世界上第一架顯微鏡。大約與Leeuwenhoek同時代的Hooke，第一次用“細胞”這個概念來形容組成軟木的最基本單元。動、植物的基本單元是細胞，這是19世紀三大發(fā)現(xiàn)之一的細胞學(xué)說的核心。建立這一學(xué)說的是德國植物學(xué)家Schleiden和動物學(xué)家Schwann

5、。1.1.3 經(jīng)典的生物化學(xué)和遺傳學(xué)現(xiàn)代生物學(xué)的兩大支柱：生物化學(xué)和遺傳學(xué)進化論和細胞學(xué)說相結(jié)合，產(chǎn)生了作為實驗科學(xué)之一的現(xiàn)代生物學(xué)，而以研究動、植物的遺傳變異規(guī)律為目標的遺傳學(xué)和以分離純化、鑒定細胞內(nèi)含物質(zhì)為目標的生物化學(xué)則是這一學(xué)科的兩大支柱。生物化學(xué)家Buchner第一個實現(xiàn)了用酵母無細胞液和葡萄糖進行氧化反應(yīng)，生成乙醇，證明化學(xué)物質(zhì)的轉(zhuǎn)換并不需要完整的細胞而僅僅需要細胞中的某些成分。蛋白質(zhì)是生活細胞中所有化學(xué)反應(yīng)的執(zhí)行者和催化劑。生物化學(xué)從一開始就執(zhí)行著雙重使命，首先，分析細胞的組成成分；其次，弄清楚這些物質(zhì)與細胞內(nèi)生命現(xiàn)象的聯(lián)系。孟德爾通過豌豆實驗，總結(jié)出生物遺傳的兩條基本規(guī)律基因分

6、離規(guī)律和自由組合規(guī)律，被公認為經(jīng)典遺傳學(xué)的奠基人。在孟德爾遺傳學(xué)的基礎(chǔ)上，美國著名的遺傳學(xué)家Morgan又提出了基因?qū)W說。當(dāng)所研究的兩個基因位于同一染色體上而距離又較近時，Morgan的連鎖遺傳規(guī)律起主導(dǎo)作用；而當(dāng)所研究的兩個基因位于不同染色體上時，孟德爾的自由組合規(guī)律起主導(dǎo)作用。1.1.4 DNA的發(fā)現(xiàn)直到1953年Watson 和Crick提出DNA雙螺旋模型之前，人們對于基因的理解仍然是抽象的、概念化的，缺乏準確的物質(zhì)內(nèi)容。首次證明DNA是遺傳物質(zhì)的是Avery的細菌轉(zhuǎn)化實驗。圖1-1 DNA是轉(zhuǎn)化源早在1928年，英國科學(xué)家Griffith等人就發(fā)現(xiàn)，肺炎鏈球菌使小鼠死亡的原因是引起肺

7、炎。細菌的毒性是由細胞表面莢膜中的多糖決定的。具有光滑外表的S型肺炎鏈球菌因為帶有莢膜而能使小鼠發(fā)病，具有粗糙外表的R型肺炎鏈球菌因為沒有莢膜而失去致病力，（莢膜多糖使細菌免受動物白細胞的攻擊）。首次用實驗證明基因就是DNA分子的是美國著名的微生物學(xué)家Avery。他和同事首先將光滑型致病菌（S型）燒煮殺滅活性以后在侵染小鼠，發(fā)現(xiàn)這些死細菌自然喪失了致病力。再用活的粗糙型細菌（R型）來侵染小鼠，也不能使之發(fā)病，因為粗糙型細菌無致病力。然而，當(dāng)他們將燒煮殺死的S型細菌和活的R型細菌混合再感染小鼠時，小鼠死亡。解剖死鼠，發(fā)現(xiàn)有大量活的S型細菌（而不是R型）。他們推測，死細菌中的某一成分轉(zhuǎn)化源將無致病

8、力的細菌轉(zhuǎn)化成致病菌。10多年后，實驗證明，DNA就是轉(zhuǎn)化源。死細菌DNA指導(dǎo)了這一可遺傳的轉(zhuǎn)化，從而導(dǎo)致了小鼠死亡。再次證明DNA是遺傳物質(zhì)的噬菌體侵染細菌的實驗。圖1-2噬菌體專門寄生在細菌體內(nèi)，它的頭、尾外部都是由蛋白質(zhì)組成的外殼，頭內(nèi)主要是DNA。噬菌體侵染細菌的過程可以分為以下5個步驟：1. 噬菌體用尾部的末端（基片、尾絲）吸附在細菌表面，2. 噬菌體通過尾軸把DNA全部注入細菌細胞內(nèi)，蛋白質(zhì)外殼則留在細胞外。3. 噬菌體的DNA一旦進入細菌體內(nèi)，它就能利用細菌的生命過程合成自身的DNA和蛋白質(zhì)。4. 新合成的DNA和蛋白質(zhì)能組裝成許許多多與親代完全相同的子代噬菌體。5. 子代噬菌體

9、由于細菌的解體而被釋放出來，再去侵染其他細菌。1.2 分子生物學(xué)簡史分子生物學(xué)是研究核酸、蛋白質(zhì)等生物大分子的形態(tài)、結(jié)構(gòu)特征及其重要性、規(guī)律性和相互關(guān)系的科學(xué)。1.3 分子生物學(xué)研究的內(nèi)容現(xiàn)代生物學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，所有生物體中的有機大分子都是以碳原子為核心，并以共價鍵的形式與氫、氧、氮及磷以不同的方式構(gòu)成的。不僅如此，一切生物體中的各類有機大分子都是由完全相同的單體，如蛋白質(zhì)分子中的20種氨基酸及DNA和RNA中的5種堿基組合而成，由此產(chǎn)生了分子生物學(xué)的3條基本原理：1. 構(gòu)成生物體各類有機大分子的單體在不同生物中都是相同的。2. 生物體內(nèi)一切有機大分子的建成都遵循共同的規(guī)則。3. 某一特定生物體所

10、擁有的核酸及蛋白質(zhì)分子決定了它的屬性。從表面上看，分子生物學(xué)涉獵范圍極為廣泛，研究內(nèi)容似乎包羅萬象。事實上，它所研究的不外乎以下四個方面：1. DNA重組技術(shù)2. 基因表達調(diào)控3. 生物大分子的結(jié)構(gòu)和功能4. 基因組、功能基因組與生物信息學(xué)分子生物學(xué)與其他學(xué)科的關(guān)系分子生物學(xué)是由生物化學(xué)、生物物理學(xué)、遺傳學(xué)、微生物學(xué)、細胞學(xué)、以至信息科學(xué)等多學(xué)科相互滲透、綜合融會而產(chǎn)生并發(fā)展起來的，凝聚了不同學(xué)科專長的科學(xué)家的共同努力。它雖產(chǎn)生于上述各個學(xué)科，但已形成它獨特的理論體系和研究手段，成為一個獨立的學(xué)科。生物化學(xué)與分子生物學(xué)關(guān)系最為密切。兩者同在我國教委和科委頒布的一個二級學(xué)科中，稱為“生物化學(xué)與分

11、子生物學(xué)”，但兩者還是有區(qū)別的。生物化學(xué)是從化學(xué)角度研究生命現(xiàn)象的科學(xué)，它著重研究生物體內(nèi)各種生物分子的結(jié)構(gòu)、轉(zhuǎn)變與新陳代謝。傳統(tǒng)生物化學(xué)的中心內(nèi)容是代謝，包括糖、脂類、氨基酸、核苷酸、以及能量代謝等與生理功能的聯(lián)系。分子生物學(xué)則著重闡明生命的本質(zhì)-主要研究生物大分子核酸與蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能、生命信息的傳遞和調(diào)控。國際生物化學(xué)學(xué)會和中國生物化學(xué)學(xué)會現(xiàn)均已改名為國際生物化學(xué)與分子生物學(xué)學(xué)會和中國生物化學(xué)與分子生物學(xué)學(xué)會。細胞生物學(xué)與分子生物學(xué)關(guān)系也十分密切。傳統(tǒng)的細胞生物學(xué)主要研究細胞和亞細胞器的形態(tài)、結(jié)構(gòu)與功能。細胞作為生物體基本的構(gòu)成單位是由許多分子組成的復(fù)雜體系，光學(xué)顯微鏡和電子顯微鏡下所

12、見到的規(guī)則結(jié)構(gòu)是各種分子有序結(jié)合而形成的。探討組成細胞的分子結(jié)構(gòu)比單純觀察大體結(jié)構(gòu)能更加深入認識細胞的結(jié)構(gòu)與功能，因此現(xiàn)代細胞生物學(xué)的發(fā)展越來越多地應(yīng)用分子生物學(xué)的理論和方法。分子生物學(xué)則是從研究各個生物大分子的結(jié)構(gòu)入手，但各個分子不能孤立發(fā)揮作用，生命絕非組成成分的隨意加和或混合，分子生物學(xué)還需要進一步研究各生物分子間的高層次組織和相互作用，尤其是細胞整體反應(yīng)的分子機理，這在某種程度上是向細胞生物學(xué)的靠攏。分子細胞學(xué)或細胞分子生物學(xué)就因此而產(chǎn)生，成為人們認識生命的基礎(chǔ)。由于分子生物學(xué)涉及認識生命的本質(zhì)，它也就自然廣泛的滲透到醫(yī)學(xué)各學(xué)科領(lǐng)域中，成為現(xiàn)代醫(yī)學(xué)重要的基礎(chǔ)。在醫(yī)學(xué)各個學(xué)科中，包括生理

13、學(xué)、微生物學(xué)、免疫學(xué)、病理學(xué)、藥理學(xué)以及臨床各學(xué)科分子生物學(xué)都正在廣泛地形成交叉與滲透，形成了一些交叉學(xué)科，如分子免疫學(xué)、分子病毒學(xué)、分子病理學(xué)和分子藥理學(xué)等，大大促進了醫(yī)學(xué)的發(fā)展。1.4 分子生物學(xué)展望（自學(xué)內(nèi)容）第二章 染色體與DNA重點：1.原核生物和真核生物DNA的復(fù)制特點2. DNA的修復(fù)難點：1. DNA的修復(fù)2. DNA的轉(zhuǎn)座第四節(jié) 原核生物和真核生物DNA的復(fù)制特點一. 原核生物DNA的復(fù)制特點 大腸桿菌基因組以雙鏈環(huán)狀DNA分子的形式存在，其DNA復(fù)制的之間產(chǎn)物可形成一個，復(fù)制從定點開始雙向等速進行。1. 大腸桿菌DNA復(fù)制起始點（oriC）保守序列分布圖（圖2-21）2.

14、由大腸桿菌oriC復(fù)制起始點出引發(fā)的DNA復(fù)制過程（a）大約有20個DnaA擔(dān)保在ATP的作用下與oriC處的4個9bp保守序列相結(jié)合；（b）在HU蛋白和ATP 的共同作用下，DnaA復(fù)制起始復(fù)合物使3X13bp直接重復(fù)序列變性，形成開鏈；（c）DnaB（解鏈酶）六體分別與單鏈DNA相結(jié)合，（需要DnaC的幫助），進一步解開雙鏈。在一些重要的酶和蛋白質(zhì)的相互作用下，DNA開始復(fù)制。3. 參與DNA復(fù)制的酶和蛋白因子 （1 . ）DNA解鏈酶 （Helicase） 促使DNA在復(fù)制叉處打開雙鏈，與單鏈DNA結(jié)合，與ATP結(jié)合，分解成ADP+Pi，產(chǎn)生能量沿DNA鏈向前運動，促使DNA雙鏈解開。

15、（2）單鏈DNA結(jié)合蛋白（SSBP） 與單鏈DNA結(jié)合，防止解開的單鏈重新配對形成雙鏈或被核酸酶降解;使單鏈DNA呈伸展?fàn)顟B(tài)，無彎曲和結(jié)節(jié)，利于作為模板； SSBP可重復(fù)使用。原核生物的SSBP具有協(xié)同效應(yīng)。 SSBP只保持單鏈的存在，并不能起解鏈的作用。（3）拓撲異構(gòu)酶Topoisomerase 解開負超螺旋，并與解鏈酶 共同作用解開雙鏈。 （4）引物酶 Primase 催化引物RNA分子的合成 （5）DNA聚合酶 DNA Polymerase A.概念：是指以脫氧核苷三磷酸作為底物催化合成DNA的一類酶。 B. 特點：a. 以dNTP為前體催化合成DNA； b. 需要模板和引物； c. 催

16、化dNTP加到DNA鏈的3-OH端； d. 催化合成方向53 。C. 分類： DNA聚合酶 I（主要保證DNA復(fù)制的準確性） DNA聚合酶II（主要起DNA修復(fù)的作用） DNA聚合酶III（DNA復(fù)制的主導(dǎo)酶）（6）DNA連接酶 將雙鏈DNA上的切口連接起來； 主要用于岡崎片段的連接，DNA修復(fù)、重組，兩個復(fù)制單元間片段的連接。 連接雙鏈DNA的要求： 切口 3 -OH 5 -磷酸基團 需要能量 4.岡崎片段與半不連續(xù)復(fù)制由于DNA的兩條鏈為反向平行，以復(fù)制叉移動的方向為基準，一條鏈為3 5 ，其新合成的DNA鏈沿5 3 連續(xù)進行前導(dǎo)鏈 另一條鏈為5 3 ，新生的DNA鏈先合成短的岡崎片段，不

17、連續(xù)合成滯后鏈，再由DNA連接酶連接成完整的DNA鏈。 這種前導(dǎo)鏈的連續(xù)復(fù)制和滯后鏈的不連續(xù)復(fù)制稱為半不連續(xù)復(fù)制。5. 復(fù)制的引發(fā)和終止（1）引發(fā) 先由RNA聚合酶在DNA模板上合成一段RNA引物，再由DNA聚合酶從RNA引物的3 端開始合成新的DNA鏈。 滯后鏈的引發(fā)由引發(fā)體來完成。引發(fā)體由6種蛋白質(zhì)n、n 、n 、DnaB、C和 I共同組成。引發(fā)體在滯后鏈分叉的方向上移動，并在模板上斷斷續(xù)續(xù)地引發(fā)生成滯后鏈的RNA引物，再由DNA聚合酶III作用合成DNA，直到遇到下一個引物或?qū)槠螢橹埂Nase H降解RNA引物， DNA聚合酶I將缺口補齊，DNA連接酶將兩個岡崎片段連在一起形成大分

18、子DNA。（ 2.）終止 （圖2-23） 當(dāng)復(fù)制叉前移，遇到20bp重復(fù)性終止序列（Ter）時， Ter-Tus復(fù)合物能阻擋復(fù)制叉的繼續(xù)前移，等到相反方向的復(fù)制叉到達后，在拓撲異構(gòu)酶IV的作用下使復(fù)制叉解體，釋放子鏈DNA。DNA的復(fù)制特點1. 與原核生物相似（1）半保留、半不連續(xù)復(fù)制 （2）復(fù)制過程：引發(fā)延伸終止三個階段 （3）需要酶和蛋白因子2.與原核生物不同（1） 原核生物是單復(fù)制子，真核生物是多復(fù)制子（每條染色體上有多個復(fù)制起點）； （2） DNA全部復(fù)制完畢才進行第二輪復(fù)制，原核生物在第一輪復(fù)制未完成就進行第二輪復(fù)制。（3）有5種DNA聚合酶，即聚合酶、。 3.真核細胞DNA的復(fù)制調(diào)

19、控（3個水平）真核細胞的生活周期可以分為4個時期：G1、S、G2和M期。G1是復(fù)制預(yù)備期，S期是復(fù)制期，G2是有絲分裂準備期，M期為有絲分裂期。DNA復(fù)制只發(fā)生在S期。（1） 細胞生活周期水平調(diào)控（決定細胞停留在G1期 還是進入S期 ）許多外部因素和細胞因子參與限制點調(diào)控。促細胞分裂劑、致癌劑等都可以誘發(fā)細胞由G1期進入S期。一些細胞質(zhì)因子如四磷酸二腺苷和聚ADP-核糖也可誘導(dǎo)DNA復(fù)制。（2）染色體水平調(diào)控（決定不同染色體或同一染色體不同部位的復(fù)制子按一定順序在S期起始復(fù)制。這種有序復(fù)制的機理還不清楚。（3）復(fù)制子水平調(diào)控（決定復(fù)制的起始與否）這種調(diào)控從單細胞到多細胞生物是高度保守的。第五節(jié)

20、 DNA的修復(fù)1. 錯配修復(fù)該系統(tǒng)識別母鏈的依據(jù)來自Dam甲基化酶，它能使位于5 GATC序列中腺苷酸的N6位甲基化。一旦復(fù)制叉通過復(fù)制起使點，母鏈就會在幾秒至幾分鐘內(nèi)被甲基化。此后，只要兩條DNA鏈上出現(xiàn)堿基配對錯誤，錯配修復(fù)系統(tǒng)就會根據(jù)“保存母鏈，修正子鏈”的原則，找出錯誤堿基所在的DNA鏈，并在對應(yīng)于母鏈甲基化腺苷酸上游鳥苷酸的5 位置切開子鏈，再根據(jù)錯誤堿基相對于DNA切口的方向啟動修復(fù)，合成新的子鏈片段。 （圖2-25）（a）發(fā)現(xiàn)堿基錯配； （b）在水解ATP的作用下，MutS，MutL與堿基錯配位點的DNA雙鏈相結(jié)合；（c）MutS-MutL在DNA雙鏈上移動，發(fā)現(xiàn)甲基化DNA后由

21、MutH切開非甲基化的子鏈。（圖2-26）當(dāng)錯配堿基位于切口3下游端時，在MutS-MutL、解鏈酶II、DNA外切酶或RecJ核酸沒的作用下，從錯配堿基3下游端開始切除單鏈DNA直到原切口，并在pol III和SSB的作用下合成新的子鏈片段。若錯配堿基位于切口5端上游時，則在DNA外切酶I或X的作用下，從錯配堿基位5上游端開始切除單鏈DNA直到原切口，再合成新的子鏈片段。2.堿基切除修復(fù) AP位點：由糖苷水解酶切除受損核苷酸上的N- -糖苷鍵，在DNA鏈上形成的去嘌呤或去嘧啶位點。 DNA分子中一旦產(chǎn)生了AP位點， AP核酸內(nèi)切酶就會把受損核苷酸的糖苷磷酸鍵打開，并移去包括AP位點核苷酸在內(nèi)

22、的小片段DNA，由DNA聚合酶I合成新的片段，最終由DNA連接酶把兩者連成新的被修復(fù)的DNA鏈。3.核苷酸切除修復(fù) 當(dāng)DNA鏈上相應(yīng)位置的核苷酸發(fā)生損傷，導(dǎo)致雙鏈之間無法形成氫鍵，則由核苷酸切除修復(fù)系統(tǒng)負責(zé)修復(fù)。損傷發(fā)生后，首先由DNA切割酶在已損傷的核苷酸5 和3 分別切開磷酸糖苷鍵，產(chǎn)生一個由1213（原）或2729（真）個核苷酸的小片段，移去小片段后由DNA聚合酶I(原核)或（真核）合成新的片段，并由DNA連接酶完成最后修復(fù)。（圖2-28）在原核生物中，DNA切割酶從受損核苷酸3 端的第5位和5 端的第8位切開磷酸糖苷鍵。在人類細胞中，DNA切割酶從受損核苷酸3 端的第6位和5 端的第2

23、2位切開磷酸糖苷鍵。4. DNA的直接修復(fù) 是在DNA光解酶的作用下把在光下或紫外光照射形成的胸腺嘧啶二聚體等還原成單體的過程。第六節(jié) DNA的轉(zhuǎn)座DNA的轉(zhuǎn)座,或稱移位，是由可移位因子介導(dǎo)的遺傳物質(zhì)重排現(xiàn)象。與DNA的同源重組相比，頻率較低，但有重要的生物學(xué)意義，可以解釋基因缺失或倒轉(zhuǎn)現(xiàn)象，可被用于構(gòu)建新的突變體。1. 轉(zhuǎn)座子（Transposon ，Tn） 能夠進行復(fù)制并將一個拷貝插入新位點的DNA序列。（能在基因組中移動的DNA序列叫轉(zhuǎn)位因子 ）由于它可以從染色體基因組上的一個位置轉(zhuǎn)移到另一個位置,甚至在不同的染色體之間躍遷所以又稱跳躍基因（jump-gene）。最簡單的轉(zhuǎn)座子不含任何宿

24、主基因而常被稱為插入序列（insertional sequence，IS）。轉(zhuǎn)座子常常被定位特定的基因中，造成該基因突變。存在： 原核生物、植物中廣泛存在，少數(shù)存在于動物中。2. 轉(zhuǎn)位因子的結(jié)構(gòu)特點：（圖2-31） （1）兩端存在末端重復(fù)序列（TIR），是轉(zhuǎn)位過程中至關(guān)重要的結(jié)構(gòu)；（2）絕大多數(shù)的轉(zhuǎn)位因子含有開放閱讀框，（ORF），編碼一個轉(zhuǎn)位酶，促進轉(zhuǎn)位因子的轉(zhuǎn)位；（3）受體DNA在接受插入DNA后，在插入序列的兩側(cè)形成同向重復(fù)序列； （4）受體（靶序列）沒有確定的特異性，但趨向于一個“熱點”區(qū)域即所謂“區(qū)域性優(yōu)先”。 取決于DNA雙螺旋狀態(tài)，或DNA-PRO結(jié)合狀態(tài)。IS序列都是一些小的D

25、NA片段，末端具有倒置重復(fù)序列，轉(zhuǎn)座時往往復(fù)制宿主靶位點一小段（4-15bp）DNA，形成位于IS序列兩端的正向重復(fù)。3. 轉(zhuǎn)位機制:轉(zhuǎn)座子的復(fù)制靶序列的斷裂及倍生同向重復(fù)序列轉(zhuǎn)位是一種復(fù)制過程。4. 轉(zhuǎn)座作用的遺傳學(xué)效應(yīng)（1） 轉(zhuǎn)座引起插入突變各種IS、Tn轉(zhuǎn)座子都可以引起插入突變。如果插入位于某操縱子的前半部分，就可能造成極性突變，導(dǎo)致該操縱子后半部分結(jié)構(gòu)基因表達失活。（2） 轉(zhuǎn)座產(chǎn)生新的基因如果轉(zhuǎn)座子上帶有抗藥性基因，它一方面造成靶DNA序列上的插入突變，同時也使這個位點產(chǎn)生抗藥性。（3） 轉(zhuǎn)座產(chǎn)生染色體畸變（2-35）當(dāng)復(fù)制性轉(zhuǎn)座發(fā)生在宿主DNA原有位點附近時，往往導(dǎo)致轉(zhuǎn)座子兩個拷貝之

26、間的同源重組，引起DNA的缺失或倒位。若同源重組發(fā)生在兩個正向重復(fù)之間，就導(dǎo)致宿主染色體DNA缺失；若重組發(fā)生在兩個反向重復(fù)轉(zhuǎn)座區(qū)之間，則引起染色體DNA倒位。（4）轉(zhuǎn)座引起生物進化由于轉(zhuǎn)座作用，使一些原來在染色體上相距甚遠的基因整合到一起，構(gòu)建成一一操縱子或表達單元，也可能產(chǎn)生一些具有新的生物學(xué)功能的基因和新的蛋白質(zhì)分子。5. 真核生物中的轉(zhuǎn)座子（1）玉米中的轉(zhuǎn)位因子 分兩類： 自主轉(zhuǎn)位因子本身可以轉(zhuǎn)位；非自主轉(zhuǎn)位因子本身不能轉(zhuǎn)位，但在自主 因子存在下可以轉(zhuǎn)位。l 最早于20世紀40年代由美國冷泉港實驗室B.Mc Clintock發(fā)現(xiàn)玉米的顏色變化與某些基因的關(guān)啟有關(guān)，而這些基因的關(guān)啟可能與

27、某些因子的控制有關(guān)，而這些因子在基因組中是可以移動的控制因子。當(dāng)時這一發(fā)現(xiàn)并沒有引起人們的注意； l直到70年代Shapiro發(fā)現(xiàn)大腸桿菌的乳糖操縱子的突變是由于插入了一段序列，后來又發(fā)現(xiàn)了其它轉(zhuǎn)位因子后，McClintock的發(fā)現(xiàn)才被重視； l1983年Clintock榮獲諾貝爾生物學(xué)醫(yī)學(xué)獎。第五章 分子生物學(xué)技術(shù)重點：1. DNA操作技術(shù)2. 基因克隆的主要載體系統(tǒng)難點：1. DNA操作技術(shù)2. 基因克隆的主要載體系統(tǒng)課時分配：5學(xué)時第一節(jié) 重組DNA技術(shù)發(fā)展史上的重大事件1. 基因操作 gene manipulation 主要包括DNA分子的切割與連接、核酸分子雜交、凝膠電泳、細胞轉(zhuǎn)化、

28、核酸序列分析以及基因的人工合成、定點突變和PCR擴增等，是分子生物學(xué)研究的核心技術(shù)。2. 基因工程 genetic engineering 將外源DNA，通過具有復(fù)制能力的載體分子形成重組DNA分子，導(dǎo)入受體細胞，進行持久穩(wěn)定的復(fù)制和表達，使受體細胞產(chǎn)生外源DNA或蛋白質(zhì)。是核酸操作技術(shù) 的一部分。3. 二十世紀分子生物學(xué)的三大成就（1）20世紀40年代確定了遺傳信息的攜帶者，即基因的分子載體是DNA而不是蛋白質(zhì)，解決了遺傳的物質(zhì)基礎(chǔ)問題；（2）50年代提出了DNA分子的雙螺旋結(jié)構(gòu)模型和半保留復(fù)制機制，解決了自我復(fù)制和世代交替問題；（3） 50年代至60年代，相繼提出了“中心法則”和操縱子學(xué)說

29、，成功地破譯了遺傳密碼，闡明了遺傳信息的流動與表達機制。4. DNA 重組技術(shù) recombinant DNA technique 其核心是用限制性核酸內(nèi)切酶和DNA連接酶對DNA分子進行體外切割與連接。5. 重組DNA技術(shù)史上的主要事件1973 Cohen第一例成功的克隆實驗1978 Genentech公司 人胰島素 世界上第一種基因工程蛋白藥物 1982 第一個基因工程藥物-重組人胰島素在英、美獲準使用 1985 第一批轉(zhuǎn)基因家畜（兔、豬和羊），中國 轉(zhuǎn)基因魚1993 基因工程西紅柿在美國上市 1997 英國愛丁堡羅斯林研究所 多莉羊 1999.9 中國獲準加入人類基因組計劃.負責(zé)測定人類

30、基因組全部序列的1% 2000.6.26 科學(xué)家公布人類基因組工作草圖 2001.2.11 公布人類基因組基本信息 6. 生物技術(shù)工程：基因工程、蛋白質(zhì)工程、酶工程、細胞工程第二節(jié) DNA操作技術(shù)一. DNA的分離，提取 1. 材料的選擇：物種、組織的選擇 2. 組織勻漿：細胞分散、破碎 3. 破碎細胞： SDS表面活性劑 4. 除蛋白： 蛋白酶K、酚、氯仿抽提 5. 除RNA： RNA酶 6. DNA回收： 乙醇、異丙醇沉淀7. 純度鑒定： （1） 電泳：常用瓊脂糖凝膠電泳，也用聚丙烯酰胺凝膠電泳，用溴化乙錠（EB）染色，紫外燈下檢測。 檢測量可達ug，ng級 檢測信息：DNA的有無 DNA

31、的大小 構(gòu)象 純度 （2）純度檢測： 紫外吸收法（260nm） OD260 - 決定DNA的量 OD280 - 決定Protein的量 1.8 OD260/280 純樣品 1.8 不純 2.0 RNA（純）二. 限制性內(nèi)切酶圖譜 （1）限制性內(nèi)切酶的發(fā)現(xiàn) 阿爾伯(Arber)、史密斯(Smith)和內(nèi)森斯(Nathans)，獲1978年諾貝爾生理學(xué)和醫(yī)學(xué)獎。1967年，Smith，分析限制性內(nèi)切酶的識別和切割序列，認為它由5-6個堿基組成 原因：限制性酶將T7DNA切成平均長度為1000堿基的片段。 識別和切割序列：中心對稱的回文結(jié)構(gòu)。 限制性酶：Hind Nathans：用限制性酶切割猴子S

32、V40DNA，DNA測序。（2）限制性內(nèi)切酶的定義：特異性的識別某些核酸序列，并將切斷的酶（雙鏈）。 （3）DNA物理圖譜： 定義:指DNA鏈的限制性酶切片段的排列順序,即酶切片段在DNA鏈上的定位。 （4）意義: 基因定位 基因重組 剪接 DNA測序三. DNA突變分析 1. DNA RNA Protein 性狀 堿基改變后，或會影響蛋白質(zhì)的形成， 關(guān)鍵部位，或無改變 非關(guān)鍵部位。2. DNA結(jié)構(gòu)變化：點突變、缺失、擴增3. RFLP限制性內(nèi)切酶多態(tài)性分析（ Restriction Fragment Length Polymorphisms ） 制作方法：酶切電泳（轉(zhuǎn)膜雜交）分析 4. AF

33、LP擴增片段長度多態(tài)性分析 （Amplified Fragment Length Polymorphism） 制作方法：酶切加接頭PCR電泳分析。 RFLP、AFLP用于突變分析的局限性： 突變必須發(fā)生于酶切位點區(qū)域，否則檢測不到。5. SSCP單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析 （Single strand conformation polymorphism） （1）基本原理： 單鏈DNA片段呈復(fù)雜的空間折疊構(gòu)象，這種立體結(jié)構(gòu)主要是由 其內(nèi)部堿基配對等分子內(nèi)相互作用力來維持的，當(dāng)有一個堿基發(fā)生改變時，會或多或 少地影響其空間構(gòu)象，使構(gòu)象發(fā)生改變，空間構(gòu)象有差異的單鏈DNA分子在聚丙烯酰胺凝膠中遷移率不同。

34、（2）基本過程是: PCR擴增靶DNA; PCR擴增 產(chǎn)物變性； 聚丙烯酰胺凝膠電泳; 顯 色分析結(jié)果. 若發(fā)現(xiàn)單鏈DNA帶遷移率與正常對照的相比發(fā)生改變，就可以判定該鏈構(gòu) 象發(fā)生改變，進而推斷該DNA片段中有堿基突變. （3）局限性：只有突變位點影響其空間構(gòu)象才能被檢出來。檢出率：70%6. DGGE變性梯度凝膠電泳 ( Denaturing Gradient Gel Electrophoresis) DNA片段在變性劑梯度聚丙烯酰胺凝膠中電泳，凝 膠中自上而下所含變性劑濃度呈梯度增加。DNA片段在進入變性劑某一濃度時，此濃 度下DNA片段在最低溫度解鏈區(qū)域解鏈(Tm值)，此時DNA分子成分

35、枝狀 結(jié)構(gòu)，它使DNA分子在膠中的移動減慢。如果梯度條件選擇恰當(dāng)，因單個堿基變化使不同的DNA片段在凝膠中的不同位置分叉，隨后DNA片段移動減慢，從而使DNA片段 最終分離開來。 變性梯度膠凝電泳能夠?qū)⒕哂袉蝹€堿基差別的DNA分子分離開來。點突變檢出率可達100%，但操作復(fù)雜，技術(shù)要求較高。 四. 核酸的凝膠電泳 自從瓊脂糖和聚丙烯酰胺凝膠被引入核酸研究以來，按相對分子質(zhì)量大小分離DNA的凝膠電泳技術(shù)，已經(jīng)發(fā)展成為一種分析重組DNA分子及蛋白質(zhì)與核酸相互作用的重要手段，也是現(xiàn)在通用的許多分子生物學(xué)研究方法，如DNA分型、DNA核苷酸序列分析、限制性內(nèi)切酶片段分析以及限制性內(nèi)切酶作圖等的技術(shù)基礎(chǔ)

36、，受到科學(xué)界的高度重視。 1. 基本原理 帶有電荷的分子在電場作用下的遷移速度，叫電泳的遷移率，它與電場強度和電泳分子本身所攜帶的凈電荷數(shù)成正比，在無反應(yīng)活性的穩(wěn)定的支持介質(zhì)中，與分子的摩擦系數(shù)成反比。也就是說，電場強度越大，電泳分子所攜帶的凈電荷數(shù)越多，分子越小，其遷移的速度越快，反之越慢。因此，根據(jù)分子大小的不同、構(gòu)型或形狀的差異以及所攜帶的凈電荷數(shù)的多寡，便可以通過電泳將蛋白質(zhì)或核酸分子混合物中的各種成分分離開來。核酸帶負電荷，放置在電場中，會向正極方向遷移。相同堿基數(shù)量的雙鏈DNA分子幾乎帶有等量的凈電荷，能以同樣的速度向正極方向遷移。在一定電場強度下，電泳的遷移率取決于核酸分子大小和

37、構(gòu)型，可以通過電泳將核酸分子混合物中大小不同的片段分離開來。2. 瓊脂糖凝膠電泳 （1.） 凝膠的分辨能力同凝膠的濃度和類型有關(guān)。瓊脂糖是一種線性多糖聚合物，從紅色海澡產(chǎn)物瓊脂中提取出來。將瓊脂糖粉末加熱到熔點后冷卻凝固便會形成良好的電泳介質(zhì)，其密度由瓊脂糖的濃度決定。凝膠濃度的高低影響凝膠介質(zhì)孔隙的大小，濃度越高，孔隙越小，其分辨能力就越強。反之，濃度降低，孔隙就增大，其分辨能力就隨之減弱。 （2） 瓊脂糖凝膠的分辨范圍：0.250kb （3） 聚丙烯酰胺凝膠的分辨范圍：11000bp（4.） 溴化乙錠染色在凝膠電泳中，加入適量溴化乙錠染料對核酸分子進行染色，然后將電泳標本放置在紫外光下觀察

38、，可十分靈敏而快捷地檢測出凝膠介質(zhì)中DNA的譜帶部位，即使每條DNA帶中僅含有0.05ug的微量DNA，也可以被清晰地檢測出來。溴化乙錠是一種具扁平分子的核酸染料，能插入到DNA或RNA分子的相鄰堿基之間，并在300nm波長的紫外光照射下發(fā)出熒光。把含有DNA分子的凝膠浸泡在溴化乙錠的溶液中，或是將溴化乙錠直接加到DNA的凝膠介質(zhì)中，此種染料便會在一切可能的部位與DNA分子結(jié)合，然而卻不能與瓊脂糖凝膠或聚丙烯酰胺凝膠相結(jié)合，因此，只有DNA分子能吸收溴化乙錠并發(fā)出熒光。在適當(dāng)?shù)娜旧珬l件下，熒光強度與DNA片段的大小或數(shù)量成正比。五. 核酸的分子雜交將帶有互補的特定核苷酸序列的單鏈DNA或RNA

39、混合在一起，其相應(yīng)的同源片段就會退火形成雙鏈結(jié)構(gòu)。如果退火的核酸來自不同的生物有機體，所形成的雙鏈分子就被稱為雜種核酸分子。能夠雜交形成雜種分子的不同來源的DNA分子，其親緣關(guān)系較為密切；反之，其親緣關(guān)系則比較疏遠。因此，DNA/DNA的雜交作用，可以用來檢測特定生物有機體之間是否存在親緣關(guān)系，而DNA/RNA間雜種分子的能力可被用來揭示核酸片段中某一特定基因的位置。1. Southern blotting雜交中常用的濾膜：尼龍濾膜、硝酸纖維素濾膜、二乙氨基乙基纖維素濾膜 2. 主要步驟： （1）將核酸樣品轉(zhuǎn)移到固體支持物濾膜上（2）將具有核酸印跡的濾膜與帶有放射性或其它標記的DNA或RNA探

40、針進行雜交。雜交的具體步驟是將含有經(jīng)電泳分離的不同相對分子質(zhì)量DNA片段的瓊脂糖凝膠，通過堿變性等預(yù)處理之后平鋪在已用電泳緩沖液飽和了的濾紙上，在凝膠上部覆蓋一張待用的濾膜。接著加一疊干濾紙，最后再壓上一重物。這樣，由于干濾紙的吸引力，凝膠中的單鏈DNA便隨著電泳緩沖液一起轉(zhuǎn)移。這些DNA分子一旦與濾膜接觸，就會被吸附在上面，而且嚴格地保留了它們在凝膠中的譜帶模式。在80下烘烤或用紫外線膠聯(lián)發(fā)，就能將DNA片段永久地固定在濾膜上（圖5-6）。然后，將濾膜放到加有放射性同位素標記的探針溶液中進行雜交。這些探針是與被吸印DNA序列互補的RNA或單鏈DNA，一旦與濾膜上的單鏈DNA雜交之后，就很難再

41、解鏈。因此，可以用漂洗法去掉游離的沒有雜交上的探針分子，用X底片暴光后得到放射自顯影圖片。六. 細菌轉(zhuǎn)化 1. 轉(zhuǎn)化作用 transformation 通過自動獲取或人為地供給外源DNA使細胞或培養(yǎng)的受體細胞獲得新的遺傳表型的過程.2. 基本過程所謂細菌轉(zhuǎn)化，是指一中細菌由于捕獲了來自另一種細菌菌株的DNA而導(dǎo)致性狀特征發(fā)生遺傳改變的生命過程。提供轉(zhuǎn)化DNA的菌株叫供體菌株，接受轉(zhuǎn)化DNA的菌株則被稱為受體菌株。大腸桿菌是細菌轉(zhuǎn)化實驗這的常用材料。將快速生長的大腸桿菌置于經(jīng)低溫（0）預(yù)處理的低滲氯化鈣溶液這，便會造成細胞膨脹，并與轉(zhuǎn)化混合物中的外源DNA形成粘附在細胞表面的復(fù)合物。立即將該體系

42、轉(zhuǎn)移到42下作短暫的熱處理，復(fù)合物并會被細胞所吸收。在全培養(yǎng)基中生長一段時間使轉(zhuǎn)化基因?qū)崿F(xiàn)表達，就可涂布于選擇性培養(yǎng)基中分離轉(zhuǎn)化因子。利用噬菌體顆粒能夠有效地將DNA注入寄主細胞中這一特點，科學(xué)家又發(fā)明了重組體DNA分子的體外包裝法。經(jīng)包裝的基因工程噬菌體能夠借助細菌表面的噬菌體接受器位點將DNA注入受體細菌，并在這些細胞中得到繁殖和表達。七. 核苷酸序列分析 DNA測序(Sequence) 基本原理: 先進行末端標記，作為長度參考位置，把核苷酸的序列測定。 雙脫氧鏈終止法 1977年，英國劍橋生化學(xué)家Sanger 等人發(fā)明。Sanger首先提出“加減法”，后又對其進行了改進雙脫氧鏈終止法 原

43、理：利用DNA聚合酶I的聚合反應(yīng)，在反應(yīng)混合物中加入模板、放射性標記的引物，DNA聚合酶I和四種dNTP，另外加入一定比例的2, 3-ddNTP, 當(dāng)合成時ddNTP參與后，鏈將不能再延伸而停止。 注意：樣品中加入一定比例的ddNTP。 dNTP / ddNTP = 1：50 或 1：100該方法又叫引物合成法或酶催引物合成法。它利用了DNA聚合酶所具有的兩種酶催化反應(yīng)的特性：第一，DNA聚合酶能夠利用單鏈DNA作為模板，合成準確的DNA互補鏈；第二，DNA聚合酶能夠利用2，3-雙脫氧核苷酸作為底物，將其摻入到寡核苷酸鏈的3-末端，從而終止DNA鏈的生長。在DNA測序反應(yīng)中，加入模板DNA、特

44、意性引物、DNA聚合酶、dNTP和一種ddNTP，當(dāng)這種2，3-ddNTP（圖5-9，ddTTP）摻入到寡核苷酸鏈的生長末端，取代了dTTP之后，由于ddTTP沒有3-末端，寡核苷酸鏈不再繼續(xù)延長，在本該由dTTP摻入的位置上發(fā)生了鏈有效終止。如果在同一個反應(yīng)中，加入一種帶32P放射性標記的dNTP。那么，經(jīng)過適當(dāng)?shù)臏赜?，將會產(chǎn)生不同長度的DNA片段混合物，它們都具有同樣的5-末端，并在3-末端的ddNTP處終止。將這種混合物加到變性凝膠上進行電泳分離，就可以獲得一系列全部以3-末端ddNTP為終止殘基的DNA片段的電泳譜帶模式。分別加入ddATP、ddGTP和ddCTP，在不同的試管中溫

45、育后，點樣于同一變性凝膠上進行電泳分離，再通過放射自顯影的方法檢測單鏈DNA的放射性帶，就利益直接讀出DNA的核苷酸序列。（圖5-10） 在每一個凡庸管中，都加入一種互不相同的ddNTP和全部種dNTP，其中一種帶有32P放射性標記。反應(yīng)混合物加到聚丙烯酰胺凝膠中進行電泳分離，電泳凝膠用X底片作放射自顯暴光，產(chǎn)生出可見的譜帶。從膠的底部開始判讀譜帶，逐漸讀向頂部。所得出的核苷酸序列，是同模板鏈53方向的堿基順序互補。圖中*號表示放射性標記的核苷酸2. Maxam-Gilbert化學(xué)修飾法 1977年，由美國哈佛大學(xué)Maxam和Gilbert發(fā)明。 原理：用化學(xué)試劑處理具末端放射性標記的DNA片

46、段，造成堿基的特異性修飾和切斷，產(chǎn)生一組具有各種不同長度的DNA鏈的混合物，經(jīng)電泳分離和放射性自顯影后，便可讀出待測DNA片段的核苷酸序列。 通常用的化學(xué)試劑是硫酸二甲酯和肼 其作用原理是： （1） 破壞糖環(huán)相連的堿基，將堿基從糖環(huán)上切除； （2） 進一步從這一位置將磷酸二酯鍵斷裂。 （圖5-11）：（a）用T4多核苷酸激酶標記DNA限制性片段的5-末端，或用T4DNA聚合酶標記其3-末端；（b）將32P-末端標記的DNA片段（單鏈的或雙鏈的）分成4個反應(yīng)管，進行化學(xué)切割反應(yīng)；（c）將切割反應(yīng)物加到聚丙烯酰胺序列膠上，進行電泳分離，經(jīng)放射自顯影后在X底片上顯現(xiàn)出可判讀的譜帶。*號表示32P標記

47、的核苷酸。由于在聚丙烯酰胺凝膠中，相對分子質(zhì)量小的DNA片段遷移速度快，因此在本例中跑在所有帶的最前面，亦即是凝膠底部的帶是單核苷酸分子A，第二條帶是二核苷酸分子A-C，其余類推。因為硫酸二甲酯特異性地切割G，而甲酸則特異性地切割G和A，因此具G-末端的DNA片段，在G反應(yīng)和G+A反應(yīng)序列膠中，都將出現(xiàn)一條G帶。同理，由于肼在NaCl條件下專門切割C，而無NaCl時專門切割T和C，所以具有C末端的DNA片段，在C反應(yīng)和T+T反應(yīng)序列膠中，都將出現(xiàn)一條C帶。3. DNA序列分析的自動化 傳統(tǒng)的測序方法通用、有效，但操作步驟繁瑣、效率低、速度慢。 DNA序列分析的自動化 “分析反應(yīng)”自動化，“讀片

48、過程”自動化 （1） 標記物四甲基若丹明 tetramethylrhodamine （2） 讀取在電泳凝膠的側(cè)面，固定一個激光通道小孔，安裝熒光信號接收器。 （3） 雙脫氧法ddNTP分別用四種不同顏色的熒光標記。八. 基因擴增（PCR技術(shù)） 1. 定義 又稱體外基因擴增法，在體外（試管、反應(yīng)管中）將要研究的目的基因或DNA片段在短時間內(nèi)擴增上百萬倍，稱為DNA聚合酶鏈式反應(yīng)（ Polymerase Chain Reaction ，PCR ）2. 發(fā)展簡史 1971年Korana最早提出核酸體外擴增的設(shè)想： “經(jīng)過DNA變性，與合適的引物雜交，用DNA聚合酶延伸引物，并不斷重復(fù)該過程便可克隆t

49、RNA基因”。 1985年美國PE-Cetus公司人類遺傳研究室的Mullis 發(fā)明了聚合酶鏈反應(yīng)。其原理類似于DNA的體內(nèi)復(fù)制，只是在試管中進行DNA的體外合成。 Mullis最初使用的DNA聚合酶是大腸桿菌 DNA 聚合酶 I 的Klenow片段，其缺點是：Klenow酶不耐高溫，引物鏈延伸反應(yīng)在37下進行，容易發(fā)生模板和引物之間的堿基錯配。 1988年初，Keohanog改用T4 DNA聚合酶進行PCR 。1988年Saiki 等從溫泉中分離的一株水生嗜熱桿菌(thermus aquaticus)中提取到一種耐熱DNA聚合酶。此酶具有以下特點：耐高溫，在70下反應(yīng)2h后其殘留活性大于原來

50、的90%，在93下反應(yīng)2h后其殘留活性是原來的60%，在95下反應(yīng)2h后其殘留活性是原來的40%。 在熱變性時不會被鈍化，不必在每次擴增反應(yīng)后再加新酶。大大提高了擴增片段特異性和擴增效率，增加了擴增長度(2.0Kb)。將此酶命名為Taq DNA多聚酶(Taq DNA Polymerase)。此酶的發(fā)現(xiàn)使PCR廣泛的被應(yīng)用。3. 基本原理 第一步 “加熱變性”：高溫下使DNA的雙鏈解開成為兩條單鏈DNA分子； 第二步 “退火” ：引物附著到模板DNA兩側(cè)； 第三步 “延伸”：DNA聚合酶在適當(dāng)?shù)姆磻?yīng)溫度下促使核苷酸依次按與模板堿基互補配對原則，在引物3端一個個地連接上去，直至形成一個完整的DNA

51、分子。（圖5-16）：（a）起始材料，雙鏈DNA；（b）反應(yīng)混合物加熱后發(fā)生鏈分離，降溫使引物結(jié)合到待擴增靶DNA區(qū)段兩端的退火位點上；（c）Taq DNA聚合酶以單鏈DNA為模板在引物的引導(dǎo)下利用反應(yīng)混合物中的dNTPs合成互補的新鏈DNA；（d）將反應(yīng)混合物再次加熱，使舊鏈和新鏈分開；（e）重復(fù)（b）；（g）重復(fù)（c）4. PCR反應(yīng)所需成分： （1）DNA模板 （2）引物（前、后） （3） dNTP（dATP、 dTTP 、dCTP 、dGTP ） （4）反應(yīng)緩沖液 （5）Mg+ （6）DNA聚合酶 反應(yīng)要求引物的量遠遠大于模板的量， Why？ 保證引物與模板配對的可能性大于模板與模板配

52、對的可能性。5. 特點： （1） 擴增產(chǎn)物的長度及位置由引物確定； （2）特異性（取決于引物的特異性） （3.）靈敏性（擴增效率） 理論上: 2n （230=109） 實際 : 106 1076. 應(yīng)用： （1）PCR產(chǎn)物的克??； （2）檢測（疾病、突變、育種、法醫(yī)鑒定、生物進化、分類等） （3）多態(tài)性分析 7. 常見問題： 污染（試劑、實驗室、樣品） 酶活性及種類 第三節(jié) 基因克隆的主要載體系統(tǒng)一.名詞 1. 克隆（clone） (1)細胞學(xué)定義，即無性繁殖，從一個共同祖先無性繁殖下來的一群遺傳上同一的DNA分子、細胞或個體所組成的特殊的生命群體。 (2)分子生物學(xué)定義，指將外源DNA插入具有復(fù)制能力的載體DNA中，是之得以永久保存和復(fù)制的過程。2. 基因克隆 gene cloning 應(yīng)用酶學(xué)的方法，在體外將目的基因與載體DNA結(jié)合成一具有自我復(fù)制能力的DNA分子（重組體），繼而通過轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染宿主細胞、篩選出含有目的基因的轉(zhuǎn)化子細胞，再進行擴增、提取獲得大量同一DNA分子拷貝3. 載體 vector （1）概念：能在宿主細胞中進行自我復(fù)制和表達外源 DNA 。 （2）分類：克隆載體、表達載體、原核載體、真核載體（