一株藥用紅樹(shù)內(nèi)生真菌Stemphyliumsp次級(jí)代謝產(chǎn)及抗菌活性研究

1、題目：一株藥用紅樹(shù)內(nèi)生真菌 Stemphylium sp. 33231 次級(jí)代謝產(chǎn)及抗菌活性研究姓姓 名：名： 學(xué)學(xué) 號(hào)：號(hào)： 專(zhuān)專(zhuān) 業(yè)：業(yè)： 制藥工程制藥工程 年年 級(jí)：級(jí)： 2010 級(jí)級(jí) 系系 別：別： 制藥工程制藥工程 學(xué)學(xué) 院院: 化學(xué)與化工化學(xué)與化工 完成日期：完成日期： 2014 年年 5 月月 指導(dǎo)教師：指導(dǎo)教師： 本科生畢業(yè)論文（設(shè)計(jì)）獨(dú)創(chuàng)性聲明 本人聲明所呈交的畢業(yè)論文（設(shè)計(jì)）是本人在導(dǎo)師指導(dǎo)下進(jìn)行的研究工作及取得的研究成果，除了文中特別加以標(biāo)注和致謝的地方外，本論文（設(shè)計(jì)）中沒(méi)有抄襲他人研究成果和偽造數(shù)據(jù)等行為 。與我一同工作的同志對(duì)本研究所做的任何貢獻(xiàn)均已在論文（設(shè)計(jì)）

2、中作了明確的說(shuō)明并表示謝意。論文（設(shè)計(jì)）作者簽名： 日期： 本科生畢業(yè)論文（設(shè)計(jì)）使用授權(quán)聲明海南師范大學(xué)有權(quán)保留并向國(guó)家有關(guān)部門(mén)或機(jī)構(gòu)送交畢業(yè)論文（設(shè)計(jì)）的復(fù)印件和磁盤(pán)，允許畢業(yè)論文（設(shè)計(jì)）被查閱和借閱。本人授權(quán)海南師范大學(xué)可以將本畢業(yè)論文（設(shè)計(jì)）的全部或部分內(nèi)容編入有關(guān)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行檢索，可以采用影印、縮印或其他復(fù)印手段保存、匯編畢業(yè)論文。論文（設(shè)計(jì)）作者簽名： 日期： 指 導(dǎo) 教 師 簽 名： 日期： 1目 錄1 引言.41.1 研究背景及意義.41.2 GENUS STEMPHYLIUM 吡喃酮類(lèi)次級(jí)代謝產(chǎn)物成分研究進(jìn)展.41.3 GENUS STEMPHYLIUM 次級(jí)代謝產(chǎn)物抗菌活性研

3、究進(jìn)展.52 實(shí)驗(yàn)部分.52.1 實(shí)驗(yàn)儀器與試劑.52.2 實(shí)驗(yàn)方法.63 結(jié)果.83.1 化合物結(jié)構(gòu)解析.84 抗菌實(shí)驗(yàn).104.1 儀器與方法.105 結(jié)論.12致謝.12參考文獻(xiàn)：.13附錄一 部分化合物核磁譜圖.142一株藥用紅樹(shù)內(nèi)生真菌 Stemphylium sp. 33231 次級(jí)代謝產(chǎn)物及抗菌活性研究作者： 指導(dǎo)教師：（大學(xué) 化學(xué)與化工學(xué)院， ）摘摘 要：要：紅樹(shù)植物處于亞熱帶、熱帶的海陸交界處，因高鹽度的生長(zhǎng)環(huán)境使紅樹(shù)根部長(zhǎng)期處于缺氧狀態(tài)，并長(zhǎng)年受高強(qiáng)光照射。紅樹(shù)植物特殊的生長(zhǎng)環(huán)境，導(dǎo)致其富含能適應(yīng)特殊生存環(huán)境的特殊內(nèi)生微生物。這些微生物能產(chǎn)生結(jié)構(gòu)獨(dú)特、活性顯著的次級(jí)代謝產(chǎn)物

4、，使得藥用紅樹(shù)內(nèi)生真菌成為活性海洋天然產(chǎn)物的重要來(lái)源。尖瓣海蓮（Brguiera sexangula var. rhynchopetala）為海南特有藥用紅樹(shù)，民間常用于治療瘧疾。目前，關(guān)于紅樹(shù)尖瓣海蓮化學(xué)成分研究己有文獻(xiàn)報(bào)道，然而對(duì)其內(nèi)生真菌的分離及生物活性研究尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究首次對(duì)一株紅樹(shù)尖瓣海蓮來(lái)源的內(nèi)生真菌Stemphylium sp. 33231的次級(jí)代謝產(chǎn)物進(jìn)行了分離并對(duì)其抗菌活性做了測(cè)試。通過(guò)柱層析、薄層層析、高效液相等方法，從尖瓣海蓮的一株內(nèi)生真菌 Stemphylium sp. 33231 中共分離得到 3 個(gè)單體化合物。并通過(guò) 1H-NMR, 13C-NMR，MS 等波譜

5、技術(shù)及其理化性質(zhì)對(duì)化合物進(jìn)行了結(jié)構(gòu)鑒定，鑒定分別為：Infectopyrone A 和 B，2-(2 S-hydroxypropyl)-5-methyl-7-hydroxychromone?？咕钚越Y(jié)果表明 Infectopyrone A 和 B 對(duì) 7 種陸地致病菌抑制活性具有選擇性。關(guān)鍵詞關(guān)鍵詞：內(nèi)生真菌；Stemphylium sp.；次級(jí)代謝產(chǎn)物；吡喃酮；抗菌活性Study on Metabolites of Endophytic fungi antibacterial activity Stemphylium sp. 33231 Drived from medicinal mangr

6、oveAuthor:Liang Chunmei Tutor: Professor Chen Guangying(College of Chemistry and Chemical Engineering, Hainan Normal University,Haikou, 571158)Abstract: Mangroves are living in the subtropics and tropics junctions of land and sea. Because of its growth environment with high salinity makes mangrove r

7、oots in hypoxia condition for a long time, and suffers from the strong light irradiation all the year round. Mangroves special growth environment can lead to its be rich in special endophytic microbe to adapt to the special environment. 3These microbes can produce the secondary metabolite with the u

8、nique structure activity significantly and make the medicinal mangroves endophytic fungi becoming a important resource of activity marine endemism products. Brguiera sexangula var. rhynchopetala as the endemic medicinal mangrove are used in treating against malaria among the people. At presently, it

9、 has been appeared in the document reports about the chemical composition of mangrove Brguiera sexangula var. Rhynchopetala. However, they have not been reported in literature about the separation of endophytic fungi. This research is the first, carried the separation out about the secondary metabol

10、ite of Stemphylium sp. 33231 from a mangrove Brguiera sexangula var. Rhynchopetala and made a test about its antimicrobial activity. By column chromatography, thin layer chromatography, high performance liquid and so on, it has separated the three mono compounds from a Stemphylium sp. 33231 of Brgui

11、era sexangula var. Rhynchopetala. And it has also made a structural identification for its chemical compound by spectrum technology ,1H-NMR, 13C-NMR，MS and so on, and its physical and chemical properties. The identifications are Infectopyrone A and B2-(2S-hydroxypropyl)-5-methyl-7-hydroxychromone.Th

12、e result of antibacterial activity shows that Infectopyrone A and B have an inhibitory activity selection to seven kinds of land pathogenic bacterium.Key words: Entophytic Fungus; Stemphylium sp.; Secondary Metabolite; Pyranone ; Antibacterial Activity 本研究已確定的化合物結(jié)構(gòu)：本研究已確定的化合物結(jié)構(gòu)：123OOHOOHOOOOOHOOOOHO

13、OHO41 引言引言1.1 研究背景及意義研究背景及意義紅樹(shù)林分布在熱帶、亞熱帶的海岸潮間帶，是由海洋高等植物中的木本植物組成的群落1。中國(guó)共有紅樹(shù)植物 12 科 15 屬 26 種（含有 1 變種） ，及半紅樹(shù)植物 9 科 10 屬 11 種，其中發(fā)現(xiàn)具有藥用價(jià)值的有 23 種2。民間藥用的紅樹(shù)植物主要有 13 種, 包括海蓮、正紅樹(shù)、紅海欖、木欖、老鼠簕、秋茄、角果木、海漆、小花鼠簕、銀葉樹(shù)、海芒果、黃槿和海桑。其中尖瓣海蓮（Brguiera sexangula var. rhynchopetala）是中國(guó)特有種3僅在海南有分布。我國(guó)民間用海蓮或尖瓣海蓮樹(shù)葉水煮熬汁口服來(lái)治療瘧疾。另外有文

14、獻(xiàn)報(bào)道，海蓮樹(shù)皮的提取物能有效地抑制 2 種腫瘤即肉瘤 180 (sarcoma 180) 和劉易斯肺癌(lewis lung carcinoma) 4；從該屬植物中分離得到的化合物類(lèi)型主要為三萜、二萜、黃酮、硫代化合物和生物堿類(lèi)化合物5-11。然而因?yàn)橘Y源匱乏，不可能無(wú)限地采集紅樹(shù)植物進(jìn)行藥物開(kāi)發(fā)，使其在抗腫瘤藥物的研發(fā)和應(yīng)用中受到限制。因此研究其內(nèi)生微生物的代謝產(chǎn)物來(lái)替代紅樹(shù)的開(kāi)發(fā)具有重要意義。由于周期性的遭受海水浸淹，紅樹(shù)植物及其內(nèi)生微生物為適應(yīng)這一獨(dú)特的生態(tài)環(huán)境，其代謝途徑和生理特性都有著自身的特性12。 本文從一種紅樹(shù)尖瓣海蓮中分離得到一株內(nèi)生真菌 Stemphylium sp. 3

15、3231。匐柄霉屬真菌（Stemphylium）為灰白色絲孢菌的一類(lèi)重要的真菌；能在許多的植物上兼具寄生和腐生的特點(diǎn)；該菌菌落平展，褐色，灰色或者黑色，絨毛狀或者棉絮狀；菌絲體表生或者埋生。目前，已經(jīng)從許多海洋來(lái)源的匐柄霉屬真菌（Stemphylium）中分離獲得了一些結(jié)構(gòu)新穎，活性較好的次級(jí)代謝產(chǎn)物13, 14。1.2 genus Stemphylium 吡喃酮類(lèi)次級(jí)代謝產(chǎn)物成分研究進(jìn)展吡喃酮類(lèi)次級(jí)代謝產(chǎn)物成分研究進(jìn)展匍柄霉屬真菌次級(jí)代謝產(chǎn)物種類(lèi)繁多，其結(jié)構(gòu)類(lèi)型主要包括蒽醌及其二聚體類(lèi)、吡喃酮類(lèi)、二萘嵌苯類(lèi)、內(nèi)酯類(lèi)、甾體類(lèi)等。下面主要介紹一下吡喃酮類(lèi)化合物的研究進(jìn)展。2009年Debbab

16、Abdessamad從匍柄霉屬真菌中分離得到1個(gè)吡喃酮衍生物2H-Pyran-2-one (1)。2003年Ostenfeld Larsen從匍柄霉屬真菌中分離得到1個(gè)吡喃酮5衍生物2,4-Hexadienoic acid (2)。1996 Andersen Brigitte從匍柄霉屬真菌中分離得到1個(gè)吡喃酮衍生物Stemphylone (3)。1964 Grove John Frederic從匍柄霉屬真菌中分離得到3個(gè)吡喃酮衍生物4H,5H-Pyrano (4), 2,4,6-Octatrienoic acid (5) 和2H-Pyran-5-carboxylic acid (6)15。(圖

17、1-2)OOHOOOOOHOOOOCOOHOOOHOOOOOHOOOn-PrOOHOO123456圖 1-21.3 genus Stemphylium 次級(jí)代謝產(chǎn)物抗菌活性研究進(jìn)展次級(jí)代謝產(chǎn)物抗菌活性研究進(jìn)展2012年Abdssamad Debbab等發(fā)現(xiàn)匍柄霉屬真菌代謝產(chǎn)物Alterporriol D對(duì)致病菌Strept. Pneum、MRSA具有抑制作用其IC50均為31.2 g/mL，Alterporriol E對(duì)致病菌Strept. Pneum、Enterc. Faecalis、Enterc. cloacae具有抑制作用其IC50均為31.2 g/mL， Alterporriol N對(duì)

18、致病菌Enterc. Faecalis具有抑制作用其IC50為15.63 g/mL。2 實(shí)驗(yàn)部分實(shí)驗(yàn)部分2.1 實(shí)驗(yàn)儀器與試劑實(shí)驗(yàn)儀器與試劑2.1.1 實(shí)驗(yàn)儀器實(shí)驗(yàn)儀器SPH-111B 標(biāo)準(zhǔn)型大容量恒溫培養(yǎng)振蕩器：Rocking Incubation SPH-111B低分辨質(zhì)譜儀：Finnigan-MAT-95-MS 核磁共振儀：Bruker AV-400MHz (瑞士 Bruker 公司)；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(EYELA)；EYELA COOLACE CA-IIII 冷卻水循環(huán)裝置（日本東京理化有限公司） ；YOKO-ZX 紫外分析暗箱（武漢藥科新技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司） ；64001N 電子天平（上海民

19、橋精密科技儀器有限公司） ；SR5200LH 超聲波清洗器（上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司） ；恒溫水浴鍋 B-220（上海亞榮生化儀器廠） ；PTHW 大型電熱套；大燒瓶及回流裝置（河南豫華儀器有限公司） ；SHB-III 循環(huán)水式多用真空泵（鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司） ；101A-0 型數(shù)顯電熱鼓風(fēng)干燥箱（上海浦東榮豐科學(xué)儀器有限公司） ；Fuhe 800 電動(dòng)離心機(jī)（金壇市富華儀器有限公司） ；色譜柱（各種規(guī)格普通玻璃加壓柱）2.1.2 試劑試劑石油醚（6090）AR廣東西隴化工股份有限公司氯仿AR廣東西隴化工股份有限公司乙酸乙酯AR廣東西隴化工股份有限公司丙酮AR廣東西隴化工股份有限公司甲醇A

20、R廣東西隴化工股份有限公司乙醇食品級(jí)海南?？诠枘z（柱層析用）200-300 目海南師范大學(xué)葡聚糖 LH-20 凝膠Sephadex LH-20Amersham Blosclences 公司薄層色譜板Kieselgel 60 F254 Kieselgel 60RP-18WF254SMerck 公司反相硅膠C-18Merck 公司TLC 顯色劑： 香草醛-濃硫酸顯色劑 2.2 實(shí)驗(yàn)方法實(shí)驗(yàn)方法2.2.1 菌種培養(yǎng)菌種培養(yǎng)菌株 Stemphylium sp.33231 是從一株紅樹(shù)尖瓣海蓮來(lái)源的內(nèi)生真菌（Stemphylium sp. 匍柄霉菌） 。該菌以大米為營(yíng)養(yǎng)物，進(jìn)行大規(guī)模發(fā)酵（35Kg大米分

21、裝于 200 個(gè)在 1L 錐形瓶，接入該菌株，室溫下靜置培養(yǎng)發(fā)酵，29 天后7收集發(fā)酵物，萃取濃縮后獲得乙酸乙酯浸膏） 。圖 2-1 菌株 33231 在 PDA 上的生長(zhǎng)圖，及大米發(fā)酵圖2.2.2 分離純化過(guò)程分離純化過(guò)程對(duì)發(fā)酵濃縮后乙酸乙酯浸膏進(jìn)行硅膠柱層析?？偨嘁?1 : 2 體積拌硅膠（100-200 目）進(jìn)行硅膠柱層析（過(guò)大柱） ，以石油醚（PE）/乙酸乙酯（EA）/甲醇進(jìn)行梯度進(jìn)行洗脫，得到 8 個(gè)組分 Fr. 17。本工作主要對(duì) 20% EA 和 40% EA 洗脫下的部分 Fr. 6 進(jìn)行分離鑒定。 （圖 2-2）乙酸乙酯浸膏減壓硅膠柱層析梯度洗脫EA/PE=5EA/PE=1

22、0%EA/PE=20%EA/PE=40%EA/PE=60%EA/PE=80%EA/PE=100%MO=100%Fr.1Fr.2Fr.3Fr.4Fr.5Fr.6Fr.7Fr.8圖 2-2 乙酸乙酯浸膏粗分8Fr. 6 組分的分離純化過(guò)程總過(guò)程如圖 2-3 所示。圖 2-2 Fr. 6 分離過(guò)程6-1 組分經(jīng) TLC 檢測(cè)后發(fā)現(xiàn)，有一個(gè)主點(diǎn)，用凝膠柱以氯仿甲醇(1 : 1)進(jìn)行洗脫純化，洗脫后得到化合物 3 (4.2 g)。6-2 組分經(jīng) TLC 檢測(cè)后發(fā)現(xiàn)點(diǎn)多量少，選擇放棄。6-3 組分經(jīng)過(guò)硅膠柱洗脫，TLC 檢測(cè)合并相同極性組分得到 6-3-13。其中組分 6-3-1 經(jīng) TLC 檢測(cè)，有一主

23、點(diǎn)，另有部分陰影。嘗試用氯仿/甲醇=1:1 洗脫純化，得到 6-3-1a (1) 8.6 mg。6-3-2 以用氯仿/甲醇=1:1 洗脫純化,得到 6-3-2a（2）9.3 mg。3 結(jié)果結(jié)果3.1 化合物結(jié)構(gòu)解析化合物結(jié)構(gòu)解析通過(guò)1H-NMR 及13C-NMR 等波譜表征以及結(jié)合理化性質(zhì)，對(duì)從 Fr. 6 組分中分離得到的化合物 13 進(jìn)行化學(xué)結(jié)構(gòu)的鑒定?；衔?1 為淡黃色無(wú)定型粉末，溶于甲醇、氯仿，其 TLC 板在紫外燈下顯9火焰狀暗斑。在氫譜中低場(chǎng)存在三個(gè)烯族的氫信號(hào) H 6.88 (1H, br s)，6.70 (1H, br s) 和 5.79 (1H, br s)，高場(chǎng)存在一個(gè)連

24、氧亞甲基信號(hào) H 4.22 (2H, s)，一個(gè)甲氧基信號(hào) H 3.98 (3H, s)和兩個(gè)甲基信號(hào) H 2.09 (3H, s)、2.25 (3H, s)。從碳譜可知含有兩個(gè)甲基，一個(gè)甲氧基，一個(gè)連氧亞甲基，八個(gè)烯碳一個(gè)，一個(gè)酯羰基及一個(gè)羧基碳。從這些數(shù)據(jù)我們可以知道該化合物為吡喃酮類(lèi)化合物。綜合以上氫譜和碳譜數(shù)據(jù)以及理化性質(zhì)，并與文獻(xiàn)16數(shù)據(jù)進(jìn)行對(duì)照，確定化合物 1 為Infectopyrone A表 3-1 化合物 1 與 2 的 NMR 數(shù)據(jù)1 (in DMSO-d6)2 (in CDCl3)positionH (400 MHz)C (100 MHz)H (400 MHz)C (10

25、0 MHz)1-167.1, C-169.8, C25.79, br s121.5, CH5.87, br s119.6, CH3-150.4, C -154.6, C46.88, br s133.9, CH7.13, br s135.6, CH5-129.6, C-128.8, C2-162.7, C-163.8, C3-105.4, C-103.3, C4-167.4, C-168.5, C56.70, br s95.4, CH6.32, br s94.0, CH6-160.2, C-161.5, C74.22, s52.1, CH24.41, s63.1, CH23-Me2.25, br

26、 s18.6, CH32.36, br s19.4, CH35-Me2.09, br s14.0, CH32.13, br s14.2, CH34-OMe3.98, s57.0, CH34.01, s56.7, CH37-OMe-3.43, s58.4, CH3化合物 2 為淡黃色無(wú)定型粉末，溶于甲醇、氯仿，其 TLC 板在 254nm 的紫外燈下顯暗斑。在氫譜中低場(chǎng)存在三個(gè)烯族的氫信號(hào) H 7.13 (1H, br s)，6.30 (1H, br s) 和 5.87 (1H, br s)，高場(chǎng)存在一個(gè)連氧亞甲基信號(hào) H 4.41 (2H, s)，兩個(gè)個(gè)甲氧基信號(hào) H 4.01 (3H, s)

27、、H 3.43 (3H, s)和兩個(gè)甲基信號(hào) H 2.13 (3H, s)、2.36 (3H, s)。從碳譜可知含有兩個(gè)甲基，兩個(gè)甲氧基，一個(gè)連氧亞甲基，八個(gè)烯碳一個(gè)，一個(gè)酯羰基及一個(gè)羧基碳。從這些數(shù)據(jù)我們可以知道該化合物為吡喃酮類(lèi)化合物。綜合以上氫譜和碳譜數(shù)據(jù)以及理化性質(zhì)，并與文獻(xiàn)16數(shù)據(jù)進(jìn)行對(duì)照，確定化合物 1 為 Infectopyrone A10化合物 3 為針狀晶體，溶于乙酸乙酯、甲醇，在 254 紫外燈下顯暗斑。在1H NMR 譜圖中，一對(duì)間位耦合質(zhì)子氫信號(hào) H 6.62 (1H, d, J = 2.4Hz)和 H 6.60 (1H, d, J = 2.4Hz)，一個(gè)烯氫氫信號(hào) H

28、 5.96(1H, s)，一個(gè)亞甲基信號(hào) H 2.57 (2H, m)，一個(gè)連氧次甲基信號(hào) H 4.02 (1H, m)和兩個(gè)甲基信號(hào) H 2.65(1H, s)， H 1.14 (1H, d, J = 6.4Hz)。13C-NMR 譜圖中共有 13 個(gè)碳信號(hào)包括 1 個(gè)羰基碳信號(hào)，8 個(gè)芳香碳信號(hào)，一個(gè)連氧次甲基信號(hào)，一個(gè)亞甲基信號(hào)和兩個(gè)甲基信號(hào)?；谝陨戏治觯摶衔锟赡転樵?lèi)化合物。綜合分析譜圖數(shù)據(jù)和理化性質(zhì)，發(fā)現(xiàn)文獻(xiàn)該化合物與報(bào)道的17 2-(2S-hydroxypropyl)-5-methyl-7-hydroxychromone 數(shù)據(jù)基本一致，因此化合物鑒定為 2-(2S-hyd

29、roxypropyl)-5-methyl-7-hydroxychro mone。表 3-3 化合物 3 的 NMR 數(shù)據(jù)化合物( DMSO-d6)文獻(xiàn)值 (Acetone-d6)position1H13C1H13C2164.7164.635.96, s114.45.96, s111.94178.2178.55141.4142.266.60, dd (2.4, 0.8)116.56.60, dd (2.4, 0.8)116.37160.9160.786.62, d (2.4)114.46.62, d (2.4)110.792.57, m42.82.57, m43.3104.02, m64.04.

30、02, m64.0111.14, d (6.4)23.41.14, d (6.4)22.9122.65, br s22.42.65, br s21.94a111.5115.38a159.2159.74 抗菌實(shí)驗(yàn)抗菌實(shí)驗(yàn)4.1 儀器與方法儀器與方法4.1.1 致病菌致病菌株株將 7 株陸地致病菌（菌種保存于海南師范大學(xué)省部共建-熱帶藥用植物化學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室）用于實(shí)驗(yàn)，7 株陸地致病菌包括：白色葡萄球菌 11(Staphylococcus albus)、大腸桿菌 (Escherichia coli)、枯草芽孢桿菌 (Bacillus subtilis)、金黃色葡萄球菌(Staphylococc

31、us aureus)、四聯(lián)球菌 (Micrococcus tetragenus)、藤黃八疊球菌 (Micrococcus luteus)和蠟狀芽孢桿菌 (Bacillus cereus)。4.1. 2 測(cè)試測(cè)試對(duì)象對(duì)象化合物 13。4.1. 3 儀器儀器移液器、250mL 錐形瓶、酒精燈、96 孔微量稀釋板、超凈工作臺(tái)、接種針、酶標(biāo)儀(ELx800)、高溫滅菌鍋、電子天平、恒溫振蕩器、恒溫培養(yǎng)箱。4. 1.4 細(xì)菌培養(yǎng)基細(xì)菌培養(yǎng)基采用 LB 培養(yǎng)基：胰蛋白胨 10g/L，酵母提取物 5g/L，氯化鈉 10g/L，蒸餾水。4.1.5 實(shí)驗(yàn)方法實(shí)驗(yàn)方法采用微量稀釋法，該方法常用于測(cè)定致病菌對(duì)敏感性

32、藥物或新藥對(duì)細(xì)菌的抑制活性試驗(yàn)。一般使用 96 孔微量稀釋板，其孔底呈 U 型，每孔容量0.200.30 mL 本法操作較方便，且培養(yǎng)基用量少，可用于大批量藥敏試驗(yàn)。一般用 MH 培養(yǎng)基，將已配制好的藥液在試管中作二倍濃度遞減稀釋?zhuān)謩e裝于96 孔板內(nèi)或者用微量加液器直接在板孔內(nèi)作二倍稀釋?zhuān)缓笤俳臃N稀釋菌液，另外需留出一列孔作為藥液對(duì)照，該孔列僅加培養(yǎng)基和菌液作為菌對(duì)照，試驗(yàn)完畢后，用微量攪拌器震蕩混勻，再將 96 孔板置于 37 培養(yǎng)箱中溫孵 1822 h，用酶標(biāo)儀測(cè) 630 nm 下吸光度。4.1.6 操作步驟操作步驟(1)致病菌株的準(zhǔn)備 將活化好的 7 株致病菌分別接種于以滅菌處理過(guò)的

33、 LB 培養(yǎng)基中，再將其放置于恒溫振蕩器中 37oC 震蕩培養(yǎng) 612 h。(2)化合物的初篩將培養(yǎng)好的致病菌用培養(yǎng)液進(jìn)行稀釋?zhuān)♂尪葹?1: 500-1:1000；將稀釋后的含菌培養(yǎng)液分別定量加至 96 孔板的各個(gè)孔中；將樣品配制成 1mg/mL,分別取定量加至各個(gè)孔中。加完后置于恒溫培養(yǎng)箱中 37oC 恒溫培養(yǎng)，而后用酶標(biāo)儀在12630nm 下測(cè)各孔吸光度。(3) 最小抑菌濃度的測(cè)試 將培養(yǎng)好的致病菌用培養(yǎng)液進(jìn)行稀釋?zhuān)♂尪葹?1: 5001:1000；將稀釋后的含菌培養(yǎng)液分別定量加至 96 孔板的第一排各孔中，讓后一次向下成倍稀釋?zhuān)蝗缓髮⒏鳂悠贩謩e加入至各列孔中。加完后置于恒溫培養(yǎng)箱中

34、37oC 恒溫培養(yǎng)，而后用酶標(biāo)儀在 630nm 下測(cè)各孔吸光度。4.1.7 實(shí)驗(yàn)結(jié)果實(shí)驗(yàn)結(jié)果MIC (g mL-1)CompoundS. albusE. coliB. subtilisM. tetragenusM. luteus15.0 2.5 10.0 10.0 10.0 210.0 2.5 20.010.0 10.0 320.020.020.020.020.0Ciprofloxacin1 0.6 0.3 0.6 0.3 0.3 5 結(jié)論結(jié)論本研究對(duì)一種尖瓣海蓮內(nèi)生真菌 33231 的發(fā)酵物進(jìn)行了分離純化以及結(jié)構(gòu)鑒定。首先通過(guò)乙酸乙酯浸提得到粗提物浸膏，將浸膏進(jìn)行柱層析，對(duì) 60%乙酸乙酯洗

35、脫下的部分進(jìn)行了進(jìn)一步的細(xì)分，主要采用硅膠柱層析法和凝膠柱層析法、高效液相法進(jìn)行了分離純化得到 3 個(gè)單體化合物，最后通過(guò)現(xiàn)代波譜學(xué)方法對(duì)所得化合物進(jìn)行了結(jié)構(gòu)鑒定。對(duì)所得化合物進(jìn)行抗腫瘤活性研究，結(jié)果表明：化合物 1，2 顯示具有較好的抗菌活性化合物 1 和 2 對(duì) E. coli 的抑制活性達(dá)到了 2.5 gmL-1。致謝致謝在論文完成過(guò)程中，我的內(nèi)心很感恩，特此我要誠(chéng)心的感謝所有幫助我，支持我的老師，同學(xué)和學(xué)長(zhǎng)。首先，我要感謝的是我的指導(dǎo)教授，我的論文是在教授的指導(dǎo)教導(dǎo)下完成的。陳老師嚴(yán)謹(jǐn)?shù)墓ぷ鲬B(tài)度給我留下了深刻的印象，使我受益匪淺。我衷心感謝我們實(shí)驗(yàn)室的學(xué)長(zhǎng)在專(zhuān)業(yè)知識(shí)和實(shí)驗(yàn)技術(shù)上給予我的

36、一一指導(dǎo)和幫助，感謝學(xué)長(zhǎng)給我提供了撰寫(xiě)論文的各種素材，修正我的論文，給我的論文進(jìn)行排13版，我的論文的完成離不開(kāi)學(xué)長(zhǎng)的幫助，在這里請(qǐng)接受我真誠(chéng)的謝意。我還要感謝我的畢業(yè)小組的成員，謝謝在平時(shí)做實(shí)驗(yàn)的過(guò)程中對(duì)我的各方面的幫組和支持。14參考文獻(xiàn)：參考文獻(xiàn)：1 林鵬, 傅勤. 中國(guó)紅樹(shù)林環(huán)境生態(tài)及經(jīng)濟(jì)利用M, 北京: 高等教育出版社,1995: 159.2 林鵬. 中國(guó)紅樹(shù)林生態(tài)系M, 北京：科學(xué)出版社 1997: 4752.3 王伯蓀, 梁士楚, 張煒銀, 等. 世界紅樹(shù)植物區(qū)系J. Acta. Bot. Sin. 2003: 644653.4 Kokpol U., Chemistry of n

37、atural products from mangrove plants, UNDP / UNESCO, Training course on life history of selected species of flora and fauna in mangrove ecosystem J. Thailand 1985: 159169.5 Laphookhieo S., Karalai C., Ponglimanont C., et al. Pentacyclic triterpenoid esters from the fruits of Bruguiera cylindrical J.

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39、opetala J. Helv. Chim. Acta. 2005: 321354.8 Subrahmanyan C., Rao B. V., Ward R. S., et al. Diterpenes from the marine mangrove Bruguiera gymnorhiza J. Phytochemistry 1999: 8390.9 Han L., Huang X., Sattler I., et al. New diterpenoids from the marine mangrove Bruguiera gymnorrhiza J. J. Nat. Prod. 2004, (67): 1620162310 Kato A., Takahashi J. A new naturally occurring 1,2-dithiolane from Bruguiera cylindrical J. Phytochemistry 1976 (15): 22022111 Kato A. Brugine from Bruguiera cylindrical J. Phytochemistry 1975 (14): 56