第十三章DNA芯片技術

1、第十三章第十三章 DNA芯片技術芯片技術第一節(jié)第一節(jié) 概概 述述一、一、DNA芯片技術的概念芯片技術的概念基因芯片基因芯片( (Gene chip)Gene chip)技術是指通過技術是指通過微陣微陣列列( (MicroarrayMicroarray) )技術將高密度技術將高密度DNADNA片段片段陣列通過高速機器人或原位合成方式以陣列通過高速機器人或原位合成方式以一定的順序或排列方式使其附著在如玻一定的順序或排列方式使其附著在如玻璃片等固相表面，以熒光標記的璃片等固相表面，以熒光標記的DNADNA探探針，借助堿基互補雜交原理，進行大量針，借助堿基互補雜交原理，進行大量的基因表達及監(jiān)測等方面研

2、究的最新革的基因表達及監(jiān)測等方面研究的最新革命性技術。命性技術。DNA Chip TechnologySolid support (glass, plastic, metal, silicon)Miniaturized array of DNA (genetic material)Work on the biochemical principle of DNA/DNA hybridizationHybridized probes (DNA molecules) are fluorescently labeled通常用計算機硅芯片作為固相支持物，所通常用計算機硅芯片作為固相支持物，所以稱為以稱為

3、DNA芯片芯片 。DNA芯片為生物芯片的一種：芯片為生物芯片的一種：生物芯片包括：生物芯片包括：DNA芯片芯片蛋白質芯片蛋白質芯片其它芯片其它芯片按用途分按用途分 樣品制備芯片樣品制備芯片 生化反應芯片生化反應芯片 檢測芯片檢測芯片芯片實驗室是生物芯片技術發(fā)展的芯片實驗室是生物芯片技術發(fā)展的最終目標最終目標二、二、DNA芯片的主要類型芯片的主要類型按制備方式分：按制備方式分：原位合成芯片原位合成芯片：采用顯微光蝕刻等技術：采用顯微光蝕刻等技術在特定部位原位合成寡核苷酸而制備在特定部位原位合成寡核苷酸而制備的芯片。的芯片。探針較短探針較短DNA微集陣列微集陣列：將預先制備的：將預先制備的DNA片

4、片段以顯微打印的方式有序地固化于支段以顯微打印的方式有序地固化于支持物表面而制成的芯片。持物表面而制成的芯片。探針的來源探針的來源較靈活較靈活Comparison of DNA Chip Technologies Sensitivity of DNA chip based assays is a function of: Probe and target DNA/RNA (Complexity) Chip surface (autofluorescence & non-spec. bkg) Attachment chemistry/methodology (hyb. efficienc

5、y & crosshyb.) Hybridization efficiency (lots of factors) Detection technology (signal type, efficiency, noise)第二節(jié)第二節(jié) DNA芯片技術的芯片技術的基本原理與方法基本原理與方法一、芯片的制備一、芯片的制備 （一）支持物的預處理（一）支持物的預處理實性材料實性材料：硅芯片、玻片和瓷片：硅芯片、玻片和瓷片需進行預處理，使其表面衍生出羥基、需進行預處理，使其表面衍生出羥基、氨基活性基團。氨基活性基團。膜性材料膜性材料：聚丙烯膜、尼龍膜、硝酸纖維：聚丙烯膜、尼龍膜、硝酸纖維膜膜通常

6、包被氨基硅烷或多聚賴氨酸通常包被氨基硅烷或多聚賴氨酸（二）原位合成芯片的制備（二）原位合成芯片的制備1.顯微光蝕刻技術顯微光蝕刻技術支持物表面活性基團連接有光敏保護基團支持物表面活性基團連接有光敏保護基團（X）受到保護。受到保護。產(chǎn)率較低產(chǎn)率較低 原位合成原位合成(In Situ Synthesis)Light directed oligonucleotide synthesis.A s o l i d s u p p o r t i s derivatized with a covalent linker molecule terminated w i t h a p h o t o l a

7、 b i l e protecting group. Light is directed through a mask to deprotect and activate s e l e c t e d s i t e s , a n d protected nucleotides couple to the activated sites. The process is repeated, activating different sets of sites and coupling different bases allowing arbitrary DNA probes to be co

8、nstructed at each site.2.壓電打印法壓電打印法 壓電毛細管噴射器壓電毛細管噴射器產(chǎn)率較高產(chǎn)率較高噴墨打印技術噴墨打印技術（三）（三）DNA微集陣列的制備微集陣列的制備方式方式：預先合成：預先合成DNA或制備基因探針然后或制備基因探針然后打印到芯片上打印到芯片上1.探針的制備探針的制備已克隆的基因片段已克隆的基因片段PCR，RT-PCR擴增的基因片段擴增的基因片段人工合成的人工合成的DNA片段片段單鏈、雙鏈、單鏈、雙鏈、DNA或或RNA 均可作為探針均可作為探針2. 打印打印噴墨打?。ǚ墙佑|式點樣）噴墨打?。ǚ墙佑|式點樣）優(yōu)點、缺點優(yōu)點、缺點針式打?。ń佑|式點樣）針式打印

9、（接觸式點樣）優(yōu)點、缺點優(yōu)點、缺點針式打印法（接觸式點樣）針式打印法（接觸式點樣）3. 探針的固化探針的固化打印探針后，需要將其固定在支持物表打印探針后，需要將其固定在支持物表面，同時也要封閉支持物上未打印區(qū)面，同時也要封閉支持物上未打印區(qū)域以防止核酸樣品的非特異性固定域以防止核酸樣品的非特異性固定二、樣品的準備二、樣品的準備樣品的分離純化樣品的分離純化DNA , mRNA擴增擴增PCR, RTPCR，固相固相PCR標記等過程標記等過程熒光標記（常用熒光標記（常用Cy3、Cy5），），生物素、放射生物素、放射性標記性標記三、分子雜交三、分子雜交樣品與樣品與DNA芯片上的探針陣列進行雜交。芯片上

10、的探針陣列進行雜交。與經(jīng)典分子雜交的區(qū)別：與經(jīng)典分子雜交的區(qū)別：1. 雜交時間短，雜交時間短，30分鐘內(nèi)完成分鐘內(nèi)完成2. 可同時平行檢測許多基因序列可同時平行檢測許多基因序列1.影響雜交反應的因素：影響雜交反應的因素：1. 鹽濃度、溫度、反應時間、鹽濃度、溫度、反應時間、DNA二二級結構級結構肽肽核酸核酸( peptide nucleic acid , PNA)是一類以氨基酸替代糖是一類以氨基酸替代糖-磷酸主鏈的磷酸主鏈的DNA類似物，骨架由重復的類似物，骨架由重復的N-甘氨酸甘氨酸通過酰胺鍵相連構成，堿基則通過甲通過酰胺鍵相連構成，堿基則通過甲叉碳?；c骨架相連。叉碳?；c骨架相連。1.

11、PNA分子內(nèi)不會形成二級、三級結構分子內(nèi)不會形成二級、三級結構2. DNA與與PNA雜交不需要鹽離子雜交不需要鹽離子四、檢測分析四、檢測分析1.激光激發(fā)使含熒光標記的激光激發(fā)使含熒光標記的DNA片段發(fā)片段發(fā)射熒光射熒光2.激光掃描儀或激光共聚焦顯微鏡采集激光掃描儀或激光共聚焦顯微鏡采集各雜交點的信號各雜交點的信號3.軟件進行進行圖象分析和數(shù)據(jù)處理軟件進行進行圖象分析和數(shù)據(jù)處理 Research UseFrom Sequence to function計算Ratio 值 (= Cy3/Cy5)。在 0.5-2.0 之外的定義為在兩樣本中有明顯差異表達。進而獲取初步功能信息。Clustering。

12、第三節(jié)第三節(jié) DNA芯片技術的應用芯片技術的應用DNA測序測序；雜交測序（；雜交測序（SBH）基因表達分析基因表達分析：基因組研究基因組研究：作圖、測序、基因鑒定、基：作圖、測序、基因鑒定、基因功能分析因功能分析基因診斷基因診斷：尋找和檢測與疾病相關的基因：尋找和檢測與疾病相關的基因及在及在RNA水平上檢測致病基因的表達水平上檢測致病基因的表達藥物研究與開發(fā)藥物研究與開發(fā)：cDNA microarray expression patterns of small (S) and large (L) neurons 應用之一應用之一 基因表達譜（基因表達譜（gene expression patt

13、ern)紅色紅色 上調(diào)上調(diào)黃色黃色 不變不變綠色綠色 下調(diào)下調(diào)基因表達譜芯片基因表達譜芯片的應用最為廣泛，技的應用最為廣泛，技術上也最成熟。這種芯片可以檢測整個術上也最成熟。這種芯片可以檢測整個基因組范圍的眾多基因在基因組范圍的眾多基因在mRNA表達水表達水平的變化。它能對來源于不同個體、不平的變化。它能對來源于不同個體、不同組織、不同細胞周期、不同發(fā)育階段、同組織、不同細胞周期、不同發(fā)育階段、不同分化階段、不同生理病理、不同刺不同分化階段、不同生理病理、不同刺激條件下的組織細胞內(nèi)基因表達情況進激條件下的組織細胞內(nèi)基因表達情況進行對比分析。從而對基因群在個體特異行對比分析。從而對基因群在個體特異性、組織特異性、發(fā)育特異性、分化特性、組織特異性、發(fā)育特異性、分化特異性、疾病特異性、刺激特異性的變化異性、疾病特異性、刺激特異性的變化特征和規(guī)律進行描述，特征和規(guī)律進行描述，進一步闡明基因的相互協(xié)同、抑制、互進一步闡明基因的相互協(xié)同、抑制、互為因果等關系。有助于理解基因及其編為因果等關系。有助于理解基因及其編碼的蛋白質的生物學功能，并從已知生碼的蛋白質的生物學功能，并從已知生物學功能的基因推論未報道基因的生物物學功能的基因推論未報道基因的生物學意義。同時，還可在基因水平上解釋學意義。同時