SDS-PAGE電泳常見問題

1、蛋白質(zhì)條帶為什么走到下面逐漸變寬發(fā)散？回答:多數(shù)情況是因?yàn)樾》肿釉谀z里的運(yùn)動(dòng)不規(guī)律，這種情況常發(fā)生在高濃度膠或凝固不一致的膠里，你可以加大陰極的緩沖液濃度，可能會有點(diǎn)改善膠凝的快慢不在于TEMED多少，在于APS的量，APS提供自由基，TEMED幫助自由基 作用，是催化劑，對凝固速度影響不是太大，可以試試加大APS的量丙烯酰胺在凝膠中的百分比分離膠的分辨范圍15%1545 kDa12.5%1560 kDa10%1875 kDa7.5%30120kDa5%60212kDa來源于蛋白質(zhì)技術(shù)手冊汪家政每種濃度的變性膠的分離范圍不是指能跑出哪個(gè)范圍分子量的蛋白質(zhì)，而是指在這個(gè)區(qū)間內(nèi)，蛋白質(zhì)遷移率基本和

2、分子量成正比，也就是線性關(guān)系，為了數(shù)據(jù)的可靠性，大家盡量根據(jù)這個(gè)來選擇自己配膠的濃度。下層也就是陽極緩沖液的作用當(dāng)然是導(dǎo)電，用普通T R I S緩 沖 液 做 陽 極 緩 沖 液 ， 一 樣 跑 得好，陰極就不一樣了，需要提供離子強(qiáng)度和SDS環(huán)境，而在電泳過程中，陰極緩沖液的一些離子損失，而且與樣品接觸，不適合再次使用至于有些時(shí)候跑太大濃度的膠，因?yàn)樗幤?，BUFFER配制過程的一些問題，導(dǎo)致會出現(xiàn)蛋白帶無法電泳到分離膠的最下方，膠跑得難看情況比較多，一般來說，15%的膠已經(jīng)能夠跑出大約15KDa左右的蛋白，對于普通SDS-PAGE已經(jīng)幾乎到了極限，還跑不出來的MARK帶，就不必去追究商品的問題

3、了SDS-PAGE膠的凝結(jié)速度受溫度影響很大，隨著溫度的升高，凝結(jié)速度越來越快，溫度降低則反之。所以，夏天時(shí)膠凝結(jié)的比較快，而冬天腳的凝結(jié)速度則變慢，甚至不能凝結(jié)，解決此類冋題較可行的方法是：冬天在原配方的基礎(chǔ)上加倍過硫酸銨和TEMED的使用量，可很好的解決膠凝結(jié)速度過慢的問題。做SDS-PAGE的時(shí)候，除了蛋白量上樣一致，最好體積也一致，這樣跑出來的膠各個(gè)泳道之間的band能做到一樣寬，方便后面的比較，特別是WB。做法就是拿1X的上樣緩沖補(bǔ)全 要加的樣做到體積一致，否則跑出來會有的寬有的窄，特別是上樣體積相差較大的加入染色液后，先放入微波爐里加熱5-10秒，使染色液微熱即可（千萬不要加熱太久

4、，否則冰醋酸就揮發(fā)了）。然后放水平搖床上搖20分鐘，最多半小時(shí)就染好了。脫色也很 簡單，不用脫色液，直接用去離子水，放微波爐里煮沸5分鐘左右，然后將水倒掉，再換上新的去離子水煮，這樣反復(fù)幾次，就可以了。效果可能比正常的脫色稍差一點(diǎn)點(diǎn)，不 如那樣清楚，只要電泳時(shí)比平時(shí)多上1/5的樣品就可以了，關(guān)鍵是這樣省時(shí)省材料（用不著含甲醇和冰醋酸的脫色液）。方便快捷！放心，反復(fù)煮膠不會把膠煮壞的。在做蛋白表達(dá)的時(shí)候，包涵體的出現(xiàn)常常令大家頭疼不已，現(xiàn)在給大家推薦鹽離子染SDS-PAGE的方法，這種方法簡單快速還干凈，適合于切膠免疫的同學(xué)，具體操作就是把 配好的0.5M的氯化鉀放在冰箱預(yù)冷，然后加在膠上慢慢晃

5、動(dòng)，大約5分鐘就可以看見你的蛋白條帶，切膠回收后直接乳化免疫，不會有什么影響。如果無法識別，還可以再用 實(shí)驗(yàn)室傳統(tǒng)的方法染色！ 拍膠時(shí)的黑十字”聚焦法！很多人用相機(jī)的微距聚焦都無法使識別框變綠，其實(shí)你只需要在膠所在的平面劃一個(gè)黑十字就可以很好的聚焦，尤其是western blot的圖，直接在膜的邊上劃就可以聚焦SDSPAGE的話可以找個(gè)顏色深東西放在膠的邊上就可以了，把鏡頭對準(zhǔn)它SDS-PAGE Laemmli法這種方法帖出來，大家是不是感覺非常的陌生呢？其實(shí)這種發(fā)方法很普遍，現(xiàn)在大 部分的實(shí)驗(yàn)室都是用Laemmli法跑電泳的。如今實(shí)驗(yàn)室中用的最多的蛋白電泳是源于Laemmli于1970年發(fā)表

6、在nature上的一篇文章中的方法，這篇文章很特別，不僅被引用的次數(shù)較多，而且該篇并不是專門闡述蛋白電泳 方法上的提出和改進(jìn)問題，而是對噬菌體頭部包裝過程中的蛋白進(jìn)行分析過程中用到電泳 分析方法而已，所以闡述如何操作的文字只有那么一小段（但相當(dāng)經(jīng)典）,這是SDS-PAGE（不連續(xù)系統(tǒng)）的首次成功應(yīng)用。現(xiàn)在我們在實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行的SDS-PAGE試劑的配方仍然是沿用了它的數(shù)據(jù)，許多論文在描述其SDS-PAGE時(shí)引用Laemmli方法，目前常用的具有濃縮膠和分離膠的不連續(xù)SDS-PAGE的基 礎(chǔ)的確來自Laemmli方法，但也略有差別例如一些緩沖液的具體組成。你也許會恍然大悟：原來我們用的就是Laemm

7、li！借鑒Tricine-SDS-PAGE中添加甘油或者尿素來提高分辨率的成功經(jīng)驗(yàn)，在普通的SDS-PAGE中加入約13%的甘油， 同樣可以提高分辨率， 有效防止小分子量蛋白的彌散。 只要把原來 配方中的水換成60%的甘油，就可以了。在分離膠中加尿素和甘油都可以，加上尿素和甘油改變膠的孔徑！特別是對分離糖蛋白的時(shí)候很有用處！ 一方面可以把條帶壓窄，減少拖尾現(xiàn)象的產(chǎn)生，另一方面對分離小分子量的蛋白有好處！一般加的量在0.53g尿素/12ml分離膠！自己可以跑來實(shí)驗(yàn)一下你跑9KD分子量的蛋白，建議用tricine-sds-page電泳來跑！也可以在分離膠中加尿素！自我經(jīng)驗(yàn)來看，加尿素會好于甘油！Q

8、:SDSPAGE電泳的基本原理？A:SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，是在聚丙烯酰胺凝膠系統(tǒng)中引進(jìn)SDS（十二烷基硫酸鈉），SDS會與變性的多肽，并使蛋白帶負(fù)電荷，由于多肽結(jié)合SDS的量幾乎總是與多肽的分子量成正比而與其序列無關(guān)，因此SDS多肽復(fù)合物在丙稀酰胺凝膠電泳中的遷移率只與多肽的大小有關(guān)，在達(dá)到飽和的狀態(tài)下，每克多肽可與1.4g去污劑結(jié)合。當(dāng)分子量在具體可參照郭堯君編著的蛋白質(zhì)電泳技術(shù)手冊P82-103。15KD到200KD之間時(shí)，蛋白質(zhì)的遷移率和分子量的對數(shù)呈線性關(guān)系，符合下式:logMW=K-bX，式中：MW為分子量，X為遷移率，k、b均為常數(shù)，若將已知分子量的標(biāo) 準(zhǔn)蛋白質(zhì)的遷移率對分子

9、量對數(shù)作圖，可獲得一條標(biāo)準(zhǔn)曲線，未知蛋白質(zhì)在相同條件下進(jìn)行電泳，根據(jù)它的電泳遷移率即可在標(biāo)準(zhǔn)曲線上求得分子量。Q:配膠緩沖液系統(tǒng)對電泳的影響？A:在SDSPAGE不連續(xù)電泳中，制膠緩沖液使用的是TrisHCL緩沖系統(tǒng)，濃縮膠是pH6.7，分離膠pH8.9;而電泳緩沖液使用的Tris甘氨酸緩沖系統(tǒng)。在濃縮膠中，其pH環(huán)境呈弱酸性，因此甘氨酸解離很少，其在電場的作用下，泳動(dòng)效率低；而CL離子卻很高，兩者之間形成導(dǎo)電性較低的區(qū)帶，蛋白分子就介于二者之間泳動(dòng)。由于導(dǎo)電性與電場強(qiáng)度成反比，這一區(qū)帶便形成了較高的電壓剃度，壓著蛋白質(zhì)分子聚集到一起，濃縮為一狹窄的區(qū)帶。當(dāng)樣品進(jìn)入分離膠后，由于膠中pH的增加

10、，呈堿性，甘氨酸大量解離，泳動(dòng)速率增加，直接緊隨氯離子之后，同時(shí)由于分離膠孔徑的縮小，在電場的作用下，蛋白分子根據(jù)其固有的帶電性和分子大小進(jìn)行分離。所以，pH對整個(gè)反應(yīng)體系的影響是至關(guān)重要的，實(shí)驗(yàn)中在排除其他因素之后仍不能很好解決問題的情況，應(yīng)首要考慮該因素。Q:樣品如何處理？A:根據(jù)樣品分離目的不同，主要有三種處理方法：還原SDS處理、非還原SDS處理、帶有烷基化作用的還原SDS處理。1、還原SDS處理：在上樣buffer中加入SDS和DTT（或3-巰基乙醇）后，蛋白質(zhì)構(gòu)象被解離，電荷被中和，形成SDS與蛋白相結(jié)合的分子，在電泳中，只根據(jù)分子量來分離。一般電泳均按這種方式處理，樣品稀釋適當(dāng)濃

11、度，加入 上樣Buffer，離心，沸水煮5min，再離心加樣。2、帶有烷基化作用的還原SDS處理：碘乙酸胺的烷基化作用可以很好的并經(jīng)久牢固的保護(hù)SH基團(tuán)，得到較窄的譜帶；另碘乙酸胺可捕集過量的DTT，而防止銀染時(shí)的紋理現(xiàn)象。100ul樣品緩沖液中10ul 20%的碘乙酸胺，并在室溫保溫30min。3、非還原SDS處理：生理體液、血清、尿素等樣品，一般只用1%SDS沸水中煮3min，未加還原劑，因而蛋白折疊未被破壞，不可作為測定 分子量來使用。Q：SDS-PAGE電泳凝膠中各主要成分的作用？A:聚丙烯酰胺的作用：丙烯酰胺與為蛋白質(zhì)電泳提供載體，其凝固的好壞直接關(guān)系到電泳成功與否，與促凝劑及環(huán)境密

12、切相關(guān)；制膠緩沖液：濃縮膠選擇pH6.7，分離膠選擇pH8.9，選擇trisHCl系統(tǒng)，具體作用后面介紹；TEMED與AP:促凝作用，加速聚丙烯酰胺的凝固；十二烷基硫酸鈉（SDS）:陽離子去污劑，作用有四：去蛋白質(zhì)電荷、解J離蛋白質(zhì)之間的氫鍵、取消蛋白分子內(nèi)的疏水作用、去多肽折疊。Q:提高SDS-PAGE電泳分辨率的途徑？A:1、聚丙烯酰胺的充分聚合，可提高凝膠的分辨率。建議做法：待凝膠在室溫凝固后，可在室溫下放置一段時(shí)間使用。忌即配即用或4度冰箱放置，前者易導(dǎo)致凝固不充分，后者可導(dǎo)致SDS結(jié)晶。一般凝膠可在室溫下保存4天，SDS可水解聚丙烯酰胺。2、一般常用的有氨基黑、考馬斯亮藍(lán)、銀染色三種

13、染料，不同染料又各自不同的染色方法，Q:微笑”（兩邊翹起中間凹下）形帶原因？A:主要是由于凝膠的中間部分凝固不均勻所致，多出現(xiàn)于較厚的凝膠中。處理辦法：待其充分凝固再作后續(xù)實(shí)驗(yàn)。Q:皺眉”（兩邊向下中間鼓起）形帶原因？A:主要出現(xiàn)在蛋白質(zhì)垂直電泳槽中，一般是兩板之間的底部間隙氣泡未排除干凈。處理 辦法：可在兩板間加入適量緩沖液，以排除氣泡。Q：為什么帶出現(xiàn)拖尾現(xiàn)象？A:主要是樣品融解效果不佳或分離膠濃度過大引起的。處理辦法：加樣前離心；選擇適 當(dāng)?shù)臉悠肪彌_液，加適量樣品促溶劑；電泳緩沖液時(shí)間過長，重新配制；降低凝膠濃 度。Q：為什么帶出現(xiàn)紋理現(xiàn)象？A:主要是樣品不溶性顆粒引起的。處理辦法：加樣

14、前離心；加適量樣品促溶劑。Q：什么是鬼帶”，如何處理？A:鬼帶”就是在跑大分子構(gòu)象復(fù)雜的蛋白質(zhì)分子時(shí)，常會出現(xiàn)在泳道頂端（有時(shí)在濃縮膠中）的一些大分子未知條帶或加樣孔底部有沉淀，主要由于還原劑在加熱的過程中被氧化而失去活性，致使原來被解離的蛋白質(zhì)分子重新折疊結(jié)合和和亞基重新締合，聚合成大分子，其分子量要比目標(biāo)條帶大，有時(shí)不能進(jìn)入分離膠。但它卻于目標(biāo)條帶有相同的免疫學(xué)活性，在WB反應(yīng)中可見其能與目標(biāo)條帶對應(yīng)的抗體作用。處理辦法：在加熱煮沸后，再添加適量的DTT或Beta巰基乙醇，以補(bǔ)充不足的還原劑；或可加適量EDTA來阻止還原劑的氧化。Q:為什么溴酚藍(lán)不能起到指示作用？A:我們在實(shí)驗(yàn)中常會遇到溴酚藍(lán)已跑出板底，但蛋白質(zhì)卻還未跑下來的現(xiàn)象。主要與緩 沖液和分離膠的濃度有關(guān)。處理辦法：更換正確pH值的Buffer;降低分離膠的濃度。Q：為什么電泳的條帶很粗？A:電泳中條帶很粗是常見的事，主要是未濃縮好的原因。處理辦法：適當(dāng)增加濃縮膠的長度；保證濃縮膠貯液的pH正確（6.7）；適當(dāng)降低電壓；Q:為什么電泳電壓很咼而電流