質(zhì)粒載體的構(gòu)建

1、質(zhì)粒載體的構(gòu)建摘 要：質(zhì)粒載體的構(gòu)建。首先要獲得目的DNA。根據(jù)其目的基因序列和啟動子序列設(shè)計(jì)引物，為提高目的基因產(chǎn)率，采用兩次PCR的方法，即第一次設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增全序列基因，第二次設(shè)計(jì)帶酶切位點(diǎn)的引物以第一次擴(kuò)增產(chǎn)物為模板進(jìn)行擴(kuò)增，進(jìn)而加尾連接到T-DNA上，再利用電轉(zhuǎn)化的方法將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到帶有PCAMBIA1381的DH5感受態(tài)細(xì)胞中復(fù)制表達(dá)。關(guān)鍵詞： 質(zhì)粒 DNA PCR 電泳 感受態(tài) 轉(zhuǎn)化 1. 引言質(zhì)粒（plasmid）是細(xì)菌或細(xì)胞染色質(zhì)以外的，能自主復(fù)制的，與細(xì)菌或細(xì)胞共生的遺傳成分。其特點(diǎn)如下： 是染色質(zhì)外的雙鏈共價(jià)閉合環(huán)形DNA（cccDNA），可自然形成超螺旋結(jié)構(gòu)，不同質(zhì)粒大

2、小在2-300kb之間，15kb的小質(zhì)粒比較容易分離純化，15kb的大質(zhì)粒則不易提取。 能自主復(fù)制，是能獨(dú)立復(fù)制的復(fù)制子。一般質(zhì)粒DNA復(fù)制的質(zhì)?？呻S宿主細(xì)胞分裂而傳給后代。 質(zhì)粒對宿主生存并不是必需的。某些質(zhì)粒攜帶的基因功能有利于宿主細(xì)胞的特定條件下生存，例如，細(xì)菌中許多天然的質(zhì)粒帶有抗藥性基因，如編碼合成能分解破壞四環(huán)素、氯霉素、氨芐表霉素等的酶基因，這種質(zhì)粒稱為抗藥性質(zhì)粒，又稱R質(zhì)粒，帶有R質(zhì)粒的細(xì)菌就能在相應(yīng)的抗生素存在生存繁殖。所以質(zhì)粒對宿主不是寄生的，而是共生的?，F(xiàn)在分子生物學(xué)使用的質(zhì)粒載體都已不是原來細(xì)菌或細(xì)胞中天然存在的質(zhì)粒，而是經(jīng)過了許多的人工的改造。從不同的實(shí)驗(yàn)?zāi)康某霭l(fā)，人

3、們設(shè)計(jì)了各種不同的類型的質(zhì)粒載體。質(zhì)粒載體pBR322是研究得最多，是使用最早且應(yīng)用最廣泛的大腸桿菌質(zhì)粒載體之一。符號質(zhì)粒載體pBR322中的“p代表質(zhì)粒；“BR”代表兩位兩位研究者Bolivar和Rogigerus姓氏的字首，“322”是實(shí)驗(yàn)編號。 質(zhì)粒載體pBR322的大小為4361bp,相對分子質(zhì)量較小的是它第一個優(yōu)點(diǎn)。優(yōu)點(diǎn)之二是它帶有一個復(fù)制起始位點(diǎn)，保證了該質(zhì)粒只在大腸桿菌的細(xì)胞中行使復(fù)制的功能。具有兩種抗生素抗性基因，可供轉(zhuǎn)化子的選擇標(biāo)記是它的第三個優(yōu)點(diǎn)。質(zhì)粒載體pBR322的第四個優(yōu)點(diǎn)是具有較高的拷貝數(shù)，經(jīng)過氯霉素?cái)U(kuò)增以后，每個細(xì)胞中可累積1000-3000份拷貝，該特性為重組體

4、DNA的制備提供了極大的方便。構(gòu)建質(zhì)粒載體所用的方法基本上是分子克隆技術(shù)，是在分子水平上提供一種純化和擴(kuò)增特定DNA片段的方法。常含有目的基因，用體外重組方法將它們插入克隆載體，形成重組克隆載體，通過轉(zhuǎn)化與轉(zhuǎn)導(dǎo)的方式，引入適合的寄主體內(nèi)得到復(fù)制與擴(kuò)增，然后再從篩選的寄主細(xì)胞內(nèi)分離提純所需的克隆載體，可以得到插入DNA的許多拷貝，從而獲得目的基因的擴(kuò)增。 2. 材料方法 2.1目的DNA的獲得 2.1.1 引物設(shè)計(jì)第一次引物設(shè)計(jì)： 正向引物： sinn3F 冰盒標(biāo)注：P2a 引物序列：5 AAGCAAAATCTAACCGTGTAATGTA3 引物長度：25bp 反向引物：sinn3R 冰盒標(biāo)注：

5、P2b 引物序列：5 GCAAGAGCGTCGTTTGTAGTTA3 引物長度：22bp第二次引物設(shè)計(jì)（帶酶切位點(diǎn)）： 正向引物： sinn3FE 冰盒標(biāo)注：P2c 引物序列：5 ACTGGATCC AAGCAAAATCTAACCGTGTAATGTA3 引物長度：34bp 反向引物：sinn3RE 冰盒標(biāo)注：P2d 引物序列：5 TCACTGCAGCTCATAAGACCAAAGAACGTTTCTT3 引物長度：34bp2.1.2 PCR擴(kuò)增 2.1.2.1 PCR技術(shù)的基本原理PCR即聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng),是指在DNA聚合酶的催化下,以母鏈DNA為模板,以特定引物為延伸起點(diǎn),通過變性、延伸、復(fù)性等步

6、驟,體外復(fù)制出與母鏈模板DNA互補(bǔ)的子鏈DNA的過程.是一項(xiàng)DNA體外合成放大技術(shù),可用于基因分離克隆,序列分析,基因表達(dá)調(diào)控,基因多態(tài)性研究等許多方面. PCR反應(yīng)五要素： 參加PCR反應(yīng)的物質(zhì)主要有五種即引物、酶、dNTP、模板和Mg2PCR反應(yīng)的基本步驟: 1.變性: 高溫使雙鏈DNA解離成單鏈.（94 30s） 2.退火:低溫下引物與模板DNA互補(bǔ)區(qū)結(jié)合形成雜交分子.（55 30s） 3.延伸:中溫延伸. 在DNA聚合酶、dNTP、Mg2+存在下, DNA聚合酶催化以引物為起始點(diǎn)的DNA鏈5向3方向的延伸,合成出與模板DNA鏈互補(bǔ)的DNA子鏈. （70-72 30-60s） 以上三個步

7、驟為一循環(huán),每一循環(huán)的產(chǎn)物均可作為下一循環(huán)的模板,經(jīng)過n次循環(huán)后,目的DNA以2n形式增加.2.1.2.2 PCR檢測PCR反應(yīng)擴(kuò)增出了高的拷貝數(shù)，下一步檢測就成了關(guān)鍵。熒光素（溴化乙錠，EB）染色瓊脂糖凝膠電泳是最最常用的檢測手段。電泳法檢測特異性是不太高的，因此引物兩聚體等非特異性的雜交體很容易引起誤判。但因?yàn)槠浜喗菀仔校蔀榱酥髁鳈z測方法2.1.2.3 PCR反應(yīng)體系第一次PCR擴(kuò)增:調(diào)整PCR反應(yīng)體系中各成份、組成及反應(yīng)條件,經(jīng)多次反復(fù)試驗(yàn)結(jié)果得出下面的體系可得到清晰明亮的目的DNA電泳條帶（1kb）: PCR反應(yīng)體系2*100ul（每管25ul,共8管） Pyrobest 2ul b

8、uffer（10x） 10ul WT4（模板） 2ul P2a（10uM） 4ul P2b（10uM） 4ul dNTP（2.5x） 2ul ddH2O 76ulPCR反應(yīng)條件: 94 5min 30 cycles: 94 40s 53 40s 72 2min30s 72 10min 4 forever 將擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳（方法見2.1.3電泳）,切膠回收目的DNA條帶,共切3管,分別標(biāo)注A、B、C.首先用25ul約60的無菌蒸餾水洗脫A管一次,洗脫液標(biāo)注1,分別用15ul的無菌蒸餾水洗脫B管和C管,得到的DNA洗脫液標(biāo)注2,最后各用30ul的無菌蒸餾水洗脫A、B、C管,得到的DNA

9、洗脫液分別標(biāo)注a、b、c.第二次PCR擴(kuò)增（帶酶切位點(diǎn)）: 分別用DNA的洗脫液2、a、b、c為模板,進(jìn)行第二次PCR擴(kuò)增,設(shè)計(jì)反應(yīng)體系（各25ul）如下: 模板2 模板a 模板b 模板c Pyrobest 0.5ul 0.5ul 0.5ul 0.5ul buffer（10x） 2.5ul 2.5ul 2.5ul 2.5ul 模板 0.5ul 2ul 4ul 6ul P2a（10uM） 1ul 1ul 1ul 1ul P2b（10uM） 1ul 1ul 1ul 1ul dNTP（2.5x） 0.5ul 0.5ul 0.5ul 0.5ul ddH2O 19ul 17.5ul 15.5ul 13.

10、5ulPCR反應(yīng)條件: 94 5min 30 cycles: 94 40s 54 40s 72 2min30s 72 10min 4 forever電泳結(jié)果表明:以2管和c管為模板可得到明顯的目的基因條帶,依據(jù)此次電泳結(jié)果,可先后再利用PCR擴(kuò)增（各100ul,每管25ul,共8管） PCR反應(yīng)體系2*100ul（每管25ul,共8管） 模板2 模板c Pyrobest 2ul 2ul buffer（10x） 10ul 10ul 模板 4ul 40ul P2a（10uM） 4ul 4ul P2b（10uM） 4ul 4ul dNTP（2.5x） 2ul 2ul ddH2O 74ul 38ulP

11、CR反應(yīng)條件: 94 5min 30 cycles: 94 40s 54 40s 72 2min30s 72 10min 4 forever電泳條帶明顯而且明亮,切膠回收保存待用.。2.1.3 電泳 2.1.3.1 配膠 配制適量的電泳及制膠用的緩沖液（1X TAE Buffer） 根據(jù)制膠量和凝膠濃度，準(zhǔn)確稱量瓊脂糖粉（1g）,加入適當(dāng)?shù)腻F形瓶中。 加入一定量的電泳緩沖液（1X TAE Buffer 100ml）。 熔化完全，冷卻至600C左右，加入EB5-7ul，充分混勻。 將溶液倒入制膠模中，之前應(yīng)在適當(dāng)位置插上梳子。 室溫下凝固，不立即使用時，可用保鮮膜將凝膠包好后放40C 保存，一般

12、可保存2-5天。2.1.3.2 電泳 取適量的PCR產(chǎn)物與適量的溴酚藍(lán)混合混勻后加入凝膠槽中，另取適量的DNA Maker 加入右邊槽中，開始電泳。2.1.3.3 紫外觀察電泳條帶 當(dāng)溴酚藍(lán)跑到適當(dāng)位置時，在紫外光下觀察目的基因的電泳條帶（1kb處） 2.1.4 切膠回收目的DNA切膠回收目的DNA的方法步驟： 操作流程見右圖，全套操作約需30分鐘，詳細(xì)說明如下。1. 使用TAE緩沖液或TBE緩沖液制作瓊脂糖凝膠，然后對目的DNA進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳。2. 在紫外燈下切出含有目的DNA的瓊脂糖凝膠，用紙巾吸盡凝膠表面的液體。此時應(yīng)注意盡量切除不含目的DNA部分的凝膠，盡量減小凝膠體積，提高DNA

13、回收率。注）切膠時請注意不要將DNA長時間暴露于紫外燈下，以防止DNA損傷。凝膠濃度 DR-I Buffer使用量1.0%3個凝膠體積量1.0%1.5%4個凝膠體積量1.5%2.0%5個凝膠體積量3. 切碎膠塊。膠塊切碎后可以加快操作步驟6的膠塊融化時間，提高DNA的回收率。4. 稱量膠塊重量，計(jì)算膠塊體積。計(jì)算膠塊體積時，以1 mg=1 l進(jìn)行計(jì)算。5. 向膠塊中加入膠塊融化液DR-I Buffer，DR-I Buffer的加量如下表： 6. 均勻混合后75加熱融化膠塊（低熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠只需在45加熱）。此時應(yīng)間斷振蕩混合，使膠塊充分融化（約610分鐘）。注）膠塊一定要充分融化，否則將會嚴(yán)重

14、影響DNA的回收率。7. 向上述膠塊融化液中加入DR-I Buffer量的1/2體積量的DR-II Buffer，均勻混合。當(dāng)分離小于400 bp的DNA片段時，應(yīng)在此溶液中再加入終濃度為20%的異丙醇。8. 將試劑盒中的Spin Column安置于Collection Tube上。9. 將上述操作7的溶液轉(zhuǎn)移至Spin Column中，3,600 rpm離心1分鐘（如Spin Column中有液體殘留，可適當(dāng)提高離心速度，再離心1分鐘），棄濾液。注）如將濾液再加入Spin Column中離心一次，可以提高DNA的回收率。10. 將500 l的Rinse A加入Spin Column中，3,6

15、00 rpm離心30秒，棄濾液。11. 將700 l的Rinse B加入Spin Column中，3,600 rpm離心30秒，棄濾液。12. 重復(fù)操作步驟11，然后12,000 rpm再離心1分鐘。13. 將Spin Column安置于新的1.5 ml的離心管上，在Spin Column膜的中央處加入25 l的60水或洗脫液，室溫靜置1分鐘。14. 12,000 rpm離心1分鐘洗脫DNA。 2.1.5 目的DNA加尾 用25ul的無菌蒸餾水洗脫DNA，再用20ul的無菌蒸餾水洗脫，共得約40ul的洗脫液，然后抽真空使其濃縮至約8ul。加尾10ul體系： 8ul DNA 1ul Buffer

16、（10x） 0.5ul dATP 0.5ul Taq酶PCR條件：72 30-40min 降至4即可 2.1.6 連接T-DNA 連接10ul體系： 1 ul T4 ligase 1 ul Buffer（10x） 1 ul T-DNA 7 ul DNA-PolyA 連接條件： 4000rpm甩30sec 4過夜2.2 感受態(tài)DH5的制備2.2.1 基本原理 轉(zhuǎn)化是將外源DNA分子引入受體細(xì)菌,使之獲得新的遺傳性狀. 受體細(xì)菌一般是限制修飾系統(tǒng)缺陷的變異株,不含限制性內(nèi)切酶和甲基化酶的突變體,可以容忍外源的DNA分子進(jìn)入體內(nèi)并穩(wěn)定地遺傳給后代,受體細(xì)胞經(jīng)過一些特殊的方法,如電擊、CaCl2等化學(xué)

17、試劑處理后,細(xì)胞膜的通透性增加,成為感受態(tài)細(xì)胞,使外源的DNA分子可以進(jìn)入. 2.2.2 方法步驟目前常用的感受態(tài)細(xì)胞制備方法有電擊法和CaCl2法, 電擊法制備效率較高,但CaCl2法簡單易行,且其轉(zhuǎn)化效率可以滿足一般的實(shí)驗(yàn)要求,因此CaCl2法使用更為廣泛. CaCl2法制備感受態(tài)大腸桿菌的方法步驟: 準(zhǔn)備: （1） 配制0.05mol/l的CaCl2-15的甘油混合溶液,高溫高壓滅菌. 注: CaCl2必須為分析純以上,（2） 實(shí)驗(yàn)中所需要的所有試管、培養(yǎng)瓶、離心管等均要用去離子水徹底清洗干凈,高溫高壓滅菌. 注:最好有用于制備感受態(tài)細(xì)胞的一套專用器材.（3）受體菌的培養(yǎng):從非選擇性LB

18、培養(yǎng)基上挑取E.coli單菌落,接種于3-5ml LB液體培養(yǎng)基中, 37振蕩培養(yǎng)過夜至對數(shù)生長期中后期.將該菌懸液以1:100的比例接種于50-100ml LB培養(yǎng)基中, 37振蕩培養(yǎng)2.5小時至OD600=0.5. 注:培養(yǎng)時間不宜超過2.5小時,否則不能達(dá)到最高轉(zhuǎn)化效率.實(shí)驗(yàn)步驟:（1）細(xì)菌的收獲:培養(yǎng)液冰浴5分鐘后,45000rpm離心5分鐘.（2）用欲冷的去離子水洗滌沉淀, 45000rpm離心5分鐘.（3）沉淀加入2ml欲冷的0.05mol/l的CaCl2-15的甘油混合溶液,輕吹散,冰浴5分鐘, 0.05mol/l的CaCl2-15的甘油混合溶液（4）沉淀加入2ml欲冷的0.05

19、mol/l的CaCl2-15的甘油混合溶液,輕吹散,即成為感受態(tài)細(xì)胞懸液.分裝成50-100ul的小份,置于-70可保存半年.注:最好在兩個月內(nèi)用完,然后重新制備.若要進(jìn)一步提高轉(zhuǎn)化效率,可將加入的溶液體積減少到1ml或分裝成200ul/管. 電轉(zhuǎn)化法制備感受態(tài)大腸桿菌的方法步驟:（1）前夜接種受體菌（DH5）,挑取單菌落于LB培養(yǎng)基中37搖床培養(yǎng)過夜.（2）取2ml過夜培養(yǎng)物接種于200ml LB培養(yǎng)基中, 37搖床上劇烈振蕩培養(yǎng)至OD600=0.5（約2.5-3小時）.（3）將菌液迅速置于冰上,以下步驟務(wù)必在超凈工作臺和冰上操作.（4）吸取1.5ml培養(yǎng)好的菌液至1.5ml離心管中,在冰上冷卻10分鐘.（5）43000rpm冷凍離心5分鐘（6）棄去上清,加入1500ul冰冷的10甘油,用移液槍上下吸動打勻,使細(xì)胞重新懸浮.（7）43000rpm冷凍離心5分鐘（8）棄去上清,加入750ul冰冷的10甘油,用移液槍上下吸動打勻,使細(xì)胞重新懸浮.（9）43000rpm冷凍離心5分鐘（10）加入20ul冰冷的10甘油,用移液槍上下吸動打勻,使細(xì)胞重新懸浮.（11）立即使用或迅速置于-70超低溫保存.2.3 轉(zhuǎn)化 2.3.1 基本原理 感受態(tài)就是細(xì)菌吸收轉(zhuǎn)化因子的生理狀態(tài),只