銀杏葉黃酮提取及含量測定

1、銀杏葉黃酮提取及含量測定一、實驗目的1、掌握銀杏葉中黃酮的提取方法2、了解銀杏葉中黃酮的含量測定二、實驗原理近幾年來，隨著對黃酮類化合物研究的日益深入與重視， 黃酮類化合物提取技 術的發(fā)展也得到了促進。目前提取黃酮類化合物的方法主要包括有機溶劑浸提 法、超聲波提取法、超臨界流體萃取法、微波提取法和酶提取法等。1.1 有機溶劑浸提法目前國內(nèi)外使用最廣泛的銀杏葉中黃酮的提取方法就是有機溶劑提取法，一般可用乙酸乙酯、丙酮、乙醇、甲醇或某些極性較大的混合溶劑，如甲醇一水（1 + 1）溶液。由于甲醇的毒性、揮發(fā)性較大，因此一般采用乙醇作為提取劑。銀杏 葉干燥粉碎后用有機溶劑浸泡、提取、過濾，濾液中的溶劑

2、經(jīng)減壓蒸餾除去后得 銀杏葉浸膏粗提物。徐桂花等1提取銀杏葉中黃酮類化合物時，采用乙醇（7 0 + 30）溶液為提取劑，提取溫度為70C,料液質(zhì)量濃度比為1g比40m L,提取時間為4h。由于乙醇提取工藝在安全性、溶劑成本、效率及雜質(zhì)酚酸 去除等方面都不能應對日益嚴酷的市場競爭，張林濤等1提出了以硼砂- 氫氧化鈣堿水為溶劑提取銀杏葉黃酮， 其黃酮提取率與文獻值相近，但提取工藝 時間縮短為1h。1.2 超聲波提取法超聲波提取法是利用攪拌作用、強烈的振動和空間效應、高的加速度等使藥物有 效成分進入溶劑，從而提高提取率，縮短提取時間，并能消除高溫對提取成分影 響的一種提取法。劉晶芝等2運用了超聲波技術

3、與水浸提取相結(jié)合的方法得 出超聲波提取的最佳工藝條件為： 超聲頻率4 0kHz,超聲處理時間55mi n，料液質(zhì)量比1比10 0,提取溫度35C,靜置3h，提取率為81.9%。郭國瑞等3以水為介質(zhì)，超聲波提取銀杏葉中黃酮苷，與常規(guī)水浸提法比較， 超聲波提取效率大大提高，確定超聲波提取的最佳工藝為：超聲處理時間55min,料液質(zhì)量比1比30,提取溫度50C，提取率為82.3%。1.3 超臨界流體萃取法超臨界流體萃取法是一種以超臨界流體代替常規(guī)有機溶劑對有效成分進行萃取 和分離的新技術?？勺鳛槌R界流體的物質(zhì)很多，其中二氧化碳臨界溫度（TC = 31.3C ）接近室溫，且具有無色、無毒、無味、不易

4、燃、化學惰性、價廉、 易制成高純氣體等優(yōu)點而被廣泛應用，特別在中藥材及其制劑中更顯示出其獨 特、簡便、快速、具有較高的選擇性、提取雜質(zhì)少、可直接進樣分析的優(yōu)點。鄧 啟煥等4探討了超臨界萃取銀杏葉有效成分的影響因素，最佳條件為萃取壓 力2 0MPa、時間9 0min、粒度3.9mm、溫度40°C，經(jīng)測定銀杏葉 黃酮的質(zhì)量分數(shù)為2 8%，高于國際公認標準。1.4 微波提取法微波提取法是利用分子或離子在微波場中的導電效應直接對物質(zhì)進行加熱從而 提取植物細胞內(nèi)耐熱物質(zhì)的新工藝。曾里等5的研究表明以乙醇溶液作溶劑 比以水作溶劑的效果好，最佳條件為以乙醇（ 6 0 + 4 0 ）溶液為提取劑，解

5、凍處理20min。張鵬等6對微波法提取銀杏葉中黃酮類物質(zhì)進行了研究， 最佳提取條件為以乙醇（50+50）溶液為提取劑，料液比為lg比2 5mL，回流溫度70C，微波時間120s，該 條件下總黃酮提取率為11.02%。但微波提取存在局限性，它要求被處理的物料具有良好的吸水性而且只適用于生物細胞內(nèi)耐熱物質(zhì)的分離提取，否則細胞難以吸收足夠的微波將自身擊破，產(chǎn)物也難以迅速釋放出來。1.5 酶提取法酶提取法是利用酶反應的高度專一性， 將細胞壁的組成成分水解或降解，破壞細 胞壁，從而提高有效成分的提取率。在銀杏葉總黃酮提取過程中，由于細胞壁的 束縛作用，總黃酮不易溶出。酶提取法能將組成細胞壁的纖維素骨架逐

6、級降解成 葡萄糖，進而破壞細胞壁骨架結(jié)構(gòu)，增加細胞內(nèi)有效成分的溶出。吳梅林等7-10采用纖維素酶對銀杏中黃酮類化合物進行了提取，三者的酶解條件分別為酶質(zhì)量濃度0.4 0gL1，酶作用時間120min，酶解溫度50°C，酶解介質(zhì)pH4.5，乙醇（7 + 3）溶液，提取溫度70C ;纖維素酶濃度4 0U/mL，酶解pH 4.8，酶解溫度5 5 C,酶解時間9 0 min; 維素酶用量3 0FPIU/g銀杏葉、 酶解時間50min。此外，許明淑等1 1利用Suhong GA 4 7 5轉(zhuǎn)苷酶和麥芽糖基供體將極性低的黃酮苷 元轉(zhuǎn)為黃酮苷，提高了總黃酮在醇水中的溶解率。 結(jié)果表明：溫度為55C

7、6 0C，pH 為6.06.5，反應時間為10h時，總黃酮的提取率比未加 酶對照組增加了4 4%。王建偉等12采用復合酶對銀杏葉進行初步的預處 理，然后用轉(zhuǎn)化酶將黃酮苷轉(zhuǎn)化為生物活性較強的苷元類物質(zhì)，銀杏提取物（含銀杏黃酮醇苷不小于24%）經(jīng)過生物轉(zhuǎn)化后各苷元的質(zhì)量分數(shù)為： 槲皮素占2 4.87%，山奈酚占30.18%，異鼠李素占4.60%，總苷元質(zhì)量分數(shù) 為5 9.6 5 %，顯著提高了銀杏葉提取物（GBE ）的生理活性和苷元黃酮的 含量，從而大大提高了銀杏黃酮的生物學效價。本實驗中提取采用第一種方法一一溶劑提取法。對銀杏中黃酮的總含量測定的方法較多，但對采用微波干燥方式對葉片進 行干燥的報

8、道較少。本文運用UV法測定銀杏葉及樹皮中黃酮含量。三、器材與試劑1、 器材：銀杏葉、索氏提取裝置、紫外分光光度儀、電爐、烘箱、10ml容量瓶、 50ml容量瓶、試管、膠頭滴管、玻璃棒、溫度計、圓底燒瓶、石棉網(wǎng)。研缽、烘箱2、試劑：蘆丁標準液、甲醇、30匯醇、NaN2 A1（NOB）3、NaOH糖類（葡萄精、D果糖、蔗糖，乳糖和麥芽糖）、氯仿等四、實驗步驟（一）黃酮類化合物的提取：準確稱量1 . 5g左右銀杏葉，于索氏抽提器中用甲醇 提取曲，濃縮并轉(zhuǎn)入50ml容量瓶中，用甲醇定容，搖勻后取1 ml，于10ml容量 瓶中用30乙醇一水稀釋至刻度，供分析用（二） 分光光度法測定總黃酮含量：以蘆丁為標

9、樣測定銀杏葉中總黃酮的步驟如下。將一定量樣品液置10m容量瓶中， 用30%乙醇補充至5 m1，加入0. 3ml NaN1 : 20），搖勻，放置 5min后加入 0. 3m1 A1（NO）3（1 ： 10），6min 后再加 入2ml 1mol /LNaOH混勻，用30%乙醇稀釋至刻度，lOmin后于波長510ar處進 行比色測定，試劑為空白參比。有關條件試驗結(jié)果：1. 比色溶液顯色后，在4h內(nèi)吸光度的變化 5，說明黃酮類與鋁生成絡臺物顯 色是穩(wěn)定的。2. 加入的 NaNOX Al（NO3）3和NaO的量分別在 0. 1 0. 4mi, 0. 1 O. 4ml和O. 54ml濺定的吸光度基本不

10、變。3. 加入20倍于蘆丁含量的下列之的糖類；葡萄精、D果糖、蔗糖，乳糖和麥芽 糖，不干擾黃酮的比色測定。4. 提取液中含有的葉綠素等雜質(zhì)的影響： 將銀杏葉提取液濃縮，以熱水溶解后， 用氯仿脫脂2次，除去葉綠素等溶于氯仿的成分，測得總黃酮含量平均低 11 (部 分I游離的黃酮甙元溶于氯仿)，葉綠索等雜質(zhì)對總黃酮測定影響不會超過 11 o5. 標準曲線：以0. 091mg/ml的蘆丁標準液進行比色測定，用最小二乘法作線 性回歸，得方程丫 =0. 896510. 001403, r=0 99989。6. 方法的回收率和精密度；用標準加入法測定了樣品提取和比色測定流程的回 收率，結(jié)果表明：銀杏葉用甲醇一索氏法提取有效成分，稀釋后直接比色測定， 黃酮甙能定量回收。變異系數(shù)為1.6% (n=4) o五、結(jié)果與討論1、不同時期的銀杏葉中黃酮含量是否一致？2、本實驗中溶劑提取法有什么優(yōu)點和缺點？3、簡述實驗中要注意哪些事項。參考文獻：:1 :張林濤，張鋒，王志樣，等中國藥物警戒J，2011，8(3) : 14 7-151.:2:劉晶芝.安徽農(nóng)業(yè)科學J ，2007，35 (14) : 4 1 0 5 - 4 1 0 6.:3 :郭國瑞，謝永榮，鐘海山贛南師范學院學報J，2 0 0 1(3)