探討少見諾卡菌的鑒定方法及藥物敏感性

1、探討少見諾卡菌的鑒定方法及藥物敏感性藥物分析論文名師推薦10篇之第三篇：探討少見諾卡菌的鑒定方法及藥物敏感性關(guān)鍵詞：諾卡菌； 鑒定； 藥物敏感性分析；Abstract:Objective To explore the identification method and drug sensitivity of Nocardia and improve the recognition of Nocardia.Methods Bacterial strains were identified by colony morphology,microscopic examination and mass

2、spectrometry,and the drug susceptibility tests were determined by broth microdilution method.Results Three rare Nocardia strains isolated from our hospital in the past two years were defined as Nocardia farcinica,Nocardia cyriacigeorgica,Nocardia otitidiscaviarumand the drug susceptibility tests sho

3、wed that the Nocardia farcinica was sensitive to nine antibiotics,including imipenem,moxifloxacin,compound sulfamethoxazole,ciprofloxacin,ceftriaxone,amoxicillin/clavulanicacid,minocycline,linezolid and amikacin;the Nocardia cyriacigeorgica was resistant to ciprofloxacin and amoxicillin/clavulanic a

4、cid,and sensitive to the other seven drugs above;The Nocardia otitidiscaviarum was resistant to imipenem,ceftriaxone,amoxicillin/clavulanic acid,and sensitive to the other six drugs above.Conclusion Mass spectrometer is helpful to improve the identification level of Nocardia.The sensitivity of Nocar

5、dia to antibiotics varies with species.Clinicians should guide clinical treatment with the results of drug sensitivity test.Keyword:Nocardia; identification; drug sensitivity analysis;諾卡菌屬為革蘭陽性需氧放線菌，感染通常由創(chuàng)傷相關(guān)細(xì)菌侵入或通過吸入方式導(dǎo)致1.利用表型和分子生物學(xué)方法，諾卡菌屬已被鑒定出89個(gè)種2.臨床感染患者標(biāo)本中分離到的諾卡菌以星形諾卡菌和巴西諾卡菌最常見，而皮疽諾卡菌、喬治教堂諾卡菌和豚鼠

6、耳炎諾卡菌報(bào)道中較少見。本文對本院近2年收治患者中3例少見諾卡菌的臨床鑒定和藥物敏感性試驗(yàn)進(jìn)行分析，以提高對諾卡菌感染的認(rèn)識，現(xiàn)報(bào)道如下。1 資料與方法1.1 一般資料選取本院于2017年3月至2019年3月確診諾卡菌病的3例患者，具體資料如下。病例1,男性，59歲，以腦膿腫術(shù)后于2017年12月29日收住本院。入院診斷：小腦膿腫術(shù)后；肺部感染；類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎；2型糖尿?。粻I養(yǎng)不良。腦CT提示右側(cè)小腦半球多發(fā)感染灶；肺CT提示雙肺多發(fā)感染并胸腔少量積液，雙側(cè)后壁胸膜增厚。臨床給予伏立康唑片，頭孢哌酮鈉/他唑巴坦抗感染治療，治療效果不佳，1月14日送腦部感染灶膿液細(xì)菌培養(yǎng)。病例2,男性，52歲，

7、以咳嗽、咳痰反復(fù)半年余，加重伴咯血3d于2019年1月7日收住本院。入院診斷：咯血原因待查。肺部CT提示雙肺多發(fā)支擴(kuò)并感染。臨床給予哌拉西林/他唑巴坦鈉聯(lián)合乳酸環(huán)丙沙星氯化鈉抗感染治療。1月9日行支氣管鏡檢查送肺泡灌洗液細(xì)菌培養(yǎng)。病例3,男性，77歲，以反復(fù)嗆咳伴進(jìn)行性吞咽困難、食欲下降2月余于2019年2月7日收住本院。入院診斷為肺惡性腫瘤、鱗狀細(xì)胞癌、聲門下惡性腫瘤、肺栓塞（L7、R4、L8、L9）、支氣管擴(kuò)張伴感染、雙側(cè)胸腔積液、聲門下喉惡性腫瘤、2型糖尿病、低鉀血癥、支氣管哮喘（非危重）.患者10余年前患有肺結(jié)核.胸片提示兩肺多發(fā)感染。患者入院當(dāng)晚出現(xiàn)昏迷轉(zhuǎn)入重癥監(jiān)護(hù)室，使用美羅培南針

8、抗感染治療。2月8日行纖維支氣管鏡取痰送痰細(xì)菌培養(yǎng)。1.2 儀器與試劑VITEK MS微生物鑒定儀購自法國梅里埃公司；試驗(yàn)所用哥倫比亞血平板、中國藍(lán)平板、巧克力平板均購自中國廣州迪景公司；試劑購自中國溫州康泰生物科技有限公司，均在有效期內(nèi)。質(zhì)控菌株包括大腸埃希菌ATCC 8739、金黃色葡萄球菌ATCC 29213、大腸埃希菌ATCC 35218.1.3 方法1.3.1 細(xì)菌鑒定參照臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程第4版中的細(xì)菌鑒定方法2,取呼吸道標(biāo)本接種哥倫比亞血平板、中國藍(lán)平板和巧克力平板，且肺泡灌洗液采用定量接種；膿液標(biāo)本接種哥倫比亞血平板和中國藍(lán)平板，置5%CO2、35培養(yǎng)24h后觀察菌落。通過菌落形

9、態(tài)、革蘭染色和改良抗酸染色初步鑒定到諾卡菌屬，后采用VITEK MS微生物鑒定儀鑒定（可信度60.0%99.9%）菌種。1.3.2 藥物敏感性試驗(yàn)根據(jù)美國臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會（CLSI）標(biāo)準(zhǔn)，諾卡菌應(yīng)采用微量肉湯稀釋法檢測藥物敏感性，并選用CLSI推薦用于諾卡菌的藥物，試驗(yàn)藥物包括：亞胺培南、莫西沙星、復(fù)方磺胺甲基異噁唑、環(huán)丙沙星、頭孢曲松、阿莫西林/克拉維酸、米諾環(huán)素、利奈唑胺、阿米卡星9種抗菌藥物。藥物敏感性試驗(yàn)接種物的制備參照CLSI M24的推薦方法：將培養(yǎng)5d的菌落用無菌棉簽刮取至裝有玻璃珠的培養(yǎng)管中，震蕩培養(yǎng)管將菌塊打碎，取上清菌懸液配制成0.5麥?zhǔn)纤?，調(diào)節(jié)菌液水平為5&time

10、s;105 cfu/mL.將配制好的菌懸液加入試驗(yàn)藥物，放置35孵育3d,每日觀察結(jié)果直至第5日，判讀最低抑菌濃度（MIC）值。2 結(jié)果2.1 細(xì)菌鑒定結(jié)果病例1:膿液培養(yǎng)24h血平板上長出白色、細(xì)小、干燥菌落，48h變成顆粒狀，延長培養(yǎng)時(shí)間，白色干燥菌落變得濕潤，57d后變成橙黃色。革蘭染色菌落易乳化，鏡下可見革蘭陽性細(xì)菌呈球狀、短桿狀，長桿狀細(xì)菌少見，大小不一、有分支、著色不均勻。改良抗酸染色弱陽性，初步鑒定為諾卡菌屬，用VITEK MS鑒定為皮疽諾卡菌，儀器鑒定率為99.9%.2018年1月18日向臨床回報(bào)鑒定結(jié)果。病例2:肺泡灌洗液培養(yǎng)24h血平板上未見明顯生長，48h可見白色、干燥、

11、顆粒狀菌落，部分菌落表面有皺褶，37日后干燥、皺褶菌落堆疊，呈黃色。革蘭染色菌落不易乳化，鏡下可見革蘭陽性細(xì)菌呈細(xì)長絲狀、大小不一，有分支，著色不均勻。改良抗酸染色弱陽性，初步鑒定為諾卡菌屬，用VITEK MS鑒定為喬治教堂諾卡菌，儀器鑒定率為99.9%.2019年1月14日，2份肺泡灌洗液培養(yǎng)結(jié)果一致，且菌量大于105cfu/mL.臨床補(bǔ)充診斷：諾卡氏菌肺炎。病例3:2019年2月9日痰涂片回報(bào)，查見革蘭陽性桿菌形似諾卡菌。痰細(xì)菌培養(yǎng)24h血平板上未見明顯生長，48h可見白色、干燥、粗顆粒狀菌落，37d后菌落變大、干燥、皺褶卷曲、由白色變?yōu)辄S色。革蘭染色菌落較難乳化（可用壓片的方式），鏡下可

12、見革蘭陽性細(xì)菌呈細(xì)長、分支狀菌落、大小不一、形態(tài)不規(guī)則。改良抗酸染色弱陽性，初步鑒定為諾卡菌屬，用VITEK MS鑒定為豚鼠耳炎諾卡菌，儀器鑒定率為99.9%.2月12日痰培養(yǎng)結(jié)果回報(bào)，由于患者病情較重家屬放棄治療，于2019年2月14日宣布死亡。表1 3種諾卡菌對9種抗菌藥物的MIC值（μg/mL）2.2 藥物敏感性試驗(yàn)結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)參照CLSI諾卡菌微量肉湯稀釋法藥物敏感性試驗(yàn)解釋標(biāo)準(zhǔn)，見表1.2.3臨床治療效果病例1:皮疽諾卡菌對檢測的9種藥物均敏感。臨床根據(jù)藥物敏感性結(jié)果改用復(fù)方磺胺甲噁唑片和亞胺培南西司他丁鈉抗感染治療，經(jīng)過治療患者病情好轉(zhuǎn)出院。病例2:喬治教堂諾卡菌對環(huán)丙沙星和

13、阿莫西林/克拉維酸耐藥，其余7種藥物敏感。臨床改用復(fù)方磺胺甲噁唑片抗感染治療，患者經(jīng)治療明顯好轉(zhuǎn)出院。病例3:豚鼠耳炎諾卡菌對亞胺培南、頭孢曲松和阿莫西林/克拉維酸耐藥，其余6種藥物均敏感。由于患者病情較重，未得到有效治療。3 討論諾卡菌隸屬于放線菌綱、放線菌目、諾卡菌科，廣泛分布于自然界中。臨床上多由外傷進(jìn)入皮膚或經(jīng)呼吸道吸入引起局部皮膚或肺部感染3,主要發(fā)生于伴有基礎(chǔ)疾病以及免疫功能低下者、免疫功能正常者也可患病4.諾卡菌屬為臨床不常見病原菌，感染癥狀缺乏特異性，實(shí)驗(yàn)室的檢測技術(shù)能力有限，且該菌生長緩慢，培養(yǎng)陽性率低，極易造成漏診、誤診5.在中國，最常見的諾卡菌是星形諾卡菌和巴西諾卡菌6,

14、7.本報(bào)道中發(fā)現(xiàn)的這3株諾卡菌為臨床少見的諾卡菌。皮疽諾卡菌多引起亞急性或慢性化膿性炎癥，尤其是細(xì)胞免疫低下患者，是諾卡菌中較為少見但最容易引起播散性感染的亞種8.據(jù)MOYLETT等9報(bào)道，其隨訪的30多例患者中有1/3涉及中樞神經(jīng)系統(tǒng)，病例1中的患者與其報(bào)道相似。該患者類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎多年，長期服用糖皮質(zhì)激素，合并糖尿病、營養(yǎng)不良，屬于免疫低下人群，此次腦部多發(fā)膿腫，肺部感染雖未明確致病菌，但在腦部膿液中培養(yǎng)出了皮疽諾卡菌，為臨床診斷提供了明確的病原菌。該菌的藥物敏感性試驗(yàn)對亞胺培南、莫西沙星、復(fù)方磺胺甲基異噁唑、環(huán)丙沙星、頭孢曲松、阿莫西林/克拉維酸、米諾環(huán)素、利奈唑胺、阿米卡星9種抗菌藥物

15、均敏感，與CLSI M2410中報(bào)告的基本一致。臨床采用手術(shù)治療，配合復(fù)方磺胺甲噁唑和亞胺培南西司他丁鈉聯(lián)合治療，患者病情好轉(zhuǎn)出院。喬治教堂諾卡菌廣泛分布于土壤中，臨床報(bào)道較少，該菌引起的肺諾卡菌病臨床表現(xiàn)多樣，缺乏特異性11.病例2中的患者咳嗽、咳痰半年余，肺CT示肺部多發(fā)感染灶。臨床醫(yī)生根據(jù)患者的病情，通過纖維支氣管鏡檢查，送支氣管肺泡灌洗液細(xì)菌培養(yǎng)，結(jié)果兩份支氣管肺泡灌洗液均培養(yǎng)出大于105 cfu/mL的喬治教堂諾卡菌。該菌的藥物敏感性試驗(yàn)對環(huán)丙沙星和阿莫西林/克拉維酸耐藥，其余7種藥物敏感。臨床根據(jù)微生物報(bào)告調(diào)整用藥，患者病情明顯好轉(zhuǎn)，整個(gè)診斷過程為7d.對于肺諾卡菌病而言，細(xì)菌培養(yǎng)

16、和鑒定是診斷肺諾卡菌病的金標(biāo)準(zhǔn)11.豚鼠耳炎諾卡菌引起人類感染的報(bào)道相對較少，可能與其致病力低、土壤中分布不廣泛或病例漏報(bào)有關(guān)12.該菌引起的諾卡菌病的發(fā)生和傳播途徑與機(jī)體的抵抗力有密切關(guān)系13.病例3中的患者患有腫瘤，且合并多種基礎(chǔ)疾病，屬于機(jī)體免疫嚴(yán)重低下患者，肺部感染較重。本實(shí)驗(yàn)室在痰涂片中發(fā)現(xiàn)疑似諾卡菌并電話回報(bào)，由于患者病情較重，家屬放棄治療，最終未得到有效治療。諾卡菌生長緩慢，呼吸道標(biāo)本中易受到正常菌群的干擾，極易造成漏檢。因此，實(shí)驗(yàn)室對于臨床疑似諾卡菌的標(biāo)本，應(yīng)重視標(biāo)本的直接涂片，及時(shí)發(fā)現(xiàn)可能存在的不易生長的細(xì)菌，延長培養(yǎng)時(shí)間。該菌對亞胺培南、頭孢曲松和阿莫西林/克拉維酸耐藥，其

17、余6種藥物敏感，與CLSI M2410中報(bào)告的一致。諾卡菌感染目前缺乏特異的診斷指標(biāo)，對臨床可疑諾卡菌病的患者應(yīng)多次、多部位采集標(biāo)本進(jìn)行病原學(xué)檢查，必要時(shí)進(jìn)行有創(chuàng)檢查采集標(biāo)本。臨床醫(yī)生或檢驗(yàn)科人員懷疑諾卡菌感染時(shí)，應(yīng)互相溝通，互相協(xié)助。諾卡菌的菌落形態(tài)和革蘭染色沒有明顯的差異，僅憑細(xì)菌培養(yǎng)及生化鑒定很難鑒定到種，質(zhì)譜分析儀有助于提高諾卡菌的鑒定，但目前16SrRNA測序仍是鑒定諾卡菌最可靠的方法14.諾卡菌屬的抗菌藥物敏感性因種類不同而異15,本報(bào)道中除1例患者家屬放棄治療外，其余2例醫(yī)生根據(jù)藥物敏感性試驗(yàn)結(jié)果，臨床治療有效。臨床醫(yī)生應(yīng)根據(jù)患者的臨床癥狀體征、實(shí)驗(yàn)室檢查、影像學(xué)檢查、結(jié)合有創(chuàng)檢

18、查，如纖維支氣管鏡等，早期做出診斷并治療，對患者的療程和預(yù)后至關(guān)重要。4 結(jié)論質(zhì)譜儀有助于提高諾卡菌菌種的鑒定水平。諾卡菌屬的抗菌藥物敏感性因菌種不同而異，臨床醫(yī)生應(yīng)結(jié)合藥物敏感性試驗(yàn)結(jié)果指導(dǎo)臨床治療。參考文獻(xiàn)1王輝，馬筱玲等譯。臨床微生物學(xué)手冊M.11版。北京：中華醫(yī)學(xué)電子影像出版社，2017:642.2尚紅，王毓三，申子瑜。臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程M.4版。北京：人民衛(wèi)生出版社，2015:679.3李云，劉立翠，馮偉，等。腹水穿刺液皮疽諾卡菌的鑒定J.齊魯醫(yī)學(xué)雜志，2016,31（4）：493-496.4趙璀蓮，農(nóng)光民。肺奴卡菌病2例并文獻(xiàn)復(fù)習(xí)J.中國現(xiàn)代藥物應(yīng)用，2018,12（24）：129-

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