生物素親合素放大技術(shù)優(yōu)秀課件

1、生物素親合素放大技術(shù)優(yōu)秀第第十一章十一章 - -親合素放親合素放大技術(shù)大技術(shù)生物素親合素放大技術(shù)優(yōu)秀生物素（生物素（biotin,Bbiotin,B）是一是一種小分子生長因子種小分子生長因子,又稱維生又稱維生素素H或輔酶或輔酶R動、植物組織中廣泛分布動、植物組織中廣泛分布, ,卵黃和肝含量高卵黃和肝含量高MW 244.31kD.MW 244.31kD.I I環(huán)為環(huán)為咪唑酮環(huán)咪唑酮環(huán)，可與親合可與親合 素結(jié)合素結(jié)合環(huán)為環(huán)為噻吩環(huán)噻吩環(huán)，C2C2上戊酸上戊酸 側(cè)鏈的未端羧基是結(jié)合生側(cè)鏈的未端羧基是結(jié)合生 物大分子的唯一結(jié)構(gòu)物大分子的唯一結(jié)構(gòu) 羧基羧基第一節(jié)第一節(jié) 生物素理化性質(zhì)與標記生物素理化性質(zhì)

2、與標記生物素親合素放大技術(shù)優(yōu)秀一、活化生物素一、活化生物素 生物素側(cè)鏈的末生物素側(cè)鏈的末端羧基經(jīng)化學修端羧基經(jīng)化學修飾后制成帶各種飾后制成帶各種活性基團的衍生活性基團的衍生物物活化生物素活化生物素( (生物素化衍生物生物素化衍生物) )生物素親合素放大技術(shù)優(yōu)秀生物素活化生物素活化活化生物素易活化生物素易與抗原、抗體與抗原、抗體酶及核酸分子酶及核酸分子中相應(yīng)基團偶中相應(yīng)基團偶聯(lián)形成生物素聯(lián)形成生物素化標記物化標記物 標記蛋白質(zhì)標記蛋白質(zhì)氨基氨基的活化生物素的活化生物素 標記蛋白質(zhì)標記蛋白質(zhì)醛基醛基的活化生物素的活化生物素 標記蛋白質(zhì)標記蛋白質(zhì)巰基巰基的活化生物素的活化生物素 標記標記核酸核酸的活

3、化生物素的活化生物素 生物素親合素放大技術(shù)優(yōu)秀CNHNHCHCH2CHCHOS(CH2)4COOHNH2COCH2CH2CONHOHCOONCOOCCH2CH2EDC標記蛋白質(zhì)氨基的活化生物素標記蛋白質(zhì)氨基的活化生物素生物素生物素N-N-羥基丁二酰胺羥基丁二酰胺生物素羥基生物素羥基琥珀酰亞胺琥珀酰亞胺酯（酯（BNHS BNHS ）生物素親合素放大技術(shù)優(yōu)秀活化生物素活化生物素BNHSBNHS分子可與蛋白質(zhì)分子可與蛋白質(zhì) 賴氨酸的氨基形成肽鍵賴氨酸的氨基形成肽鍵 BNHSBNHS適用標記抗體和適用標記抗體和 中性或偏堿性的蛋白質(zhì)中性或偏堿性的蛋白質(zhì)如何減小空間位阻？如何減小空間位阻？長臂活化生物素

4、長臂活化生物素（BCNHSBCNHS）：）：生物素和生物素和N-N-羥基丁二酰亞胺之間添羥基丁二酰亞胺之間添加了兩個加了兩個6-6-氨基已糖分子基團，形氨基已糖分子基團，形成連結(jié)臂，生物素與大分子基團的成連結(jié)臂，生物素與大分子基團的距離距離 生物素親合素放大技術(shù)優(yōu)秀標記蛋白質(zhì)醛基的活化生物素標記蛋白質(zhì)醛基的活化生物素生物素酰肼生物素酰肼(BHZ)(BHZ)：水合肼與生物素的合成物水合肼與生物素的合成物 主要用于標記偏酸性糖蛋白主要用于標記偏酸性糖蛋白 肼化生物胞素肼化生物胞素(BCHZ)(BCHZ) ：生物素與賴氨酸連接：生物素與賴氨酸連接 后，再與無水肼反應(yīng)而成。后，再與無水肼反應(yīng)而成。 除

5、醛基外，除醛基外， BCHZBCHZ還可標記氨基還可標記氨基生物素親合素放大技術(shù)優(yōu)秀標記蛋白質(zhì)巰基的活化生物素標記蛋白質(zhì)巰基的活化生物素馬來酰亞胺馬來酰亞胺- -丙酰丙酰- -生物胞素（生物胞素（MPB)MPB)能特異地與蛋白質(zhì)巰基結(jié)合的活化能特異地與蛋白質(zhì)巰基結(jié)合的活化生物素生物素 生物素親合素放大技術(shù)優(yōu)秀標記核酸的活化生物素標記核酸的活化生物素光敏生物素光敏生物素(photobiotin)(photobiotin) 側(cè)鏈上連接的芳香基疊氮物基團側(cè)鏈上連接的芳香基疊氮物基團, , 經(jīng)光照后經(jīng)光照后, , 變?yōu)榉枷阕優(yōu)榉枷慊趸?，可直接與腺嘌呤氨基結(jié)合基硝基苯，可直接與腺嘌呤氨基結(jié)合, ,

6、形成形成B-B-核酸探針核酸探針 N3NO2NH(CH2)3N(CH2)3CH3NHC(CH2)4SNHNHO生物素親合素放大技術(shù)優(yōu)秀生物素脫氧核苷三磷酸生物素脫氧核苷三磷酸（Bio-dUTP） 作為作為TTPTTP的結(jié)構(gòu)類似物，可采用缺口移的結(jié)構(gòu)類似物，可采用缺口移 位法摻入到雙鏈位法摻入到雙鏈DNADNA中。中。BNHS和和BHZ 可直接標記核酸，可直接標記核酸，但對但對堿基配對堿基配對有影有影響。響。生物素親合素放大技術(shù)優(yōu)秀二、生物素標記蛋白質(zhì)二、生物素標記蛋白質(zhì)活化生物素通過側(cè)鏈與蛋白分子連接；活化生物素通過側(cè)鏈與蛋白分子連接；一個蛋白分子可被多個生物素標記多價性；一個蛋白分子可被多個

7、生物素標記多價性；對對BNHS多標記抗體多標記抗體, BHZ則多標記微酸性抗原；則多標記微酸性抗原； 抗原、抗體標記后活性不變；抗原、抗體標記后活性不變；可對標記材料（如酶）標記：可對標記材料（如酶）標記：堿性磷酸酶標記后堿性磷酸酶標記后 活性將降低；活性將降低；生物素親合素放大技術(shù)優(yōu)秀選擇活化生物素：選擇活化生物素：依抗原或抗體分子所帶可標記基團依抗原或抗體分子所帶可標記基團 的種類（氨基、醛基或巰基）以及分子的酸堿性；的種類（氨基、醛基或巰基）以及分子的酸堿性；控制生物素：控制生物素：蛋白質(zhì)比例蛋白質(zhì)比例 生物素：生物素：IgG IgG 用量比用量比(mg/mg)宜為宜為2:1, IgG2

8、:1, IgG應(yīng)用濃度應(yīng)用濃度 0.50.55 5g/ml; 生物素生物素1 13 3個個/Ag/Ag，3 35 5個個/Ab/Ab；使用交聯(lián)臂減少空間阻力使用交聯(lián)臂減少空間阻力生物素親合素放大技術(shù)優(yōu)秀第二節(jié)第二節(jié) 親合素、鏈霉親合素的理化親合素、鏈霉親合素的理化性質(zhì)與標記性質(zhì)與標記親合素親合素(avidin, AV) 和鏈霉親合素和鏈霉親合素(streptavidin, SA)是生物素的天然特異性結(jié)合是生物素的天然特異性結(jié)合物。而且，二者均為大分子蛋白，因此幾乎所物。而且，二者均為大分子蛋白，因此幾乎所有用于標記的物質(zhì)均可以同親合素（有用于標記的物質(zhì)均可以同親合素（AV）或鏈）或鏈酶親合素（

9、酶親合素（SA）結(jié)合。）結(jié)合。 生物素親合素放大技術(shù)優(yōu)秀結(jié)構(gòu)結(jié)構(gòu) 四亞基糖蛋白四亞基糖蛋白 四肽鏈蛋白四肽鏈蛋白 無糖基無糖基PI PI 10.5 610.5 6結(jié)合位結(jié)合位 色氨酸色氨酸 色氨酸色氨酸生物素生物素 4 44 4Ka Ka 10 1015 15 10 101515活性活性 131315 1515 151818一、理一、理 化化 特特 性性生物素親合素放大技術(shù)優(yōu)秀二、親合素二、親合素/鏈霉親合素標記鏈霉親合素標記標記物：小分子示蹤物125I、膠體金、熒光素、化學發(fā)光物 大分子物質(zhì)如酶抗原、抗體親和素的標記：HRP的標記 改良過碘酸鈉法 戊二醛法生物素親合素放大技術(shù)優(yōu)秀過碘酸鹽氧化

10、法過碘酸鹽氧化法OOOOOONaIO4OOOHOOOHOH+ NH2AvidinOOONNAvidinAvidinH2ONAvdinNaBH4Schiff堿酶-五炭糖環(huán)生物素親合素放大技術(shù)優(yōu)秀戊二醛法戊二醛法酶酶NHNH2 2親和素親和素NHNH2 2(CH2 2)3 3CHOCHO(CH2 2)3 3CHN酶酶CHN親和素親和素生物素親合素放大技術(shù)優(yōu)秀B-E + A ABC2.親和素生物素化HRP復(fù)合物的制備生物素親合素放大技術(shù)優(yōu)秀鏈霉親和素的標記方法：過碘酸鈉法HRP+NaIO4+SA 透析+KBH4 沉淀生物素親合素放大技術(shù)優(yōu)秀過碘酸鹽氧化法過碘酸鹽氧化法OOOOOONaIO4OOOHO

11、OOHOH+ NH2SAvidinOOONNSAvidinSAvidinH2ONAvdinKBH4Schiff堿酶-五炭糖環(huán)生物素親合素放大技術(shù)優(yōu)秀第三節(jié)第三節(jié) 生物素生物素- -親合素系統(tǒng)的特點親合素系統(tǒng)的特點一、靈敏度高一、靈敏度高二、特異性強二、特異性強三、穩(wěn)定性好三、穩(wěn)定性好四、適用性廣四、適用性廣五、其他五、其他生物素親合素放大技術(shù)優(yōu)秀第四節(jié)第四節(jié) 生物素生物素- -親合素系統(tǒng)的應(yīng)用親合素系統(tǒng)的應(yīng)用生物素與親合素之間結(jié)合的親合力生物素與親合素之間結(jié)合的親合力高、特異性強，各自均可以與各型大小高、特異性強，各自均可以與各型大小分子結(jié)合，以及二者在結(jié)合反應(yīng)時具有分子結(jié)合，以及二者在結(jié)合反

12、應(yīng)時具有的多級放大作用等優(yōu)越性，使的多級放大作用等優(yōu)越性，使BASBAS及其相及其相關(guān)技術(shù)被廣泛應(yīng)用在各種標記免疫分析關(guān)技術(shù)被廣泛應(yīng)用在各種標記免疫分析技術(shù)領(lǐng)域中，尤其為標記免疫檢測自動技術(shù)領(lǐng)域中，尤其為標記免疫檢測自動化分析做出了極大的貢獻?；治鲎龀隽藰O大的貢獻。 生物素親合素放大技術(shù)優(yōu)秀一、生物素一、生物素- -親合素系統(tǒng)基本類型及親合素系統(tǒng)基本類型及原理原理BABBAB法：法： Ag+BAg+BAb Ag-AbAb Ag-AbB B A A Ag-Ab Ag-AbB-A B-A B BE E Ag-Ab Ag-AbB-A-BB-A-BE E 特點：以游離特點：以游離A A分別連接分別連

13、接B-AbB-Ab和和B-E B-E 生物素親合素放大技術(shù)優(yōu)秀+A+A生物素親合素放大技術(shù)優(yōu)秀 ABC ABC法法 A+BA+BE A- BE A- BE-ABCE-ABC Ag+B Ag+BAb Ag-AbAb Ag-AbB B ABCABC Ag-Ab Ag-AbB-ABC B-ABC 特點特點: :將將BABBAB法中的法中的A A先與先與B-EB-E結(jié)合，制備成復(fù)合物結(jié)合，制備成復(fù)合物ABCABC生物素親合素放大技術(shù)優(yōu)秀+ABCB-E + A ABCAb-Ag-Ab-B + ABC Ab-Ag-Ab-B-ABC 生物素親合素放大技術(shù)優(yōu)秀BABA法法Ag+BAg+BAb Ag-AbAb

14、Ag-AbB B A AE E Ag-Ab Ag-AbB-AB-AE E特點：以特點：以A-E/SA-EA-E/SA-E代替代替BABBAB法中的法中的A A，省，省 卻了加卻了加B-EB-E的步驟的步驟生物素親合素放大技術(shù)優(yōu)秀 Ag-Ab1-Ab2-B + A-E Ag-Ab1-Ab2-B-A-E+A-E生物素親合素放大技術(shù)優(yōu)秀BAS實驗方法及反應(yīng)層次方法反應(yīng)層次直接法BAAg-(Ab-B)-A*BABAg- (Ab-B)-A-B*ABCAg- (Ab-B)-AB*C間接法BAAg-Ab1-(Ab2-B)-A*BABAg-Ab1- (Ab2-B)-A-B*ABCAg- Ab1- (Ab2-B

15、)-AB*C生物素親合素放大技術(shù)優(yōu)秀二、生物素二、生物素- -親合素系統(tǒng)在酶免疫測定親合素系統(tǒng)在酶免疫測定中的應(yīng)用中的應(yīng)用BASBAS在在ELISAELISA中的應(yīng)用中的應(yīng)用 生物素生物素- -親合素系統(tǒng)在均相酶免疫測定親合素系統(tǒng)在均相酶免疫測定 生物素親合素放大技術(shù)優(yōu)秀AB固相化抗原或抗體B生物素親合素放大技術(shù)優(yōu)秀電化學發(fā)光免疫測定示意圖電化學發(fā)光免疫測定示意圖 生物素親合素放大技術(shù)優(yōu)秀用于終反應(yīng)的放大生物素親合素放大技術(shù)優(yōu)秀三、生物素三、生物素- -親合素系統(tǒng)在熒光免疫親合素系統(tǒng)在熒光免疫技術(shù)中的應(yīng)用技術(shù)中的應(yīng)用 BAS BAS用于熒光抗體技術(shù)，通常采用用于熒光抗體技術(shù)，通常采用BABA法

16、，即用法，即用熒光素直接標記親合素（或鏈酶親合素）；熒光素直接標記親合素（或鏈酶親合素）；也可采用游離親合素（或鏈酶親合素）搭橋，也可采用游離親合素（或鏈酶親合素）搭橋，兩端分別連接生物素化抗體和熒光素標記的兩端分別連接生物素化抗體和熒光素標記的生物素（生物素（BABBAB法）或熒光標記的抗親合素（或法）或熒光標記的抗親合素（或鏈酶親合素）抗體的夾心法。鏈酶親合素）抗體的夾心法。 生物素親合素放大技術(shù)優(yōu)秀四、生物素四、生物素- -親合素系統(tǒng)在放射免疫親合素系統(tǒng)在放射免疫測定中的應(yīng)用測定中的應(yīng)用BASBAS主要與免疫放射分析主要與免疫放射分析(IRMA)(IRMA)檢測體系偶檢測體系偶聯(lián)，用于對

17、終反應(yīng)的放大（聯(lián)，用于對終反應(yīng)的放大（BABA法）法） BASBAS也可用于也可用于IRMAIRMA反應(yīng)后反應(yīng)后B B、F F成分的分離成分的分離 生物素親合素放大技術(shù)優(yōu)秀五、生物素五、生物素- -親合素系統(tǒng)在分子生物親合素系統(tǒng)在分子生物學中的應(yīng)用學中的應(yīng)用以生物素標記核酸探針進行的定位檢測以生物素標記核酸探針進行的定位檢測用用BAS制備的親和吸附劑進行基因的分離制備的親和吸附劑進行基因的分離純化純化將免疫測定技術(shù)與將免疫測定技術(shù)與PCR結(jié)合建立免疫結(jié)合建立免疫-PCR(immuno-PCR)用于抗原的檢測用于抗原的檢測 生物素親合素放大技術(shù)優(yōu)秀Anti-HCVSandwich princip

18、le.Total duration:18minutes.1st incubation:40L of sample,60 L of reagent containing biotinylated HCV antigens and 60 L of a reagent containing HCV antigens labeled with a ruthenium complex react to form a sandwich complex.2nd incubation:After addition of strepetavidin-coated microparticles,the compl

19、ex becomes bound to the solid phase via interaction of biontin and streptavidin.生物素親合素放大技術(shù)優(yōu)秀The reaction mixture is aspirated into the measuring cell where the microparticles are magnetically captured onto the surface of the electrode.Unbound substances are then removed with ProCell.Application of a

20、 voltage to the electrode then induces chemiluminescent emission which is measured by a photomultiplier.Results are determined automatically by the Elecsys software by comparing the electrochemiluminescence signal obtained from the sample with the cutoff value obtained by anti-HCV calibration.生物素親合素

21、放大技術(shù)優(yōu)秀HBsAgIISandwich principle.Total duration of assay:18 minutes.1st incubation:50 L of sample,two biotinylated monoclonal anti-HBsAg antibodies, and a mixture of monoclonal anti-HBsAg antibody and polyclonal anti-HBsAg antibodies labeled with a ruthenium complex form a sandwich complex.2nd:incuba

22、tion:After addition of streptavidin-coated microparticles,the complex becomes bound to the solid phase via interaction of biotin and streptavidin.生物素親合素放大技術(shù)優(yōu)秀Anti-HBeCompetition principle.1st:incubation:Anti-HBe in the sample (35 L) binds to the added HBeAg.2nd incubation:After addition of biotinyla

23、ted antibodies and ruthenium complex-labeled antibodies specific for HBeAg,together with streptavdin-coated microparticles,the still-free binding sites on the HBe-antigens become occupied.The entire complex is then bound to the solid phase via interaction of biotin and streptavdin.生物素親合素放大技術(shù)優(yōu)秀Anti-H

24、AV IgM-Capture test principle.Total duration of assay:18 minutes.1st incubation:Pretreatment of 10 L of the automatically 1:400 diluted sample(using Elecsys Diluent Universal )with anti-Fdy reagent to block specific in the presence of the monoclonal anti-HAV antibodies labeled with ruthenium complex

25、.生物素親合素放大技術(shù)優(yōu)秀2nd incubation:After addion of biotinylated monoclonal h-IgM-specific antibodies ,HAV antigen, and streptavdin-coated microparticles,the anti-HAV IgM antibodies present in the sample form a sandwich complex with the HAV antigen and the ruthenium-labeled anti-HAVantibody which becomes bo

26、und to the solid phase via interaction of biotin and streptavidin.生物素親合素放大技術(shù)優(yōu)秀Anti-HBsSandwich principle.1st incubation:Anti-HBs in the sample(40L),biotinylated HBsAg(ad/ay),and HBsAg(ad/ay)labeled with a ruthenium complex react to form a sandwich coplex.2nd incubation:After addition of strepavdin-coated microparticles,the comples becomes bound to the solid phase via interaction of biotin and streptavidin.生物素親合素放大技術(shù)優(yōu)