阿扎那韋手性中間體

1、阿扎那韋手性中間體(3S)-3-(叔丁氧羰基 ) 氨基 -1- 氯 -4- 苯基-(2R)- 丁醇的酶法制備研究阿扎那韋 (atazanavir sulfate,品名 Reyataz) 是一種具備抑制HIV 病毒蛋白酶功能的藥物 , 由諾華 (Novartis)公司 ( 瑞士 ) 研制。 2003 年經(jīng) FDA批準(zhǔn)上市。(3S)-3-(叔丁氧羰基 ) 氨基 -1- 氯-4- 苯基 -2- 丁醇是抗艾滋病藥物阿扎那韋等一些列藥物的手性合成前體, 可由 (3S)-3-(叔丁氧羰基 ) 氨基 -1- 氯-4- 苯基 -2-丁酮經(jīng)酮基還原酶催化還原制備。催化過程中氧化還原反應(yīng)普遍需要NADH、NADP

2、H以及 FAD等輔酶來提供還原力 , 在工業(yè)化生產(chǎn)中輔酶會(huì)帶來較高的成本導(dǎo)致酶催化制備法難以工業(yè)化。為解決這一關(guān)鍵性限制因素, 本文通過基因工程方法 , 借助 E.coliBL21(DE3)表達(dá)酮基還原酶 (KRED),并以此菌株的超聲破菌液為粗酶液催化還原(3S)-3-(叔丁氧羰基 ) 氨基 -1- 氯-4- 苯基 -2- 丁酮生成 (3S)-3-(叔丁氧羰基 ) 氨基 -1- 氯-4- 苯基 -(2R)- 丁醇。首先 , 根據(jù)新鞘氨醇桿菌 (Novosphingobium) 的短鏈脫氫酶的基因加以修飾作為目的基因序列 , 通過基因合成得到 KRED的基因片段。將 KRED片段重組到 pET

3、-28a 載體中 , 得到表達(dá)載體 pET-28a-kred 。然后將質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入 E.coli BL21(DE3) 中, 獲得重組菌 E.coli BL21-KRED 。經(jīng) IPTG 誘導(dǎo)表達(dá)后 ,SDS-PAGE分析結(jié)果表明在 34KD處有明顯條帶。 利用超聲破碎儀將菌體在緩沖液中超聲破碎制備粗酶液 , 對(duì)酶誘導(dǎo)表達(dá)條件進(jìn)行優(yōu)化結(jié)果顯示 E.coli BL21-KRED在 25,220r/min,0.2mmol/L 的誘導(dǎo)劑 IPTG誘導(dǎo)條件下誘導(dǎo)表達(dá) 8 小時(shí) , 可得到相同蛋白濃度下酶活最高的粗酶液。通過構(gòu)建重組表達(dá)菌株E.coliBL21-KRED,實(shí)現(xiàn)了含有酮基還原酶的粗酶液的發(fā)酵。

4、經(jīng)粗酶液催化 , 可將 (3S)-3-(叔丁氧羰基 ) 氨基 -1- 氯-4- 苯基 -2- 丁酮催化還原生成 (3S)-3-(叔丁氧羰基 ) 氨基 -1- 氯-4- 苯基 -(2R)- 丁醇。經(jīng)過反應(yīng)條件的優(yōu)化 , 利用 NAD+作為氫離子傳遞工具 , 由異丙醇提供還原力 , 將底物催化還原為產(chǎn)物 , 助溶劑甲苯、異丙醇以及粗酶液形成的兩相混合反應(yīng)體系是該反應(yīng)的特點(diǎn)。結(jié)果表明在 27,pH 為 10.0 的條件下反應(yīng)時(shí)間 15 小時(shí) ,(3S)-3-( 叔丁氧羰基 ) 氨基 -1- 氯 -4- 苯基 -(2R)- 丁醇的產(chǎn)量達(dá)到最高 , 在投料量 15 時(shí), 可以實(shí)現(xiàn)完全反應(yīng)。然后 , 利用硅藻土吸附實(shí)現(xiàn)產(chǎn)物的粗分離, 并設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)優(yōu)化了硅藻土吸附的時(shí)間、溫度以及使用硅藻土吸附處理的次數(shù), 得出在經(jīng)過 3 小時(shí)質(zhì)量為底物兩倍的硅藻土在 10%底物濃度的反應(yīng)液中達(dá)到飽和, 吸附的最佳溫度為40, 硅藻土的最佳處理次數(shù)為2 次。再使用乙酸乙酯洗脫硅藻土吸附的產(chǎn)物, 并設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)優(yōu)化了乙酸乙酯的浸泡時(shí)間、浸泡處理次數(shù), 得出使用反應(yīng)液 2 倍體積的乙酸乙酯浸泡質(zhì)量為底物質(zhì)量?jī)杀兜墓柙逋?/p>