不可忽視的細(xì)血液基因組提取PPT課件

1、pDNADNA提取的原則提取的原則p基因組提取方法基因組提取方法p樣本保存和前處理樣本保存和前處理p基因組提取流程基因組提取流程pDNADNA保存及檢測方法保存及檢測方法p試劑選擇原則試劑選擇原則 內(nèi)容內(nèi)容第1頁/共27頁沒有嚴(yán)格要求沒有嚴(yán)格要求: PCR Southern Blots RFLP嚴(yán)格要求片段長度嚴(yán)格要求片段長度: 構(gòu)建文庫構(gòu)建文庫 PFGE(脈沖場凝膠電泳脈沖場凝膠電泳)DNA LengthDNA提取原則提取原則1：DNA片段長度片段長度第2頁/共27頁沒有嚴(yán)格要求沒有嚴(yán)格要求 常規(guī)常規(guī)PCR嚴(yán)格要求產(chǎn)物純度嚴(yán)格要求產(chǎn)物純度 存檔、產(chǎn)物長期保存存檔、產(chǎn)物長期保存 Souther

2、n雜交雜交 熒光定量熒光定量PCR SNP Microarray CGH (比較基因組雜交比較基因組雜交) DNA提取原則提取原則2：DNA產(chǎn)物純度產(chǎn)物純度第3頁/共27頁pDNADNA提取的原則提取的原則p基因組提取方法基因組提取方法p樣本保存和前處理樣本保存和前處理p基因組提取流程基因組提取流程pDNADNA保存及檢測方法保存及檢測方法p試劑選擇原則試劑選擇原則 內(nèi)容內(nèi)容第4頁/共27頁基因組提取方法基因組提取方法p溶液鹽析法：溶液鹽析法：無需酚氯仿，樣本量靈活可變，得率高無需酚氯仿，樣本量靈活可變，得率高p硅膠膜吸附法：硅膠膜吸附法：利用硅膠膜特異吸附核酸的原理來純化核酸利用硅膠膜特異吸

3、附核酸的原理來純化核酸p磁珠法：磁珠法：獨(dú)特包埋的磁珠，在一定條件下對(duì)核酸具有很強(qiáng)的親和力，而當(dāng)獨(dú)特包埋的磁珠，在一定條件下對(duì)核酸具有很強(qiáng)的親和力，而當(dāng)條件改變時(shí)，磁珠釋放吸附的核酸，能夠達(dá)到快速分離純化核酸的目的。條件改變時(shí)，磁珠釋放吸附的核酸，能夠達(dá)到快速分離純化核酸的目的。p傳統(tǒng)酚氯仿法：傳統(tǒng)酚氯仿法：傳統(tǒng)方法，抽提時(shí)間長，成本低。但酚氯仿有毒，危害身傳統(tǒng)方法，抽提時(shí)間長，成本低。但酚氯仿有毒，危害身體健康。體健康。第5頁/共27頁pDNADNA提取的原則提取的原則p基因組提取方法基因組提取方法p樣本保存和前處理樣本保存和前處理p基因組提取流程基因組提取流程pDNADNA保存及檢測方法保

4、存及檢測方法p試劑選擇原則試劑選擇原則 內(nèi)容內(nèi)容第6頁/共27頁樣本保存和前處理樣本保存和前處理抗凝血液抗凝血液p保存保存 檸檬酸、檸檬酸、EDTAEDTA、肝素三種抗凝劑均可使用。但肝素對(duì)酶反應(yīng)有可能起阻害、肝素三種抗凝劑均可使用。但肝素對(duì)酶反應(yīng)有可能起阻害作用作用, ,采血時(shí)如沒有特殊要求采血時(shí)如沒有特殊要求, ,請(qǐng)使用檸檬酸或請(qǐng)使用檸檬酸或EDTAEDTA處理血樣。處理血樣。加入抗凝劑混勻后加入抗凝劑混勻后2-82-8保存一周；保存一周；2020保存一個(gè)月；保存一個(gè)月；7070長期保存。長期保存。盡可能保證樣本不經(jīng)過反復(fù)凍融。盡可能保證樣本不經(jīng)過反復(fù)凍融。p樣本前處理樣本前處理p 1.

5、1. 凍存的抗凝血液使用前溶解應(yīng)在凍存的抗凝血液使用前溶解應(yīng)在3737水浴迅速溶解。水浴迅速溶解。2. 2. 抗凝血提取前需要徹底混勻后再吸取實(shí)驗(yàn)所需的體積?？鼓崛∏靶枰獜氐谆靹蚝笤傥?shí)驗(yàn)所需的體積。第7頁/共27頁樣本保存和前處理樣本保存和前處理非抗凝血非抗凝血p保存保存 非抗凝血即血凝塊。非抗凝血即血凝塊。-20-20保存一個(gè)月；保存一個(gè)月；-70-70長期保存。盡可能保證樣本長期保存。盡可能保證樣本不經(jīng)過反復(fù)凍融。不經(jīng)過反復(fù)凍融。p樣本前處理樣本前處理1.1. 凍存的血凝塊使用前應(yīng)在凍存的血凝塊使用前應(yīng)在3737水浴溶解，輕柔顛倒混勻。水浴溶解，輕柔顛倒混勻。 2. 2. 血凝塊取

6、出后先采取機(jī)械破碎的方法（例如：放入無粉橡膠手套中捏血凝塊取出后先采取機(jī)械破碎的方法（例如：放入無粉橡膠手套中捏碎或勻漿）將血凝塊破碎，然后再根據(jù)自己的實(shí)驗(yàn)取適量樣本。碎或勻漿）將血凝塊破碎，然后再根據(jù)自己的實(shí)驗(yàn)取適量樣本。血凝塊前期破碎程度越高，提取基因組就越容易！血凝塊前期破碎程度越高，提取基因組就越容易！第8頁/共27頁樣本保存和前處理樣本保存和前處理白膜層白膜層p保存保存 全血分離得到的白膜層放置全血分離得到的白膜層放置-20-20或或-70-70長期保存。盡可能保證樣本不經(jīng)長期保存。盡可能保證樣本不經(jīng)過反復(fù)凍融。過反復(fù)凍融。p樣本前處理樣本前處理p 1. 1. 白膜層是將全血離心取中

7、間層所得。白細(xì)胞則是用紅細(xì)胞裂解液白膜層是將全血離心取中間層所得。白細(xì)胞則是用紅細(xì)胞裂解液裂解紅細(xì)胞后得到的沉淀。裂解紅細(xì)胞后得到的沉淀。2. 2. 凍存的白膜層使用前應(yīng)在凍存的白膜層使用前應(yīng)在3737水浴溶解，輕柔顛倒混勻。水浴溶解，輕柔顛倒混勻。 3. 3. 雖然得到的是白膜層，但是會(huì)有少量紅細(xì)胞存在，所以紅細(xì)胞裂解液雖然得到的是白膜層，但是會(huì)有少量紅細(xì)胞存在，所以紅細(xì)胞裂解液 還是必要的，但用量減半。還是必要的，但用量減半。p 4. 4. 采用白膜層提取核酸時(shí)，所用到的提取溶液體積需按照全血體積采用白膜層提取核酸時(shí)，所用到的提取溶液體積需按照全血體積進(jìn)行操作。即：進(jìn)行操作。即：1ml1m

8、l全血得到的白膜層提取時(shí)需要加入提取全血得到的白膜層提取時(shí)需要加入提取1ml1ml全血的試劑全血的試劑量。量。第9頁/共27頁樣本保存和前處理樣本保存和前處理血清血清/ /血漿血漿p保存保存 現(xiàn)在很多科研者使用血清現(xiàn)在很多科研者使用血清/ /血漿提取游離核酸進(jìn)行研究，例如：腫瘤研究。血漿提取游離核酸進(jìn)行研究，例如：腫瘤研究。分離得到的血清分離得到的血清/ /血漿放置血漿放置-70-70保存。盡量避免樣本反復(fù)凍融。保存。盡量避免樣本反復(fù)凍融。p樣本前處理樣本前處理1.1. 凍存的血清凍存的血清/ /血漿使用前溶解應(yīng)在血漿使用前溶解應(yīng)在3737水浴溶解，輕柔顛倒混勻。水浴溶解，輕柔顛倒混勻。2.

9、2. 血清血清/ /血漿核酸提取時(shí)無需紅細(xì)胞裂解。血漿核酸提取時(shí)無需紅細(xì)胞裂解。3. 3. 只需只需100-200ul100-200ul樣本，基本能滿足下游常規(guī)樣本，基本能滿足下游常規(guī)PCRPCR或熒光定量或熒光定量PCRPCR檢測。檢測。第10頁/共27頁樣本保存和前處理樣本保存和前處理微量血液微量血液/ /干血點(diǎn)干血點(diǎn)/ /羊水羊水/ /胸水胸水p保存保存 微量血液：抗凝血液微量血液：抗凝血液-20-20或或-70-70保存；保存；干血點(diǎn)：干燥后室溫或干血點(diǎn)：干燥后室溫或44保存；保存；羊水：羊水： -20-20或或-70-70保存。保存。p樣本前處理樣本前處理1.1. 微量血液處理同抗凝

10、血液，不同之處是無需進(jìn)行紅細(xì)胞裂解步驟。微量血液處理同抗凝血液，不同之處是無需進(jìn)行紅細(xì)胞裂解步驟。2. 2. 干血點(diǎn)加入緩沖液直接進(jìn)行提取。干血點(diǎn)加入緩沖液直接進(jìn)行提取。3. 3. 羊水羊水/ /胸水提取時(shí)先離心得到沉淀，再進(jìn)行裂解提取核酸。胸水提取時(shí)先離心得到沉淀，再進(jìn)行裂解提取核酸。第11頁/共27頁樣本保存和前處理樣本保存和前處理口拭子口拭子/ /漱口水漱口水p保存保存 口拭子：干燥后室溫保存口拭子：干燥后室溫保存漱口水：漱口水：44保存或離心得到沉淀保存或離心得到沉淀-20-20或或-70-70保存保存p樣本前處理樣本前處理1. 1. 拭子將拭子棉頭剪入到離心管里，加入緩沖液直接進(jìn)行提

11、取。拭子將拭子棉頭剪入到離心管里，加入緩沖液直接進(jìn)行提取。2. 2. 有些拭子的棉頭剪不下來，可以將拭子在生理鹽水里漂洗幾次，離心有些拭子的棉頭剪不下來，可以將拭子在生理鹽水里漂洗幾次，離心得到沉淀再進(jìn)行核酸提取。得到沉淀再進(jìn)行核酸提取。3. 3. 漱口水先進(jìn)行離心得到沉淀再進(jìn)行核酸提取。漱口水先進(jìn)行離心得到沉淀再進(jìn)行核酸提取。第12頁/共27頁pDNADNA提取的原則提取的原則p基因組提取方法基因組提取方法p樣本保存和前處理樣本保存和前處理p基因組提取流程基因組提取流程pDNADNA保存及檢測方法保存及檢測方法p試劑選擇原則試劑選擇原則 內(nèi)容內(nèi)容第13頁/共27頁基因組提取流程基因組提取流程

12、加入吸附柱緩沖液漂洗DNA洗脫收集樣本裂解純化去蛋白沉淀核酸洗滌去鹽溶解DNA沉淀樣本裂解溶液法（鹽析法）溶液法（鹽析法）吸附柱法吸附柱法第14頁/共27頁紅細(xì)胞裂解紅細(xì)胞裂解 哺乳動(dòng)物血液的紅細(xì)胞中沒有細(xì)胞核且核酸酶含量豐富，所以裂解紅細(xì)胞哺乳動(dòng)物血液的紅細(xì)胞中沒有細(xì)胞核且核酸酶含量豐富，所以裂解紅細(xì)胞對(duì)核酸提取非常重要。紅細(xì)胞裂解有兩種方式：對(duì)核酸提取非常重要。紅細(xì)胞裂解有兩種方式：p采用紅細(xì)胞裂解液進(jìn)行裂解（通常紅細(xì)胞裂解液按照采用紅細(xì)胞裂解液進(jìn)行裂解（通常紅細(xì)胞裂解液按照3 3倍全血體積加倍全血體積加入進(jìn)行裂解入進(jìn)行裂解).).采用細(xì)胞裂解液進(jìn)行裂解（采用細(xì)胞裂解液進(jìn)行裂解（TIANG

13、ENTIANGEN的細(xì)胞裂解液的細(xì)胞裂解液CLCL是按照是按照倍全血體倍全血體積），細(xì)胞裂解液將紅細(xì)胞裂解的同時(shí)可以裂解白細(xì)胞，得到的為細(xì)積），細(xì)胞裂解液將紅細(xì)胞裂解的同時(shí)可以裂解白細(xì)胞，得到的為細(xì)胞核沉淀，更方便基因組胞核沉淀，更方便基因組DNADNA的提取。的提取。紅細(xì)胞裂解充分的現(xiàn)象：紅細(xì)胞裂解充分的現(xiàn)象：得到的沉淀應(yīng)為白色沉淀或淡粉色沉淀。有時(shí)血液需要進(jìn)得到的沉淀應(yīng)為白色沉淀或淡粉色沉淀。有時(shí)血液需要進(jìn)行兩次裂解，注意第二次加入裂解液后需要將沉淀行兩次裂解，注意第二次加入裂解液后需要將沉淀votexvotex徹底混勻。徹底混勻。第15頁/共27頁核細(xì)胞裂解核細(xì)胞裂解p如果有裂紅的步驟，

14、請(qǐng)盡量將上清去除再加入裂解液。如果有裂紅的步驟，請(qǐng)盡量將上清去除再加入裂解液。p加入裂解液（如：加入裂解液（如：TIANGENTIANGEN試劑盒中的試劑盒中的GBGB或或FGFG）和蛋白酶）和蛋白酶K K需要徹底混勻。需要徹底混勻。將沉淀打散混勻后再進(jìn)行水浴。將沉淀打散混勻后再進(jìn)行水浴。p水浴時(shí)看到溶液變清，沒有粘稠物或沉淀時(shí)即可進(jìn)行下步操作，通常水浴水浴時(shí)看到溶液變清，沒有粘稠物或沉淀時(shí)即可進(jìn)行下步操作，通常水浴時(shí)間時(shí)間10-30min.10-30min.p若采用有機(jī)（酚若采用有機(jī)（酚/ /氯仿）抽提時(shí)應(yīng)充分混勻，動(dòng)作要輕柔。離心分離兩相氯仿）抽提時(shí)應(yīng)充分混勻，動(dòng)作要輕柔。離心分離兩相時(shí)，

15、應(yīng)保證一定的轉(zhuǎn)速和時(shí)間，且吸取上清時(shí)注意不要吸取到中間層及有時(shí)，應(yīng)保證一定的轉(zhuǎn)速和時(shí)間，且吸取上清時(shí)注意不要吸取到中間層及有機(jī)相。機(jī)相。第16頁/共27頁核酸吸附或沉淀核酸吸附或沉淀p硅膠膜吸附法硅膠膜吸附法1. 1. 加入乙醇顛倒混勻后可能會(huì)出現(xiàn)絮狀沉淀，動(dòng)作要輕柔。加入乙醇顛倒混勻后可能會(huì)出現(xiàn)絮狀沉淀，動(dòng)作要輕柔。2. 2. 將裂解的溶液和絮狀沉淀全部加入到吸附柱里，此時(shí)的溶液應(yīng)是高鹽將裂解的溶液和絮狀沉淀全部加入到吸附柱里，此時(shí)的溶液應(yīng)是高鹽低低pHpH值的。通過硅膠膜特異吸附核酸的特性將裂解溶液中的核酸吸附到硅值的。通過硅膠膜特異吸附核酸的特性將裂解溶液中的核酸吸附到硅膠膜上。膠膜上。

16、p溶液法溶液法1. 1. 當(dāng)沉淀時(shí)間有限時(shí)，用預(yù)冷的異丙醇沉淀，沉淀會(huì)更充分。當(dāng)沉淀時(shí)間有限時(shí)，用預(yù)冷的異丙醇沉淀，沉淀會(huì)更充分。2. 2. 加入異丙醇顛倒混勻后應(yīng)出現(xiàn)絲狀沉淀，動(dòng)作要輕柔，避免基因組因加入異丙醇顛倒混勻后應(yīng)出現(xiàn)絲狀沉淀，動(dòng)作要輕柔，避免基因組因過于猛烈的外力而降解。過于猛烈的外力而降解。3. 3. 分離沉淀的方法：分離沉淀的方法：a.a.用槍頭小心地將絲狀沉淀挑出；用槍頭小心地將絲狀沉淀挑出；b.b.離心分離，應(yīng)離心分離，應(yīng)保證一定的轉(zhuǎn)速和時(shí)間。保證一定的轉(zhuǎn)速和時(shí)間。第17頁/共27頁核酸洗脫或溶解核酸洗脫或溶解p硅膠膜吸附法硅膠膜吸附法1. 1. 用去蛋白液、漂洗液將膜上的

17、核酸漂洗后，將不加溶液的吸附柱離心用去蛋白液、漂洗液將膜上的核酸漂洗后，將不加溶液的吸附柱離心以去除殘留的液體及揮發(fā)乙醇成分。加入適量洗脫液以去除殘留的液體及揮發(fā)乙醇成分。加入適量洗脫液TB bufferTB buffer（或自己（或自己配制的配制的bufferbuffer）后放置）后放置5-10 min5-10 min后再進(jìn)行離心得到基因組后再進(jìn)行離心得到基因組DNADNA。p溶液法溶液法1. 1. 使用使用70-7570-75乙醇對(duì)核酸沉淀進(jìn)行洗滌。溶解乙醇對(duì)核酸沉淀進(jìn)行洗滌。溶解DNADNA前需要室溫或前需要室溫或3737放放置幾分鐘晾干核酸（使乙醇揮發(fā)），然后再加入適量的置幾分鐘晾干核

18、酸（使乙醇揮發(fā)），然后再加入適量的TB bufferTB buffer（或自（或自己配制的己配制的bufferbuffer）溶解）溶解DNADNA。第18頁/共27頁pDNADNA提取的原則提取的原則p基因組提取方法基因組提取方法p樣本保存和前處理樣本保存和前處理p基因組提取流程基因組提取流程pDNADNA保存及檢測方法保存及檢測方法p試劑選擇原則試劑選擇原則 內(nèi)容內(nèi)容第19頁/共27頁 濃度：100100300ng/ul300ng/ul 純度：任何雜質(zhì)都可能導(dǎo)致DNADNA在儲(chǔ)存過程中的降解，因此要確保純化得到的核酸的純度。 溫度：純化得到基因組DNADNA之后需將DNADNA溶液分裝保存到

19、-20-20，反復(fù)凍溶會(huì)導(dǎo)致DNADNA的降解。 溶解DNA BufferDNA Buffer：純化得到的基因組DNADNA最好溶解在TB Buffer TB Buffer (TIANGEN) (TIANGEN) 或者TrisTris緩沖液里，因?yàn)榇笃蔚幕蚪MDNADNA在酸性水溶液中不穩(wěn)定，易水解。核酸保存核酸保存第20頁/共27頁 純度（純度（ OD260-320 /OD280-320 OD260-320 /OD280-320 ） 紫外分光光度計(jì)進(jìn)行測量（選擇正確的稀釋倍數(shù)，確保OD260 值在之間，通常離心柱法稀釋45倍；溶液裂解法稀釋2030倍）OD260-320 /OD280-32

20、0 1.9 說明有部分降解或有RNA污染 得率得率 紫外分光光度計(jì)進(jìn)行測量YieldYield OD260OD26050ng/ul50ng/ul稀釋倍數(shù)DNA檢測方法檢測方法紫外分光光度法紫外分光光度法第21頁/共27頁Tiangen 產(chǎn)品提取得率產(chǎn)品提取得率產(chǎn)品詳細(xì)細(xì)節(jié)請(qǐng)直接點(diǎn)擊產(chǎn)品名稱樣本樣本處理量處理量DNA/RNA得率得率（g）推薦試劑盒推薦試劑盒哺乳動(dòng)物全血哺乳動(dòng)物全血100l2DP327-磁珠法基因組提取試劑盒磁珠法基因組提取試劑盒DP316- -微量樣品基因組微量樣品基因組DNADNA提取試劑盒提取試劑盒200l 4-12DP318-血液基因組提取試劑盒血液基因組提取試劑盒(0.

21、1-1ml)600l12-2012-201ml4-304-30DP319-血液基因組提取試劑盒血液基因組提取試劑盒(0.1-20ml)5ml100-20020ml300-700禽類、兩棲類全血禽類、兩棲類全血5-205-40DP318-血液基因組提取試劑盒血液基因組提取試劑盒(0.1-1ml)血凝塊血凝塊200-500ul1-81-8DP318/ DP319500-1000ul8-158-15DP318/ DP3191ml-5ml5-150DP319口腔拭子口腔拭子1個(gè)個(gè)0.5-3.5DP322-口腔拭子基因組提取試劑盒口腔拭子基因組提取試劑盒第22頁/共27頁DNA檢測方法檢測方法電泳檢測電泳檢測取2l 洗脫液1% 瓊脂糖凝膠電泳, 檢測DNA分子大小，純度以及完整性TIANamp TIANamp 血液基因組DNADNA提取試劑盒提取相同血樣不同起始體積的DNADNA電泳圖 電泳檢測要控制上樣量。上樣量過大會(huì)導(dǎo)致泳道過亮、拖尾等現(xiàn)象，影響正確判斷。 如果加樣孔里有亮帶，說明有蛋白污染。 若上樣量合適，泳道有彌散、拖尾現(xiàn)象，說明書基因組DNADNA有降解。第23頁/共27頁TIANampTIANamp微量樣本基因組DNADNA提取試劑盒樣本來源一致，分