蛋白質(zhì)制備及含量測定(凱氏定氮法)

1、實(shí)驗(yàn)六 蛋白質(zhì)制備及含量測定微量凱氏（Mirco-Kjeldahl）定氮法一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康囊?、了解蛋白質(zhì)提取的一般方法和原理2、了解蛋白質(zhì)含量測定的常用方法3、學(xué)習(xí)微量凱氏定氮法的原理4、掌握微量凱氏定氮法的操作技術(shù)，包括樣品的消化、蒸餾、滴定、含氮量的計(jì)算及蛋白質(zhì)含量的換算等。二、實(shí)驗(yàn)原理1、蛋白質(zhì)的提取與制備蛋白質(zhì)的提取與制備方法與生物材料的類型及蛋白質(zhì)的存在部位有關(guān)。如果是胞內(nèi)蛋白，首先必須要進(jìn)行細(xì)胞破碎。細(xì)胞破碎的方法與細(xì)胞的類型有關(guān)，包括物理破碎（研磨、超聲波等）、化學(xué)破碎（化學(xué)溶劑處理）、酶法破碎等。如果是胞外蛋白，可以根據(jù)相應(yīng)蛋白質(zhì)的性質(zhì)進(jìn)行提取分離純化。如果待提取的蛋白質(zhì)是具有

2、生物活性的蛋白質(zhì)如酶，則在樣品處理、提取及分離純化過程中需注意防止蛋白質(zhì)的變形失活，如在低溫下操作、選擇適當(dāng)?shù)木彌_體系等。2、蛋白質(zhì)含量測定蛋白質(zhì)含量測定的方法很多，如：紫外吸收法、雙縮脲法、考馬斯亮藍(lán)染色法（Bradford法）、Folin酚法、微量凱氏定氮法等。3、凱氏定氮生物材料的含氮量測定在生物化學(xué)研究中具有一定的意義，如蛋白質(zhì)的含氮量約為16，測出含氮量則可推知蛋白含量。生物材料總氮量的測定，通常采用微量凱氏定氮法。凱氏定氮法由于具有測定準(zhǔn)確度高，可測定各種不同形態(tài)樣品等兩大優(yōu)點(diǎn)，因而被公認(rèn)為是測定食品、飼料、種子、生物制品、藥品中蛋白質(zhì)含量的標(biāo)準(zhǔn)分析方法。其原理如下：（1）消化：有

3、機(jī)物與濃硫酸共熱，使有機(jī)氮全部轉(zhuǎn)化為無機(jī)氮硫酸銨。為加快反應(yīng)，添加硫酸銅和硫酸鉀的混合物；前者為催化劑，后者可提高硫酸沸點(diǎn)。這一步約需23h，視樣品的性質(zhì)而定。天然的含氮有機(jī)物（如蛋白質(zhì)，核酸及氨基酸等）與濃硫酸共熱時(shí)，其中的碳、氫二元素被氧化成二氧化碳和水；蛋白質(zhì)分解，而有機(jī)氮?jiǎng)t變成氨（無機(jī)氮），并進(jìn)一步與硫酸作用生成硫酸銨。此時(shí)程稱之為“消化”。但是，這個(gè)反應(yīng)進(jìn)行得比較緩慢，通常需要加入硫酸鉀或硫酸鈉以提高反應(yīng)的沸點(diǎn)，并加入硫酸銅作為催化劑，以促進(jìn)反應(yīng)的進(jìn)行。甘氨酸的消化過程可表示如下：NH2-CH2 -COOH + 3H2SO4 NH3 + 2CO2+ 3SO2+ 4H2O2 NH3 +

4、 H2SO4 (NH4)2 SO4 或2 NH2-CH2 -COOH + 7H2SO4 (NH4)2 SO4 + 4CO2+ 6 SO2+ 8H2O（2）加堿蒸餾：濃堿可使消化液中的硫酸銨分解，游離出氨，借水蒸汽將產(chǎn)生的氨蒸餾到一定量、一定濃度的硼酸溶液中，硼酸吸收氨后，氨與溶液中的氫離子結(jié)合，生成銨根離子。(NH4)2 SO4 + 2NaOH Na2SO4 + 2NH3 +2H2ONH3 + H3BO3 NH4H2BO3 或2NH3 + 4H3BO3 (NH4)2 B4O7 + 5H2O（3）滴定：硼酸吸收氨后，氨與溶液中的氫離子結(jié)合，生成銨離子，使溶液中氫離子濃度降低。然后用標(biāo)準(zhǔn)無機(jī)酸滴定

5、，直至恢復(fù)溶液中原來氫離子濃度為止，最后根據(jù)所用標(biāo)準(zhǔn)酸的當(dāng)量數(shù)物質(zhì)的量（相當(dāng)于待測物中氨的物質(zhì)的量）計(jì)算出待測物中的含氮量，再折算為粗蛋白含量。NH4H2BO3 + HCl NH4Cl + H3BO3或(NH4)2 B4O7 + 2HCl + 5H2O 2NH4Cl + 4H3BO3滴定時(shí)用甲烯藍(lán)和甲基紅混合指示劑，其指示范圍為pH5.25.6，將NH4H2BO3的綠色滴至原來H3BO3的紫色即為終點(diǎn)。本法適用于0.21.0mg（2.0 mg）氮量測定。相對(duì)誤差應(yīng)小于2%。圖31 微量凱氏蒸餾裝置示意圖1.熱源 2. 燒瓶 3. 玻璃管 4. 橡皮管5玻璃杯 6. 棒狀玻塞 7. 反應(yīng)室 8.

6、 反應(yīng)室外殼 9. 夾子 10. 反應(yīng)室中插管 11. 冷凝管 12. 錐形瓶 13. 石棉網(wǎng)圖32 改進(jìn)型微量凱氏定氮蒸餾裝置1.水蒸氣發(fā)生器 2. 反應(yīng)室 3. 水蒸氣排氣孔 4. 排水排氣孔5外源水入口 6. 進(jìn)樣口 7. 加樣漏斗 8. 冷凝器 9. 冷凝器出口 10. 自來水入口 11. 通氣室 12. 通氣室出口 13. 通氣室出口14. 排水柱 15. 排水柱入口 16. 排水柱入口 17. 冷凝水和廢水出口三、主要實(shí)驗(yàn)試劑和器材1、試劑（1）消化液（過氧化氫濃硫酸水321）（2）硫酸鉀硫酸銅混合物：硫酸鉀與硫酸銅（CuSO45H2O）以3：1（W/W）的配比混合研磨成粉末。（3

7、）30%氫氧化鈉溶液（4）2%硼酸（5）混合指示劑（田氏指示劑）的配制：方法一：取50mL0.1%甲烯藍(lán)無水醇溶液與200mL0.1%甲基紅無水乙醇溶液混合配成，貯于棕色瓶備用，這種指示劑酸性時(shí)為紫色，堿性時(shí)為綠色，變色范圍窄且靈敏?；蚍椒ǘ?.1%溴甲酚綠乙醇溶液10mL與0.1%甲基紅乙醇溶液2mL混和即成。本指示劑的變色范圍為pH 5.2 5.4 5.6 紫紅色 灰色 綠色（6）0.0100 molL-1HCl（7）硼酸指示劑混合液：取100mL2%硼酸溶液，滴加混合指示劑貯備液，搖勻后溶液呈現(xiàn)紫紅色即可。（約加1mL左右混合指示劑）2、待測樣品市售面粉3、主要器材（1）分析天平（2）

8、凱氏燒瓶100mL（2）（3）容量瓶（50mL）（4）刻度吸管（1mL、2mL）（5） 凱氏定氮蒸餾裝置（6） 微量滴定管（3mL、5mL，可讀至0.02mL）（7） 錐形瓶（50100mL）四、操作方法1、樣品處理液體樣品（如血清）可以直接消化，而固體樣品中的含氮量是100克該物質(zhì)（干重中所含氮的克數(shù)）來表示（%）。 因此在定氮前，應(yīng)將固體樣品中的水份除掉。一般樣品干燥的溫度都采用105，因?yàn)榉怯坞x的水都不能在100以下烘干。在稱量瓶中稱入一定量的面粉樣品，然后置105的烘箱內(nèi)干燥4小時(shí)。用坩堝將稱量瓶放入干燥器內(nèi)，待降至室溫后稱重，按上述操作繼續(xù)烘干樣品。每干燥1小時(shí)后，稱量一次，直到兩次

9、稱量的數(shù)量不變，即達(dá)恒重（0.0002g）。精確稱取0.1g左右的干燥面粉作為本次實(shí)驗(yàn)的樣品。2、消化取2個(gè)100毫升的凱氏燒瓶，向第一號(hào)燒瓶內(nèi)加0.1g面粉樣品。注意，加樣品時(shí)應(yīng)直接送至燒瓶底部，切勿沾于瓶口或瓶頸上，向2號(hào)燒瓶加入0.1毫升蒸餾水作空白對(duì)照。在每個(gè)燒瓶內(nèi)加入硫酸鉀硫酸銅混合物約0.2g，消化液（濃硫酸）5mL，玻璃珠1粒，搖勻。將燒瓶約60度角固定在鐵架上，每個(gè)瓶口放一小漏斗，在通風(fēng)廚內(nèi)的電爐上消化。在消化開始時(shí)，應(yīng)控制火力，不要使液體沖到瓶頸。待瓶內(nèi)水汽蒸完，硫酸開始分解并放出SO2白煙后，適當(dāng)加強(qiáng)火力，使瓶內(nèi)液體微微沸騰，大約維持2 3h繼續(xù)消化（待消化液變成褐色后，為

10、了加速完成消化，可將燒瓶取下，稍冷，將30過氧化氫溶液1 2滴加到燒瓶底部消化液中，再繼續(xù)消化，直到消化液由淡黃色變成透明淡藍(lán)綠色，消化即告完成）。直至消化液呈透明綠色為止。消化完畢，待燒瓶內(nèi)容物冷卻后，加蒸餾水10毫升（注意慢加，邊加邊搖）。冷卻后將瓶內(nèi)容物轉(zhuǎn)入50毫升的容量瓶中，并用蒸餾水洗燒瓶數(shù)次，溶液一并倒入容量瓶，最后定容至刻度搖勻，做上記號(hào)備用。注意事項(xiàng)（1）小心加樣，切勿使樣品沾污凱氏燒瓶口部、頸部。（2）消化時(shí)，須斜放凱氏燒瓶（45左右）。火力先小后大，避免黑色消化物濺到瓶口、瓶頸壁上。本次實(shí)驗(yàn)消化液已經(jīng)制備好，備用。從蒸餾開始做。3、蒸餾（1）凱氏定氮裝置的安裝：首先固定主體

11、（蒸汽發(fā)生器和反應(yīng)室），高度適合于熱源加熱；然后用橡皮管將各相應(yīng)部位連接，放上自由夾；最后長橡皮管連接自來水和出水口。（2）蒸餾器的洗滌：儀器應(yīng)先經(jīng)一般洗滌，再經(jīng)水蒸氣洗滌。洗滌方法：蒸氣發(fā)生器中加入一定量水（以排水高度為宜）加熱燒開（注意：熱源切勿靠近橡皮管，防止將橡皮管燒化）。向反應(yīng)室中加入蒸餾水，水即自動(dòng)吸出（虹吸）；或移開蒸汽發(fā)生器的熱源片刻；或打開自由夾，使得冷水進(jìn)入蒸汽發(fā)生器，都可使反應(yīng)室中的水自動(dòng)吸出（如果幾種措施都無效，檢查裝置本身是否有問題如存在裂痕等）。反復(fù)清洗35次。檢驗(yàn)是否洗滌干凈：將一只盛有5mL 2硼酸液和1 2滴指示劑的錐形瓶置于冷凝管下端，使冷凝管管口插入液體中

12、，蒸餾數(shù)分鐘，如硼酸液顏色不變，表明儀器已洗凈。否則繼續(xù)洗滌直至洗凈為止。 （3）滴定標(biāo)準(zhǔn)樣品：標(biāo)準(zhǔn)硫酸銨溶液先用標(biāo)準(zhǔn)硫酸銨溶液（0.3毫克氮/毫升）試驗(yàn)23次。蒸餾器洗凈后，開放水龍頭，使水進(jìn)入蒸汽發(fā)生器，水放至球部即可。 取3個(gè)50毫升的錐形瓶，各準(zhǔn)確加入10毫升硼酸（內(nèi)加有混合指示劑）。用表面皿復(fù)蓋備用。加樣：用吸量管吸取1mL標(biāo)準(zhǔn)硫酸銨溶液，細(xì)心地由加樣漏斗傾入反應(yīng)室，再用蒸餾水1毫升清洗漏斗。取一個(gè)盛有硼酸混合指示劑的錐形瓶，置于冷凝管下端，使冷凝器管口下端浸沒在硼酸溶液液面下，用量筒從漏斗加入30%氫氧化鈉8mL，隨即將自由夾夾緊，并往漏斗加入少量蒸餾水封閉。蒸餾：用酒精燈加熱（應(yīng)

13、用擋風(fēng)板將燈圍攏，維持火力恒定），沸騰不可高于虹吸管口以免整齊發(fā)生器溶液從虹吸管倒吸，待第一滴蒸餾液從冷凝柱下端滴下時(shí)起，繼續(xù)蒸餾5分鐘，然后將錐形瓶放低，使導(dǎo)管離開液面再蒸2分鐘，并用少量蒸餾水冷凝管口外壁，蒸餾完畢，取下錐形瓶，隨即將蒸餾器洗凈。（3）樣品消化液及空白的蒸餾取50mL 錐形瓶數(shù)個(gè)，各加5mL 2硼酸溶液和1 2滴指示劑，用表面皿覆蓋備用。用吸量管分別吸取5mL/10mL樣品消化液按上述操作步驟進(jìn)行蒸餾。a.首先關(guān)閉冷凝水，打開自由夾2，使蒸汽發(fā)生器與大氣相通。將錐形瓶放在冷凝器下端，浸沒于液面下。b.移取5mL/10mL樣品消化液小心加入反應(yīng)室。將準(zhǔn)備好的30%氫氧化鈉8m

14、L加入，關(guān)閉自由夾1，加水封。c.關(guān)閉自由夾2，打開冷凝水（不要過猛）d.加熱蒸汽發(fā)生器，開始蒸餾。當(dāng)觀察到錐形瓶中由紫色綠色（23min），蒸餾3min。放低錐形瓶，繼續(xù)蒸餾1min，用少量蒸餾水洗滌冷凝管下端外側(cè)。取下錐形瓶，以表面皿覆蓋。以備滴定。蒸餾完畢，應(yīng)立即洗滌反應(yīng)室，方法同前，清洗35次。繼續(xù)進(jìn)行10mL空白消化液蒸餾。蒸餾全部結(jié)束后，將反應(yīng)室清洗干凈，廢水排出。（4）滴定：蒸餾完畢，分別用0.0100molL-1標(biāo)準(zhǔn)鹽酸溶液滴定樣品消化液蒸餾的錐形瓶內(nèi)溶液和空白消化液蒸餾的錐形瓶內(nèi)溶液至綠色變?yōu)榈仙?，記錄所用鹽酸的量，分別為V1和V2。注意事項(xiàng)（1）必須仔細(xì)檢查凱氏定氮儀的各

15、個(gè)連接處，保證不漏氣。（2）凱氏定氮儀必須事先反復(fù)清洗，保證潔凈。（3）蒸餾時(shí)，小心加入消化液。加樣時(shí)最好將火力擰小或撤去或?qū)⒄羝l(fā)生器與大氣相通，避免加入的消化樣液發(fā)生倒吸。蒸餾時(shí)，切忌火力不穩(wěn)，否則也將發(fā)生倒吸現(xiàn)象。（4）蒸餾后應(yīng)及時(shí)清洗定氮儀。（5）凱氏法的優(yōu)點(diǎn)是適用范圍廣，可用于動(dòng)植物的各種組織，器官及食品等成組復(fù)雜樣品的測定，只要細(xì)心操作都能得到精確的結(jié)果。其缺點(diǎn)是操作比較復(fù)雜，含有大量堿性氨基酸的蛋白質(zhì)測定結(jié)果偏高。（6）普通實(shí)驗(yàn)室中的空氣中常含有少量的氨、CO2，會(huì)影響結(jié)果，所以操作應(yīng)在單獨(dú)潔凈的房間中進(jìn)行，并盡可能快地對(duì)硼酸吸收液進(jìn)行滴定。（7）微量滴定管的使用：清洗干凈，用HCl標(biāo)準(zhǔn)溶液潤洗；滴定時(shí)，小心操作，切勿滴定過快，尤其是滴定空白樣時(shí)，因?yàn)镠Cl消耗量可能很小。五、實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析cHCl（V1V2）0.014100 消化液總量樣品的總氮量（克氮） w 測定時(shí)用量 若測定的樣品含氮量部分只是蛋白質(zhì)，（如血清）則：樣品的總蛋白含量（克蛋白%）總氮量6.25若樣品中除有蛋白外，尚有其他含氮物質(zhì)，則樣品蛋白質(zhì)含量的測定要更復(fù)雜一些。首先需向樣品中加入三氯