生物分離工程03細(xì)胞破碎

1、第三章 細(xì)胞破碎 (Cell Disruption)知識(shí)點(diǎn)：知識(shí)點(diǎn)： 細(xì)胞壁的組成和結(jié)構(gòu)，微生物細(xì)胞的破碎技術(shù)，破碎率的測(cè)定。 重點(diǎn)：重點(diǎn)：工業(yè)生產(chǎn)中常用的幾種細(xì)胞破碎方法的原理，操作過(guò)程常用設(shè)備。 難點(diǎn)：難點(diǎn)：常用破碎方法的合理選用。概概 述述 一些微生物在代謝過(guò)程中將產(chǎn)物分泌到細(xì)胞外的液相中（稱胞外酶），這些產(chǎn)品主要為醫(yī)藥和保健產(chǎn)品，如胰島素、某些細(xì)胞因子和疫苗亞單位成分等。 這些蛋白質(zhì)在細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)被宿主細(xì)胞分泌到培養(yǎng)液中，提取過(guò)程只需直接采用過(guò)濾和離心進(jìn)行固-液分離，然后將獲得的澄清濾液再進(jìn)一步純化即可。其后續(xù)分離和純化都相對(duì)簡(jiǎn)單。 但由于一些重組DNA（rDNA）產(chǎn)品結(jié)構(gòu)復(fù)雜，必須在細(xì)

2、胞內(nèi)組裝來(lái)獲得生物活性，如果在培養(yǎng)時(shí)被宿主細(xì)胞分泌到培養(yǎng)液中，其生物活性往往有所改變，此類rDNA產(chǎn)品是細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)品（非分泌型），需要應(yīng)用細(xì)胞破碎技術(shù)破碎細(xì)胞，使細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)物釋放到液相中，然后再進(jìn)行提純，為后續(xù)的分離純化做好準(zhǔn)備工作。 胞外產(chǎn)品：各種胞外酶、胞外多糖、細(xì)胞代謝物 細(xì)胞本身：?jiǎn)渭?xì)胞蛋白（SCP） 胞內(nèi)產(chǎn)品：堿性磷酸酯酶，基因工程產(chǎn)物，植物細(xì)胞產(chǎn)物等概概 述述幾種由大腸桿菌表達(dá)的胞內(nèi)重組藥物幾種由大腸桿菌表達(dá)的胞內(nèi)重組藥物藥物名稱宿主用途胰島素大腸桿菌治療糖尿病人生長(zhǎng)激素（HGH）大腸桿菌治療侏儒病-干擾素大腸桿菌治療毛狀細(xì)胞白血病和卡波濟(jì)肉瘤部分微生物胞內(nèi)酶部分微生物胞內(nèi)酶什么是細(xì)胞

3、破碎技術(shù)？什么是細(xì)胞破碎技術(shù)？ 細(xì)胞破碎（cell rupture）技術(shù)是指利用外力破壞細(xì)胞膜和細(xì)胞壁，使細(xì)胞內(nèi)容物包括目的產(chǎn)物成分釋放出來(lái)的技術(shù)。 細(xì)胞破碎技術(shù)是分離純化細(xì)胞內(nèi)合成的非分泌型生化物質(zhì)（產(chǎn)品）的基礎(chǔ)。 隨著重組DNA技術(shù)和組織培養(yǎng)技術(shù)上的重大進(jìn)展，以前認(rèn)為很難獲得的蛋白質(zhì)現(xiàn)在可以大規(guī)模生產(chǎn)。第一節(jié)第一節(jié)細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和破碎阻力1 1、細(xì)胞的結(jié)構(gòu)、細(xì)胞的結(jié)構(gòu) 細(xì)菌：肽聚糖，多糖，磷壁酸，主要阻力來(lái)自于肽聚糖的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。 酵母菌：葡聚糖，甘露聚糖，蛋白質(zhì)，主要阻力來(lái)自于壁結(jié)構(gòu)交換的緊密程度和厚度。 真菌：多糖，蛋白質(zhì)，脂類，葡聚糖，幾丁質(zhì)，主要阻力來(lái)自于壁強(qiáng)度和聚合物網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。2 2、

4、破碎阻力分析、破碎阻力分析 微生物細(xì)胞和植物細(xì)胞外層均為細(xì)胞壁，細(xì)胞壁里面是細(xì)胞膜，細(xì)胞膜和它所包圍的細(xì)胞漿合稱原生質(zhì)體。動(dòng)物細(xì)胞沒(méi)有細(xì)胞壁，僅有細(xì)胞膜。通常細(xì)胞壁較堅(jiān)韌，細(xì)胞膜脆弱，易受滲透壓沖擊而破碎，因此細(xì)胞破碎的阻力主要來(lái)自于細(xì)胞壁。 基于遺傳和環(huán)境等因素，不同類型生化物質(zhì)其細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)和組成不完全相同，故細(xì)胞壁的機(jī)械強(qiáng)度不同，細(xì)胞破碎的難易程度也就不同。此外，不同的生化物質(zhì)其穩(wěn)定性有較大差別，在破碎過(guò)程中應(yīng)防止變性和被胞內(nèi)的酶水解，因此，破碎方法的選擇和操作條件的優(yōu)化是十分必要的3 3、細(xì)菌細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)、細(xì)菌細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)細(xì)菌肽聚糖結(jié)構(gòu)示意圖細(xì)菌肽聚糖結(jié)構(gòu)示意圖

5、 幾乎所有細(xì)菌的細(xì)胞壁都是由肽聚糖（peptidoglycan）組成，它 是 難 溶 性 的 聚 糖 鏈（glycan chain），借助短肽交聯(lián)而成的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，包圍在細(xì)胞周圍，使細(xì)胞具有一定的形狀和強(qiáng)度。 短肽一般由四或五個(gè)氨基酸組成，如L-Ala-D-Glu-L-Lys-D-Ala。而且短肽中常有D-氨基酸與二氨基庚二酸存在。細(xì)菌細(xì)胞壁的主要組分細(xì)菌細(xì)胞壁的主要組分革蘭氏陰性菌與陽(yáng)性菌差別革蘭氏陰性菌與陽(yáng)性菌差別 雖然幾乎所有的細(xì)菌都含有肽聚糖的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，但是革蘭氏陰性菌的細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)與革蘭氏陽(yáng)性菌有很大不同。革蘭氏陰性菌比陽(yáng)性菌復(fù)雜，在電子顯微鏡超薄切片觀察，可見(jiàn)革蘭氏陽(yáng)性菌細(xì)胞壁較厚，具

6、有2080nm的肽聚糖層，約占細(xì)胞壁成分的4090，此外細(xì)胞壁還含有大量磷壁酸(eichoic acid)。而革蘭氏陰性菌的肽聚糖層較薄，僅23nm，占細(xì)胞壁成分的10左右，由于肽聚糖之間僅由四肽側(cè)鏈直接連接，缺乏五肽橋，故層較疏松，而且肽聚糖居于細(xì)胞壁最內(nèi)層，緊貼在細(xì)胞膜上，在肽聚糖層外面還有一較厚的外壁層(約810nm)，主要成分為脂蛋白、脂多糖和其它脂類，因此，革蘭氏陰性菌細(xì)胞壁中脂類含量較高。革蘭氏陰性菌與陽(yáng)性菌差別說(shuō)明小結(jié)小結(jié) 破碎細(xì)菌的主要阻力是來(lái)自于肽聚糖的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，其網(wǎng)結(jié)構(gòu)的致密程度和強(qiáng)度取決于聚糖鏈上所存在的肽鍵的數(shù)量和其交聯(lián)的程度，如果交聯(lián)程度大，則網(wǎng)結(jié)構(gòu)就致密。4 4、酵

7、母細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)示意圖、酵母細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)示意圖破碎酵母細(xì)胞壁的阻力破碎酵母細(xì)胞壁的阻力 酵母細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)示意圖如圖所示，細(xì)胞壁的最里層是由葡聚糖的細(xì)纖維組成，它構(gòu)成了細(xì)胞壁的剛性骨架，使細(xì)胞具有一定的形狀，覆蓋在細(xì)纖維上面的是一層糖蛋白，最外層是甘露聚糖，由1,6一磷酸二酯鍵共價(jià)連接，形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。在該層的內(nèi)部，有甘露聚糖-酶的復(fù)合物，它可以共價(jià)連接到網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)上，也可以不連接。 與細(xì)菌細(xì)胞壁一樣，破碎酵母細(xì)胞壁的阻力主要決定于壁結(jié)構(gòu)交聯(lián)的緊密程度和它的厚度。5 5、紅面包霉菌、紅面包霉菌(Neurospora crassa)(Neurospora crassa)的細(xì)的細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)示意圖胞壁結(jié)構(gòu)示意

8、圖主要存在三種聚合物，葡聚糖（主要以-1,3糖苷鍵連接，某些以-1,6糖苷鍵連接），幾丁質(zhì)（以微纖維狀態(tài)存在）以及糖蛋白。最外層(a)是-和-葡聚糖的混合物，第2層(b)是糖蛋白的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，葡聚糖與糖蛋白結(jié)合起來(lái)，第3層(c)主要是蛋白質(zhì)，最內(nèi)層(d)主要是幾丁質(zhì)，幾丁質(zhì)的微纖維嵌入蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)中。與酵母和細(xì)菌的細(xì)胞壁一樣，真菌細(xì)胞壁的強(qiáng)度和聚合物的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)有關(guān)，不僅如此，它還含有幾丁質(zhì)或纖維素的纖維狀結(jié)構(gòu)，所以強(qiáng)度有所提高。各種微生物細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)與組成各種微生物細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)與組成細(xì)菌對(duì)破碎的敏感度細(xì)菌對(duì)破碎的敏感度6 6、植物細(xì)胞壁的化學(xué)組成和結(jié)構(gòu)、植物細(xì)胞壁的化學(xué)組成和結(jié)構(gòu)組分組分結(jié)構(gòu)和分類

9、結(jié)構(gòu)和分類纖維素纖維素1 1，4 4D D葡聚糖葡聚糖半纖維素半纖維素木葡聚糖、木葡聚糖、 甘露聚糖、木聚糖甘露聚糖、木聚糖( (包括阿拉包括阿拉伯木聚糖和伯木聚糖和4-0-4-0-甲基甲基- -葡萄糖醛酸木聚糖）葡萄糖醛酸木聚糖）果膠物質(zhì)果膠物質(zhì)半乳糖醛酸聚糖、鼠李半乳糖醛酸聚糖半乳糖醛酸聚糖、鼠李半乳糖醛酸聚糖 半乳聚糖和阿拉伯半乳聚糖半乳聚糖和阿拉伯半乳聚糖蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)蛋白結(jié)構(gòu)蛋白 各種酶類各種酶類 凝集素凝集素植物細(xì)胞初生壁的化學(xué)組成植物細(xì)胞初生壁的化學(xué)組成次生細(xì)胞壁次生細(xì)胞壁 某些植物細(xì)胞，當(dāng)生長(zhǎng)停止后，在細(xì)胞質(zhì)和初生細(xì)胞壁之間形成了次生細(xì)胞壁。次生壁一般較厚(4m以上)，常有三

10、層組成。 在次生壁中，纖維素和半纖維素含量比初生壁增加很多，纖維素的微纖絲排列得更緊密和有規(guī)則，而且存在木質(zhì)素（酚類組分的聚合物）的沉積。因此次生壁的形成提高了細(xì)胞壁的堅(jiān)硬性，使植物細(xì)胞具有很高的機(jī)械強(qiáng)度。第二節(jié)細(xì)胞破碎和產(chǎn)物釋放原理破碎方法破碎方法 目前已發(fā)展了多種細(xì)胞破碎方法，以便適應(yīng)不同用途和不同類型的細(xì)胞壁破碎。 破碎主要有三種方法： （1）化學(xué)破碎法 （2）機(jī)械破碎法 （3）化學(xué)和機(jī)械破碎法結(jié)合化學(xué)破碎法化學(xué)破碎法 又稱化學(xué)滲透法（chemical permeation) 原理：利用化學(xué)或生化試劑（酶）改變細(xì)胞壁或細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)，增大胞內(nèi)物質(zhì)的溶解速率；或者完全溶解細(xì)胞壁，形成原生質(zhì)體

11、（protoplast）后，在滲透壓作用下使細(xì)胞膜破裂而釋放胞內(nèi)物質(zhì)。機(jī)械破碎法機(jī)械破碎法 細(xì)胞所受的力：壓縮力和剪切力。 細(xì)胞破碎僅為目標(biāo)產(chǎn)物的釋放創(chuàng)造了條件，而不是最終目的。破碎方法小結(jié)破碎方法小結(jié)1 1破碎方法小結(jié)破碎方法小結(jié)2 2分分 類類作作 用用 機(jī)機(jī) 理理適適 應(yīng)應(yīng) 性性機(jī)機(jī)械械法法珠磨法珠磨法固體剪切作用固體剪切作用可達(dá)較高破碎率，可較大規(guī)模操作，大分可達(dá)較高破碎率，可較大規(guī)模操作，大分子目的產(chǎn)物易失活，漿液分離困難子目的產(chǎn)物易失活，漿液分離困難高壓勻漿高壓勻漿法法液體剪切作用液體剪切作用可達(dá)較高破碎率，可大規(guī)模操作，不適合可達(dá)較高破碎率，可大規(guī)模操作，不適合絲狀菌和革蘭氏陽(yáng)性

12、菌絲狀菌和革蘭氏陽(yáng)性菌超聲破碎超聲破碎法法液體剪切作用液體剪切作用對(duì)酵母菌效果較差，破碎過(guò)程升溫劇烈，對(duì)酵母菌效果較差，破碎過(guò)程升溫劇烈，不適合大規(guī)模操作不適合大規(guī)模操作X-pressX-press法法固體剪切作用固體剪切作用破碎率高，活性保留率高，對(duì)冷凍敏感目破碎率高，活性保留率高，對(duì)冷凍敏感目的產(chǎn)物不適合的產(chǎn)物不適合非非機(jī)機(jī)械械法法酶溶法酶溶法酶分解作用酶分解作用具有高度專一性，條件溫和，漿液易分離，具有高度專一性，條件溫和，漿液易分離，溶酶價(jià)格高，通用性差溶酶價(jià)格高，通用性差化學(xué)滲透化學(xué)滲透法法改變細(xì)胞膜的滲透改變細(xì)胞膜的滲透性性具一定選擇性，漿液易分離，但釋放率較具一定選擇性，漿液易分

13、離，但釋放率較低，通用性差低，通用性差滲透壓法滲透壓法滲透壓劇烈改變滲透壓劇烈改變破碎率較低，常與其他方法結(jié)合使用破碎率較低，常與其他方法結(jié)合使用凍結(jié)融化凍結(jié)融化法法反復(fù)凍結(jié)反復(fù)凍結(jié)- -融化融化破碎率較低，不適合對(duì)冷凍敏感目的產(chǎn)物破碎率較低，不適合對(duì)冷凍敏感目的產(chǎn)物干燥法干燥法改變細(xì)胞膜滲透性改變細(xì)胞膜滲透性條件變化劇烈，易引起大分子物質(zhì)失活條件變化劇烈，易引起大分子物質(zhì)失活機(jī)械破碎法與非機(jī)械法比較機(jī)械破碎法與非機(jī)械法比較一、機(jī)械破碎一、機(jī)械破碎 是工業(yè)規(guī)模細(xì)胞破碎的主要手段 主要基于對(duì)物料的擠壓和剪切作用。 主要有高壓勻漿、珠磨、撞擊破碎和超聲波破碎等1、高壓勻漿法、高壓勻漿法（High-

14、pressure homogenization）大規(guī)模細(xì)胞破碎常用方法大規(guī)模細(xì)胞破碎常用方法高壓勻漿器（高壓勻漿器（High pressure homogenizer）操作原理操作原理 Manton Gaulin高壓勻漿器是常用的設(shè)備，它由可產(chǎn)生高壓的正向排代泵（positive displacenemt pump）和排出閥（discharge valve）組成，排出閥具有狹窄的小孔，其大小可以調(diào)節(jié)。細(xì)胞漿液通過(guò)止逆閥進(jìn)入泵體內(nèi)，在高壓下迫使其在排出閥的小孔中高速?zèng)_出，并射向撞擊環(huán)上，由于突然減壓和高速?zèng)_擊，使細(xì)胞受到高的液相剪切力而破碎。 在操作方式上，可以采用單次通過(guò)勻漿器或多次循環(huán)通過(guò)等

15、方式，也可連續(xù)操作。為了控制溫度的升高，可在進(jìn)口處用干冰調(diào)節(jié)溫度，使出口溫度調(diào)節(jié)在20左右。在工業(yè)規(guī)模的細(xì)胞破碎中，對(duì)于酵母等難破碎的及濃度高或處于生長(zhǎng)靜止期的細(xì)胞，常采用多次循環(huán)的操作方法。操操作作原原理理圖圖高壓勻漿法適用的范圍高壓勻漿法適用的范圍 酵母和大多數(shù)細(xì)菌細(xì)胞的破碎。 料液細(xì)胞濃度可達(dá)到20%左右。 團(tuán)狀和系狀菌易造成高壓勻漿器的堵塞，不宜使用高壓勻漿法。高壓勻漿法使用時(shí)注意事項(xiàng)高壓勻漿法使用時(shí)注意事項(xiàng) 高壓勻漿器的操作溫度上升約/10MPa 為了保護(hù)目標(biāo)產(chǎn)物的生物活性，需要對(duì)料液作冷卻處理。 多組破碎操作中需要在級(jí)間設(shè)置冷卻裝置可有效防止溫度上升，保護(hù)產(chǎn)物活性高壓勻漿器的種類高

16、壓勻漿器的種類 高壓勻漿器的種類較多 WAB公司的AVP Gaulin 31MR型，最大操作壓力為24MPa，最大處理量為100dm3/h Bran and luebbe 公司SHL40型，最大操作壓力為20-63MPa，最大處理量為為2.6-34 m3/h影響破碎的主要因素影響破碎的主要因素l壓力、溫度、通過(guò)均漿器閥的次數(shù)壓力、溫度、通過(guò)均漿器閥的次數(shù)l升高壓力有利于破碎，它表明可以減少細(xì)胞的循環(huán)次數(shù)，在不明顯增加通過(guò)量的情況下，甚至一次通過(guò)勻漿閥就可達(dá)到幾乎完全的破碎，這樣就可避免細(xì)胞碎片不至過(guò)小，從而給隨后細(xì)胞碎片的分離工作帶來(lái)好處。Brokman等人已研究了能適應(yīng)于高壓操作的勻漿閥，試

17、驗(yàn)表明在約175 MPa的壓力下，破碎率可達(dá)100，但是也有試驗(yàn)表明當(dāng)壓力超過(guò)一定的值后，破碎率增長(zhǎng)得很慢，在工業(yè)生產(chǎn)中，通常采用的壓力為55-70Mpa。2、珠磨（、珠磨（Bead mill） 高速珠磨機(jī)（High speed bead mill） 研磨是常用的一種方法，它將細(xì)胞懸浮液與玻璃小珠、石英砂或氧化鋁等研磨劑一起快速攪拌，使細(xì)胞獲得破碎。在工業(yè)規(guī)模的破碎中，常采用高速珠磨機(jī) 。高速珠磨機(jī)工作原理高速珠磨機(jī)工作原理 水平位置的磨室內(nèi)放置玻離小珠，裝在同心軸上的園盤(pán)攪拌器高速旋轉(zhuǎn)，使細(xì)胞懸浮液和玻離小珠相互攪動(dòng)，細(xì)胞的破碎是由剪切力層之間的碰撞和磨料的滾動(dòng)而引起。在料液出口處，旋轉(zhuǎn)園盤(pán)

18、和出口平板之間的狹縫很小，可阻擋玻離小珠，使不被料液帶出。由于操作過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生熱量，易造成某些生化物質(zhì)破壞，故磨室還裝有冷卻夾套，以冷卻細(xì)胞懸浮液和玻離小珠。Netzsch LM-20Netzsch LM-20型珠磨機(jī)型珠磨機(jī)3、撞擊破碎、撞擊破碎4、超聲波破碎（、超聲波破碎（Ultrasonication） 超聲波破碎法（Ultrasonication)利用超聲波振蕩器發(fā)射的15-25kHz的超聲波探頭處理細(xì)胞懸浮液。 超聲波振蕩器有不同的類型，常用的為電聲型，它是由發(fā)生器和換能器組成，發(fā)生器能產(chǎn)生高頻電流，換能器的作用是把電磁振蕩轉(zhuǎn)換成機(jī)械振動(dòng)。超聲波振蕩器以可分為槽式和探頭直接插入介質(zhì)兩

19、種型式，一般破碎效果后者比前者好。超聲波破碎的機(jī)理超聲波破碎的機(jī)理 一般認(rèn)為在超聲波作用下液體發(fā)生空化作用（cavitation），空穴泡由于受到超聲波的迅速?zèng)_擊而閉合，從而產(chǎn)生一個(gè)極為強(qiáng)烈的沖擊波壓力，由它引起的粘滯性旋渦在介質(zhì)中的懸浮細(xì)胞上造成了剪切應(yīng)力，促使細(xì)胞液體發(fā)生流動(dòng)，從而使細(xì)胞破碎。 超聲波的細(xì)胞破碎效率與細(xì)胞種類、濃度和超聲波的聲頻、聲能有關(guān)。超聲波破碎的適用范圍超聲波破碎的適用范圍 超聲波破碎是很強(qiáng)烈的破碎方法，適用于多數(shù)微生物的破碎。 一般桿菌比球菌易破碎，G-細(xì)菌比G+細(xì)菌易破碎，對(duì)酵母菌的效果較差， 超聲波破碎的有效能量利用率極低，操作過(guò)程產(chǎn)生大量的熱，因此操作需在冰水

20、或外部冷卻的容器中進(jìn)行。由于對(duì)冷卻的要求相當(dāng)苛刻，所以不易放大，另超聲波產(chǎn)生的化學(xué)自由基團(tuán)能使某些敏感性活性物質(zhì)失活。故主要用于實(shí)驗(yàn)室規(guī)模的細(xì)胞破碎。超聲波破碎圖示超聲波破碎圖示超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)二、非機(jī)械法二、非機(jī)械法 非機(jī)械方法很多 酶解 滲透壓沖擊 凍結(jié)和融化 干燥法 化學(xué)法溶胞 其中酶法和化學(xué)法溶胞應(yīng)用最廣。1、酶溶法（、酶溶法（Enzymatic Lysis） （1）外加酶法）外加酶法 酶溶是利用溶解細(xì)胞壁的酶處理菌體細(xì)胞，使細(xì)胞壁受到部分或完全破壞后，再利用滲透壓沖擊等方法破壞細(xì)胞膜，進(jìn)一步增大胞內(nèi)產(chǎn)物的通透性。溶菌酶（lysozyme)適用于革蘭氏陰性菌細(xì)胞的分解，

21、應(yīng)用于革蘭氏陰性菌時(shí)，需輔以EDTA使之更有效地作用于細(xì)胞壁。 真核細(xì)胞的細(xì)胞壁不同于原核細(xì)胞，需采用不同的酶。常用的溶酶常用的溶酶常用的溶酶常用的溶酶溶菌酶、溶菌酶、-1，3-葡聚糖酶、葡聚糖酶、-1，6-葡聚糖酶、葡聚糖酶、蛋白酶、蛋白酶、甘露糖酶、甘露糖酶、糖苷酶、糖苷酶、肽鍵內(nèi)切酶、肽鍵內(nèi)切酶、殼多糖酶等殼多糖酶等溶菌酶主要用于細(xì)菌類溶菌酶主要用于細(xì)菌類細(xì)胞壁溶解酶是幾種酶的復(fù)合物細(xì)胞壁溶解酶是幾種酶的復(fù)合物使用時(shí)需注意的問(wèn)題使用時(shí)需注意的問(wèn)題 利用溶酶系統(tǒng)處理細(xì)胞時(shí)必須根據(jù)細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)和化學(xué)組成選擇適當(dāng)?shù)拿?，并確定相應(yīng)的次序。 對(duì)酵母細(xì)胞采用酶法破碎時(shí)，先加入蛋白酶作用蛋白質(zhì)-甘露聚

22、糖結(jié)構(gòu)，使二者溶解，再加入葡聚糖酶作用裸露的葡聚糖層，最后只剩下原生質(zhì)體，這時(shí)若緩沖液的滲透壓變化，則細(xì)胞膜破裂，釋出胞內(nèi)產(chǎn)物。酶解法的優(yōu)缺點(diǎn)酶解法的優(yōu)缺點(diǎn) 優(yōu)點(diǎn)：優(yōu)點(diǎn)： 發(fā)生酶解的條件溫和 能選擇性地釋放產(chǎn)物 胞內(nèi)核酸等泄出量少，細(xì)胞外形較完整，便于后步分離等 缺點(diǎn)：缺點(diǎn)： 溶酶價(jià)格高，溶酶法通用性差（不同菌種需選擇不同的酶），產(chǎn)物抑制的存在。 在溶酶系統(tǒng)中，甘露糖對(duì)蛋白酶有抑制作用，葡聚糖抑制葡聚糖酶。（2）自溶法）自溶法 自溶作用是酶解的另一種方法，利用生物體自身產(chǎn)生的酶來(lái)溶胞，而不需外加其他的酶。 在微生物代謝過(guò)程中，大多數(shù)都能產(chǎn)生一種能水解細(xì)胞壁上聚合物的酶，以便生長(zhǎng)過(guò)程繼續(xù)下去?？?/p>

23、是，改變其生長(zhǎng)環(huán)境，可以誘發(fā)產(chǎn)生過(guò)剩的這種酶或激發(fā)產(chǎn)生其它的自溶酶，以達(dá)到自溶目的。 影響自溶過(guò)程的主要因素影響自溶過(guò)程的主要因素有溫度、時(shí)間、pH值、激活劑和細(xì)胞代謝途徑等。 缺點(diǎn)缺點(diǎn)是：對(duì)不穩(wěn)定的微生物，易引起所需蛋白質(zhì)的變性，自溶后細(xì)胞懸浮液粘度增大，過(guò)濾速度下降。2.化學(xué)滲透法化學(xué)滲透法（Chemical permeation） 某些化學(xué)試劑，如有機(jī)溶劑、變性劑、表面活性劑、抗生素、金屬螯合劑等，可以改變細(xì)胞壁或膜的通透性（滲透性），從而使胞內(nèi)物質(zhì)有選擇地滲透出來(lái)。 該法取決于化學(xué)試劑的類型以及細(xì)胞壁膜的結(jié)構(gòu)與組成?；瘜W(xué)法化學(xué)法 酸處理可以使蛋白質(zhì)水解成氨基酸，通常采用6mol/L H

24、Cl。堿和表面活性劑能溶解細(xì)胞壁上脂類物質(zhì)或使某些組分從細(xì)胞內(nèi)滲漏出來(lái)。天然的表面活性劑有膽酸鹽和磷脂等 合成的表面活性劑可分離子型和非離子型，離子型如十二烷基硫酸鈉（SDS，陰離子型）；十六烷基三甲基溴化銨（陽(yáng)離子型）。非離子型如Triton X-100和吐溫（Tween）等 有機(jī)溶劑可采用丁酯、丁醇、丙酮、氯仿和甲苯等特點(diǎn)特點(diǎn) 化學(xué)法和酶法一樣也存在對(duì)產(chǎn)物的釋出選擇性好，細(xì)胞外形較完整，碎片少，核酸等胞內(nèi)雜質(zhì)釋放少，便于后步分離等優(yōu)點(diǎn)，故使用較多。但該法容易引起活性物質(zhì)失活破壞，因此，根據(jù)生化物質(zhì)的穩(wěn)定性來(lái)選擇合適的化學(xué)試劑和操作條件是非常重要的。另外，化學(xué)試劑的加入，常會(huì)給隨后產(chǎn)物的純化

25、帶來(lái)困難，并影響最終產(chǎn)物純度。如表面活性劑存在常會(huì)影響鹽析中蛋白質(zhì)的沉淀和疏水層析，因此必須注意除去。3、滲透壓沖擊法、滲透壓沖擊法 滲透壓沖擊是較溫和的一種破碎方法，將細(xì)胞放在高滲透壓的溶液中（如一定濃度的甘油或蔗糖溶液），由于滲透壓的作用，細(xì)胞內(nèi)水分便向外滲出，細(xì)胞發(fā)生收縮，當(dāng)達(dá)到平衡后，將介質(zhì)快速稀釋，或?qū)⒓?xì)胞轉(zhuǎn)入水或緩沖液中，由于滲透壓的突然變化，胞外的水迅速滲入胞內(nèi)，引起細(xì)胞快速膨脹而破裂。4、凍結(jié)、凍結(jié)-融化法融化法 將細(xì)胞放在低溫下冷凍（約-15），然后在室溫中融化，反復(fù)多次而達(dá)到破壁作用。由于冷凍，一方面能使細(xì)胞膜的疏水鍵結(jié)構(gòu)破裂，從而增加細(xì)胞的親水性能，另一方面胞內(nèi)水結(jié)晶，形

26、成冰晶粒，引起細(xì)胞膨脹而破裂。對(duì)于細(xì)胞壁較脆弱的菌體，可采用此法。 但只適用于細(xì)胞壁較脆弱的菌體；破碎率較低，常需反復(fù)多次；凍融中，可能引起某些蛋白質(zhì)變性。5、干燥法、干燥法 經(jīng)干燥后的細(xì)胞，其細(xì)胞膜的滲透性發(fā)生變化，同時(shí)部分菌體會(huì)產(chǎn)生自溶，然后用丙酮、丁醇或緩沖液等溶劑處理時(shí)，胞內(nèi)物質(zhì)就會(huì)被抽提出來(lái)。三、目標(biāo)產(chǎn)物的選擇性釋放三、目標(biāo)產(chǎn)物的選擇性釋放 破碎的目的是要得到一種或幾種目標(biāo)產(chǎn)物，因此，在細(xì)胞內(nèi)存在的許多種物質(zhì)中，選擇性釋放目標(biāo)產(chǎn)物、而使其它物質(zhì)盡量少地釋放出來(lái)，并且盡量降低細(xì)胞的破碎程度，對(duì)下游的分離純化操作的順利實(shí)施是非常重要非常重要的。 利用珠磨法破碎酵母細(xì)胞時(shí)，酵母內(nèi)各種酶的釋

27、放速率常數(shù)不同。一般靠近細(xì)胞壁和細(xì)胞膜的酶釋放速度快，而細(xì)胞內(nèi)部或細(xì)胞器內(nèi)的酶隨破碎的進(jìn)行緩慢釋放出來(lái)。因此，選擇發(fā)現(xiàn)地釋放目標(biāo)產(chǎn)物是可能的是可能的。 關(guān)鍵關(guān)鍵是要知道目標(biāo)產(chǎn)物的性質(zhì)和在細(xì)胞同存在的位置，選擇適當(dāng)?shù)钠扑榉椒ê筒僮鳁l件。選擇性釋放目標(biāo)產(chǎn)物的一般原則選擇性釋放目標(biāo)產(chǎn)物的一般原則 （1）僅破壞或破碎存在目標(biāo)產(chǎn)物的位置周圍）僅破壞或破碎存在目標(biāo)產(chǎn)物的位置周圍 當(dāng)目標(biāo)產(chǎn)物存在于細(xì)胞膜附近時(shí)，可采用較混和的方法，如酶溶法（包括自溶法）、滲透壓沖擊法和凍結(jié)-融化法等。當(dāng)目標(biāo)產(chǎn)物存在于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)時(shí)，則需采用強(qiáng)烈的機(jī)械破碎法 （2）選擇性溶解目標(biāo)產(chǎn)物。）選擇性溶解目標(biāo)產(chǎn)物。 當(dāng)目標(biāo)產(chǎn)物處于與細(xì)胞膜

28、或細(xì)胞壁結(jié)合的狀態(tài)時(shí)，調(diào)節(jié)溶液PH值，離子強(qiáng)度或添加與目標(biāo)產(chǎn)物具有親和性的試劑如：螯合劑、表面活性劑等，使目標(biāo)產(chǎn)物容易溶解釋放。同時(shí)，溶液性質(zhì)應(yīng)使其他雜質(zhì)不易溶出。另外機(jī)械破碎法和化學(xué)法并用可使操作條件更加溫和，在相同的目標(biāo)產(chǎn)物釋放率條件下，降低細(xì)胞的破碎程度。第四節(jié) 包含體的分離和蛋白質(zhì)復(fù)性概述概述 重組DNA技術(shù)為大規(guī)模生產(chǎn)目標(biāo)蛋白質(zhì)提供了嶄新的途徑，開(kāi)辟了現(xiàn)代生物技術(shù)發(fā)展的新紀(jì)元。但是，人們?cè)诜蛛x純化基因工程表達(dá)產(chǎn)物時(shí)遇到了意想不到的困難，很多利用大腸桿菌為宿主細(xì)胞的外源基因表達(dá)產(chǎn)物（如尿激酶、人胰島素、人生長(zhǎng)激素、白細(xì)胞介素、人干擾素等）不僅不能分泌到細(xì)胞外、而且在細(xì)胞內(nèi)凝聚成沒(méi)有生物

29、活性的固體顆粒包含體（inclusion bodies IBs）1、包含體、包含體 包含體主要由蛋白質(zhì)構(gòu)成，其中大多是基因表達(dá)產(chǎn)物。這些 基因表達(dá)產(chǎn)物的一級(jí)結(jié)構(gòu)是正確的，但立體結(jié)構(gòu)是錯(cuò)誤的，所以沒(méi)有生物活性。為此，欲獲得天然活性態(tài)的目標(biāo)產(chǎn)物，必需分離包含體后，溶解包含體并使其中的目標(biāo)蛋白恢復(fù)應(yīng)有的天然活性。所以，包含體的出現(xiàn)不僅增加了生化工程師生物分離設(shè)計(jì)的難度，也為生物化學(xué)家的蛋白質(zhì)折疊（protein folding）機(jī)理研究提出了新的課題。2、包含體的形成、包含體的形成 機(jī)理尚不完全清楚，但一般認(rèn)為包含體的形成是部分折疊的中間態(tài)之間疏水性相互作用的結(jié)果。3、目標(biāo)蛋白的復(fù)性、目標(biāo)蛋白的復(fù)性

30、 包含體（inclusion bodies）是無(wú)定形的蛋白質(zhì)的聚集，不被任何膜所包圍。細(xì)胞破碎后，包含體呈顆粒狀，致密，低速離心就可以沉淀。包含體難溶于水中，在變性劑溶液（如鹽酸胍、脲）中才能溶解。在這些溶液中，溶解的蛋白質(zhì)呈變性狀態(tài)，即所有的氫鍵、疏水鍵全被破壞，疏水側(cè)鏈完全暴露，但一級(jí)結(jié)構(gòu)和共價(jià)鍵不被破壞。因此當(dāng)除去變性劑時(shí)，一部分蛋白質(zhì)可以自動(dòng)折疊成具有活性的正確構(gòu)型，這一折疊過(guò)程稱為蛋白質(zhì)的復(fù)性。 低蛋白質(zhì)濃度有利于獲得較高的復(fù)性收率。4、基因工程包涵體的純化方法、基因工程包涵體的純化方法收集菌體細(xì)胞收集菌體細(xì)胞細(xì)胞破碎細(xì)胞破碎包涵體包涵體的洗滌的洗滌目標(biāo)蛋白的變性溶解目標(biāo)蛋白的變性溶

31、解目標(biāo)蛋白的復(fù)性目標(biāo)蛋白的復(fù)性幾種常見(jiàn)的工藝路線（一）幾種常見(jiàn)的工藝路線（一）l特點(diǎn)：特點(diǎn)：利用了包含體與細(xì)胞碎片的密度差，用離心法將包含體與細(xì)胞碎片和可溶性蛋白質(zhì)分開(kāi)，獲得了干凈的包含體，再對(duì)包含體溶解復(fù)性。這樣首先就擺脫了大量的雜蛋白、核酸、熱原、內(nèi)毒素等雜質(zhì)，使后面的分離純化簡(jiǎn)單了。從這個(gè)角度上講，包含體的形成對(duì)分離純化亦有好處。l缺點(diǎn)：缺點(diǎn)：要經(jīng)過(guò)幾次離心才能除去大部分的細(xì)胞碎片，加工時(shí)間較長(zhǎng)。幾種常見(jiàn)的工藝路線（二）幾種常見(jiàn)的工藝路線（二） 路線（二）應(yīng)用了膜分離技術(shù)，用微孔膜除去可溶性蛋白質(zhì)，但細(xì)胞碎片卻和包含體一起被膜擋住，難以分開(kāi)；而且膜的堵塞和濃差極化常常導(dǎo)致可溶性蛋白質(zhì)的滯留，因此這條路線的問(wèn)題比較多。膜分離的優(yōu)點(diǎn)是封閉式操作，不污染環(huán)境也不受環(huán)境污染，能量消耗也比離心法少。幾種常見(jiàn)的工藝路線（三）幾種常見(jiàn)的工藝路線（三） 是用化學(xué)法破碎，所采用的試劑既可以破碎又可以溶解包含體，將兩道工序和為一道，節(jié)省了設(shè)備和時(shí)間，比前兩者更適合于實(shí)驗(yàn)室操作。缺點(diǎn)是所有的可溶性雜質(zhì)都沒(méi)有除去，混雜在產(chǎn)物中間，給后續(xù)分離帶來(lái)困難。包含體產(chǎn)物分離工藝（牛生長(zhǎng)激