紫外分光光度法和熒光分析法

1、一、紫外一、紫外可見(jiàn)光分光光度法可見(jiàn)光分光光度法光譜分析法光譜分析法二、熒光分析法二、熒光分析法 基本原理基本原理儀器主要部件儀器主要部件主要應(yīng)用主要應(yīng)用基本原理概述：紫外概述：紫外-可見(jiàn)分光光度法是通過(guò)被測(cè)物可見(jiàn)分光光度法是通過(guò)被測(cè)物質(zhì)在紫外質(zhì)在紫外-可見(jiàn)光區(qū)的特定波長(zhǎng)或一定波長(zhǎng)可見(jiàn)光區(qū)的特定波長(zhǎng)或一定波長(zhǎng)范圍內(nèi)光的吸收度，對(duì)該物質(zhì)進(jìn)行定性和范圍內(nèi)光的吸收度，對(duì)該物質(zhì)進(jìn)行定性和定量分析的方法。主要用于藥品的鑒別、定量分析的方法。主要用于藥品的鑒別、檢查和含量測(cè)定。檢查和含量測(cè)定。范圍：范圍： 可見(jiàn)光區(qū)（可見(jiàn)光區(qū)（400760nm） 紫外光區(qū)（紫外光區(qū)（200400nm）Beer-Lambor

2、t 定律A=log=Ecl1T*A為吸收度；*T為透光率；*E為吸收系數(shù)（以以 表示，溶液濃度為表示，溶液濃度為1%（g/ml），厚度為），厚度為1cm時(shí)的吸光度值時(shí)的吸光度值）*c為溶液濃度；*l為樣品總厚度。Ecm%11適用條件：入射光為單色光入射光為單色光溶液是稀溶液溶液是稀溶液固體、固體、 液體和氣體樣品在同一波長(zhǎng)液體和氣體樣品在同一波長(zhǎng)下，各組分吸光度具有加和性下，各組分吸光度具有加和性?xún)x器主要部件儀器主要部件單色器單色器光源光源檢測(cè)器檢測(cè)器吸收池吸收池信號(hào)顯信號(hào)顯示系統(tǒng)示系統(tǒng)儀器分類(lèi)單光束紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)準(zhǔn)雙光束紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)雙光束紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)雙波長(zhǎng)紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)主

3、要應(yīng)用 利用藥物與雜質(zhì)對(duì)光的選擇性吸收性質(zhì)的差異，若藥物在雜質(zhì)的最大吸收波長(zhǎng)處沒(méi)有吸收，則可在此波長(zhǎng)處測(cè)樣品溶液的吸收度，通過(guò)控制樣品溶液吸收度來(lái)控制雜質(zhì)的量。例：地蒽酚中二羥基蒽醌的檢查 二羥基蒽醌的三氯甲烷溶液 在432nm處有最大吸收，而 地蒽酚在該處幾乎無(wú)吸收。1、藥物的雜質(zhì)檢查2、藥物的含量測(cè)定 如巴比妥類(lèi)藥物的含量測(cè)定（巴比妥類(lèi)藥物在堿性介質(zhì)中電離為具有紫外吸收特征的結(jié)構(gòu)）、芳酸及其脂類(lèi)藥物含量測(cè)定、維生素A含量測(cè)定（在325328nm的波長(zhǎng)范圍內(nèi)有最大吸收）等。三點(diǎn)校正法 本方法是在三個(gè)波長(zhǎng)處測(cè)得吸光度，根據(jù)校正公式計(jì)算吸光度校正值后，再計(jì)算含量。其原理主要基于以下兩點(diǎn)： 雜質(zhì)的

4、無(wú)關(guān)吸收再310340nm的波長(zhǎng)范圍內(nèi)幾乎呈一條直線(xiàn)，且隨波長(zhǎng)的增大吸光度下降。 物質(zhì)對(duì)光吸收呈加和性的原理，即在某一樣品的吸收曲線(xiàn)上，各波長(zhǎng)的吸光度是維生素A與雜質(zhì)吸光度的代數(shù)和，因而吸收曲線(xiàn)也是二者吸收的疊加。3、藥物的鑒別 對(duì)比吸收光譜特征數(shù)據(jù)對(duì)比吸收光譜特征數(shù)據(jù) 對(duì)比吸收度（或吸收系數(shù)）的比值對(duì)比吸收度（或吸收系數(shù)）的比值 對(duì)比吸收光譜的一致性對(duì)比吸收光譜的一致性 例苯磺舒：用含鹽酸的乙醇取鹽酸溶液（9-1000）2ml，加乙醇制成100ml制成沒(méi)1ml中含20ug的溶液，在225nm與249nm的波長(zhǎng)處有最大吸收，在249nm波長(zhǎng)處的吸收度為0.67 。甾體激素類(lèi)藥物：丙酸倍氯米松的

5、乙醇溶液（20ug/ml），在239nm的波長(zhǎng)處應(yīng)有最大吸收，吸光度為0.570.60;在239nm與263nm波長(zhǎng)處的吸光度比值應(yīng)為2.252.451.判別物質(zhì)的異構(gòu)體，如互變異構(gòu)體，順?lè)串悩?gòu)體，開(kāi)鏈和成環(huán)異構(gòu)體，旋光異構(gòu)體，空間異構(gòu)體等。反式異構(gòu)體空間位阻小，共軛程度較完全。最大吸收峰波長(zhǎng)，最大摩爾吸收系數(shù)，大于順式。2.推測(cè)物質(zhì)的共軛體系和部分骨架一般需與色譜，紅外，質(zhì)譜，波譜等多種儀器聯(lián)合作物質(zhì)的結(jié)構(gòu)分析。4.結(jié)構(gòu)分析紫外分光光度測(cè)定方法普通測(cè)定分光光度法普通測(cè)定分光光度法 1.單組分的測(cè)定單組分的測(cè)定 通常采用 A-C 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)法定量測(cè)定。2.多組分的同時(shí)測(cè)定多組分的同時(shí)測(cè)定 若各組

6、分的吸收曲線(xiàn)互不重疊，則可在各自最大吸收波長(zhǎng)處分別進(jìn)行測(cè)定。這本質(zhì)上與單組分測(cè)定沒(méi)有區(qū)別。 若各組分的吸收曲線(xiàn)互有重疊，則可根據(jù)吸光度的加合性求解聯(lián)立方程組得出各組分的含量。A1= a1bca b1bcb A2= a2bca b2bcb 差示分光光度法差示分光光度法普通分光光度法一般只適于測(cè)定微量組分，當(dāng)待測(cè)組分含量較高時(shí)，將產(chǎn)生較大的誤差。需采用示差法。 即提高入射光強(qiáng)度，并采用濃度稍低于待測(cè)溶液濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液作參比溶液。設(shè)：待測(cè)溶液濃度為cx，標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為cs(cs cx)。則： Ax= b cx As = b cs x s =b(cx cs ）=bc 測(cè)得的吸光度相當(dāng)于普通法中待測(cè)溶液

7、與標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸光度之差。示差法測(cè)得的吸光度與c呈直線(xiàn)關(guān)系。由標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)上查得相應(yīng)的c值，則待測(cè)溶液濃度cx ： cx = cs + c 雙波長(zhǎng)分光光度法不需空白溶液作參比；但需要兩個(gè)單色器獲得兩束單色光(1和2)；以參比波長(zhǎng)1處的吸光度A1作為參比，來(lái)消除干擾。在分析渾濁或背景吸收較大的復(fù)雜試樣時(shí)顯示出很大的優(yōu)越性。靈敏度、選擇性、測(cè)量精密度等方面都比單波長(zhǎng)法有所提高。 A 2 A 1 （2 1 ) b c 兩波長(zhǎng)處測(cè)得的吸光度差值與待測(cè)組分濃度成正比（例子：課本366頁(yè)）導(dǎo)數(shù)分光光度法導(dǎo)數(shù)分光光度法在多組分同時(shí)測(cè)定、渾濁樣品分析、消除背景干擾、加強(qiáng)光譜的精細(xì)結(jié)構(gòu)以及復(fù)雜光譜的辨析等方面，顯示了

8、很大的優(yōu)越性。 利用吸光度利用吸光度(或透光度或透光度)對(duì)波長(zhǎng)的導(dǎo)數(shù)曲線(xiàn)來(lái)進(jìn)行分對(duì)波長(zhǎng)的導(dǎo)數(shù)曲線(xiàn)來(lái)進(jìn)行分析：析： 0 e-bc假定入射光強(qiáng)度0 在整個(gè)波長(zhǎng)范圍內(nèi)保持恒定： dI 0 /d0則：dI/d0 bc e -bc d/d 0 bc d/d（例子：課本（例子：課本233頁(yè)）頁(yè)）其他卡爾曼濾波法 偏最小二乘法 小波變換三波長(zhǎng)分光光度法 系數(shù)倍率法與紫外與紫外-可見(jiàn)法異同點(diǎn)可見(jiàn)法異同點(diǎn)應(yīng)用應(yīng)用 原理原理原理 熒光熒光分子吸收電磁波后，從其最低激發(fā)分子吸收電磁波后，從其最低激發(fā)態(tài)重新發(fā)射紫外線(xiàn)或可見(jiàn)光的現(xiàn)象態(tài)重新發(fā)射紫外線(xiàn)或可見(jiàn)光的現(xiàn)象 利用某些物質(zhì)被一定波長(zhǎng)的光照射后所產(chǎn)利用某些物質(zhì)被一定波

9、長(zhǎng)的光照射后所產(chǎn)生的，能夠反映該物質(zhì)特性的熒光來(lái)進(jìn)行生的，能夠反映該物質(zhì)特性的熒光來(lái)進(jìn)行定性定量的分析方法定性定量的分析方法熒光分析法。熒光分析法。在溶液中，當(dāng)熒光物質(zhì)的濃度較低時(shí),其熒光強(qiáng)度與該物質(zhì)的濃度通常有良好的正比關(guān)系,即IF=KC 光照光照 分子基態(tài)分子基態(tài) 激發(fā)態(tài)激發(fā)態(tài) 輻射躍遷輻射躍遷 熒光熒光 若光源是：若光源是： 由熒光波長(zhǎng)可確定物質(zhì)分子由熒光波長(zhǎng)可確定物質(zhì)分子 可見(jiàn)可見(jiàn)-紫外光源紫外光源 分子熒光分析法分子熒光分析法 具有結(jié)構(gòu)具有結(jié)構(gòu) 由熒光強(qiáng)度可測(cè)物質(zhì)的含量由熒光強(qiáng)度可測(cè)物質(zhì)的含量 原子特征光譜作光源原子特征光譜作光源 原子熒光分析原子熒光分析 X射線(xiàn)作光源射線(xiàn)作光源 X

10、射線(xiàn)熒光分析射線(xiàn)熒光分析構(gòu)件構(gòu)件光源光源 ： 為高壓汞蒸氣燈或?yàn)楦邏汗魵鉄艋螂綦?，后者能發(fā)射出強(qiáng)度較大的連續(xù)，后者能發(fā)射出強(qiáng)度較大的連續(xù)光譜，且在光譜，且在300nm400nm 范圍內(nèi)強(qiáng)度幾乎相等，故較常用范圍內(nèi)強(qiáng)度幾乎相等，故較常用 。激發(fā)單色器激發(fā)單色器 ： 置于光源和樣品室之間的為激發(fā)單色器或第一單置于光源和樣品室之間的為激發(fā)單色器或第一單色器，篩選出特定的激發(fā)光譜。色器，篩選出特定的激發(fā)光譜。 發(fā)射單色器：發(fā)射單色器：置于樣品室和檢測(cè)器之間的為發(fā)射單色器或第二置于樣品室和檢測(cè)器之間的為發(fā)射單色器或第二單色器，常采用光柵為單色器。篩選出特定的發(fā)射光譜單色器，常采用光柵為單色器。

11、篩選出特定的發(fā)射光譜 樣品室：樣品室： 通常由石英池通常由石英池(液體樣品用液體樣品用)或固體樣品架或固體樣品架(粉末或片狀樣粉末或片狀樣品品)組成。組成。 檢測(cè)器：檢測(cè)器： 一般用光電管或光電倍增管作檢測(cè)器?？蓪⒐庑盘?hào)放大一般用光電管或光電倍增管作檢測(cè)器。可將光信號(hào)放大并轉(zhuǎn)為電信號(hào)。并轉(zhuǎn)為電信號(hào)。 熒光分析法與紫外熒光分析法與紫外-可見(jiàn)分析法異同點(diǎn)可見(jiàn)分析法異同點(diǎn) 熒光分析法與紫外熒光分析法與紫外-可見(jiàn)比較：可見(jiàn)比較： 均屬于分子光譜均屬于分子光譜 儀器構(gòu)造儀器構(gòu)造 基本相似基本相似 熒光熒光 可見(jiàn)可見(jiàn)-紫外紫外 本質(zhì)本質(zhì) 發(fā)射光譜發(fā)射光譜 吸收光譜吸收光譜 靈敏度靈敏度 10-10-10-

12、12 g/ml 10-4-10-7g/ml 選擇性選擇性 高高 一般一般應(yīng)用應(yīng)用硫色素?zé)晒夥y(cè)定維生素硫色素?zé)晒夥y(cè)定維生素B1 維生素維生素B1 在堿性溶液中被鐵氰化鉀氧化成硫色素，在紫（在堿性溶液中被鐵氰化鉀氧化成硫色素，在紫（365nm）照射下呈藍(lán)色熒光（照射下呈藍(lán)色熒光（435nm）通過(guò)與對(duì)照品熒光強(qiáng)度比較。即可測(cè)得供試品）通過(guò)與對(duì)照品熒光強(qiáng)度比較。即可測(cè)得供試品含量（課本含量（課本260頁(yè)）頁(yè)）熒光分光光度法測(cè)定維生素?zé)晒夥止夤舛确y(cè)定維生素E 采用同步熒光掃描法測(cè)定血清中維生素采用同步熒光掃描法測(cè)定血清中維生素E，有效的消除溶劑拉曼，有效的消除溶劑拉曼光譜的干擾，提高靈敏度和準(zhǔn)確性。（課本光譜的干擾，提高靈敏度和準(zhǔn)確性。（課本277頁(yè)）頁(yè)）時(shí)間分辨熒光光譜時(shí)間分辨熒光光譜 基于不同發(fā)光體發(fā)光衰減速度不同.壽命不同.在進(jìn)行這種測(cè)量時(shí)要求帶有時(shí)間延遲設(shè)備的脈沖光源和帶有門(mén)控時(shí)間電路的檢測(cè)器件,從而可在固定延遲時(shí)間td和門(mén)控時(shí)間tg,用發(fā)射單色器進(jìn)行掃描.可得到時(shí)間分辨發(fā)射光譜。同步掃描 根據(jù)激發(fā)光和發(fā)射單色器在掃描過(guò)程中彼此間所保持的關(guān)系參考文獻(xiàn)參考文獻(xiàn)劉文英，藥物分析劉文英，藥物分析.袁觀(guān)宇，生物物理學(xué)袁觀(guān)宇，生物物理學(xué).李昌厚，紫外分光光度計(jì)李昌厚，紫外分光