免疫學(xué)檢驗(yàn)室內(nèi)質(zhì)量控制操作程序-檢驗(yàn)科免疫室作業(yè)指導(dǎo)書(shū)

1、實(shí)用】檢驗(yàn)科 SOP 文件免疫學(xué)檢驗(yàn)室內(nèi)質(zhì)量控制操作程序1. 目的：保證 ELISA檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確可靠 ,充分發(fā)揮其方法學(xué)的優(yōu)點(diǎn)。2. 該 SOP變動(dòng)程序：本標(biāo)準(zhǔn)操作程序的變動(dòng)，可由任一使用本 SOP 的工作人員提出，并報(bào)經(jīng)下述人員批準(zhǔn)簽字：專(zhuān)業(yè)主管、科主任。3. 方法3.1分析前質(zhì)控3.1.1人員培訓(xùn)實(shí)驗(yàn)是人操作的， 因此檢驗(yàn)人員需經(jīng)過(guò)培訓(xùn)， 熟練掌握本專(zhuān)業(yè)如下 幾方面的技術(shù)知識(shí)：檢驗(yàn)項(xiàng)目的基本原理（ ELISA原理）；臨床意義；熟悉檢測(cè)技巧，了解易出差錯(cuò)的環(huán)節(jié)及難點(diǎn)； 熟悉檢測(cè)試劑性能（包括試劑盒組成，包被片段及其組成） ； 熟悉檢測(cè)儀器的原理及性能；掌握數(shù)據(jù)處理的能力和質(zhì)量控制知 識(shí)。某些

2、特殊項(xiàng)目檢測(cè)如抗 HIV 等需經(jīng)有關(guān)部門(mén)組織的專(zhuān)門(mén)培訓(xùn)班， 考 試合格后持證上崗。3.1.2.室內(nèi)質(zhì)控血清的制備：質(zhì)控血清每年列出計(jì)劃報(bào)質(zhì)控組采購(gòu)， 一般采用 CutOff 值附近的陽(yáng) 性值；質(zhì)控血清 -20凍存?zhèn)溆茫皇褂们笆覝貜?fù)融。3.1.3試劑盒選擇衛(wèi)生部規(guī)定乙肝試劑，丙肝試劑，艾滋病試劑，梅毒試劑及血型試 劑必須使用經(jīng)衛(wèi)生部生物制品檢定所檢定合格， 并貼有防偽標(biāo)簽的產(chǎn) 品。試劑盒評(píng)價(jià)：根據(jù)該試劑生物制品鑒定所的批批檢定報(bào)告， 了解其質(zhì)量水平， 按 照質(zhì)量計(jì)劃選擇靈敏度高的或特異性高的試劑；通過(guò)詢問(wèn)試劑包被物的組成， 如原料來(lái)源 （基因工程或合成多肽） ， 片段的組合（按比例混合或化學(xué)合成

3、） ，片段的長(zhǎng)短等判斷試劑的優(yōu) 劣；參考室間質(zhì)評(píng)報(bào)告中對(duì)試劑的評(píng)價(jià)結(jié)果，了解不同試劑的質(zhì)控成 績(jī)。根據(jù)權(quán)威部門(mén)發(fā)布的試劑評(píng)價(jià)結(jié)果，了解市場(chǎng)上試劑的質(zhì)量?jī)?yōu)劣。3.1.4儀器質(zhì)控為使儀器保持最佳工作狀態(tài)應(yīng)建立維護(hù)和校正儀器的標(biāo)準(zhǔn)操作程 序（ SOP），所要控制的儀器包括移液器（加樣槍?zhuān)?，水浴箱（溫箱）， 洗板機(jī)和酶標(biāo)儀。移液器： ELISA加樣量?。?5-100l），其準(zhǔn)確性直接影響實(shí)驗(yàn)結(jié) 果，利用稱(chēng)重法檢查：吸取刻度指示量的水，萬(wàn)分之一天平稱(chēng)重后計(jì) 算吸量是否準(zhǔn)確，一般應(yīng)在 ±10%以內(nèi)；水浴箱： 經(jīng)常檢查水浴箱溫度計(jì)所示的溫度和水中（或溫箱內(nèi)）實(shí) 測(cè)溫度是否一致，允許有 ±

4、;1的誤差；洗板機(jī)：每個(gè)廠家設(shè)置洗板后的殘留液有各自的規(guī)定一般不超過(guò)2ul，人工扣板時(shí)，墊紙不濕，定期檢查管孔是否堵塞；酶標(biāo)儀：經(jīng)常維護(hù)其光學(xué)部分，防止濾光片霉變，定期檢測(cè)校正， 使其保持良好的工作性能。酶標(biāo)儀的主要性能指標(biāo)有：測(cè)讀速度、讀 數(shù)的準(zhǔn)確性、重復(fù)性、精確度和可測(cè)范圍、線性等等。優(yōu)良的酶標(biāo)儀 的讀數(shù)一般可精確到 0.001，準(zhǔn)確性為 ±1%，重復(fù)性達(dá) 0.5%。酶標(biāo)儀校正程序：a）濾光片波長(zhǎng)精度檢查：將不同波長(zhǎng)的濾光片從酶標(biāo)儀上卸下，用 UV-2201型紫外 -可見(jiàn)分光光度計(jì) （波長(zhǎng)精度 ± 0.3nm）于可見(jiàn)光區(qū)對(duì)每 個(gè)濾光片進(jìn)行掃描， 其檢測(cè)值與標(biāo)定值之差為濾

5、光片波長(zhǎng)精度。 一般 酶標(biāo)儀無(wú) 585nm 濾光片，可選用 550nm 或 630nm濾光片。450nm 濾 光片的檢定選用普魯蘭溶液（校正波長(zhǎng)為 630nm）。b）通道差與孔間差檢測(cè)：通道差檢測(cè)是取一只酶標(biāo)板小孔杯（杯底 須光滑，透明，無(wú)污染以酶標(biāo)板架作載體，將其（內(nèi)含 200ul 甲基橙 溶液吸光度調(diào)至 0.500A 左右）置于 8 個(gè)通道的相應(yīng)位置，蒸溜水調(diào) 零，于 490nm 處連續(xù)測(cè)三次 ,觀察其不同通道的檢測(cè)器測(cè)量結(jié)果的一 致性，可用極差值來(lái)表示。 孔間差的測(cè)量是選擇同一廠家，同一批號(hào) 酶標(biāo) 2 板條（8 條共 96 孔）分別加入 200ul 甲基橙溶液 （吸光度調(diào)至 0.100A

6、左右）先后置于同一通道，蒸溜水調(diào)零 ,于 490nm 處檢測(cè)，其 誤差大小用 ±1.96s衡量。c）零點(diǎn)飄移（穩(wěn)定性觀察） ：取 8 只小孔杯分別置于 8 個(gè)通道的相 應(yīng)位置，均加入 200ul 蒸餾水并調(diào)零，于 490nm處每隔 30 分鐘測(cè)一 次，觀察各個(gè)通道 4 小時(shí)內(nèi)吸光度的變化。d）精密度評(píng)價(jià)：每個(gè)通道 3 只小杯分別加入 200ul 高中低 3 種不同 濃度的甲基橙溶解，蒸餾水調(diào)零，于 490nm 作雙份平行測(cè)定，每日 測(cè)二次（上下午各一次） ，連續(xù)測(cè)定 20 天。分別計(jì)算其批內(nèi)精密度， 日內(nèi)批精密度 ,日間精密度和總精密度及相應(yīng)的 CV值。e）線性測(cè)定：用電子天平精確稱(chēng)

7、取甲基橙配制 5 個(gè)系列的溶液，于 490nm平行測(cè) 8次，取其均值。計(jì)算其回歸方程， 相關(guān)系數(shù)及標(biāo)準(zhǔn)估 計(jì)誤差 s，并用 ±1.96s表示樣品測(cè)量的誤差范圍 .雙波長(zhǎng)測(cè)定評(píng)價(jià)：取 一分甲基橙溶液，分別加入 3 種不同濃度的溶血液（測(cè)定波長(zhǎng)為 490nm，校正波長(zhǎng)為 585nm），先后于 8 個(gè)通道檢測(cè)，每個(gè)通道測(cè) 3 次，比較各組之間是否具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異， 以考察雙波長(zhǎng)消除干擾組分 的效果。3.1.5標(biāo)本的采集和保存標(biāo)本采集時(shí)應(yīng)盡量避免溶血， 因紅細(xì)胞破裂可釋放過(guò)氧化物酶活 性物質(zhì)干擾立可讀方法的結(jié)果，以 HRP為標(biāo)記的 ELISA測(cè)定中，溶血 標(biāo)本會(huì)增加非特異性顯色造成假陽(yáng)性。長(zhǎng)菌

8、的標(biāo)本同樣的道理也易產(chǎn)生假陽(yáng)性， 因菌體中可能含有內(nèi)源 性 HRP也會(huì)產(chǎn)生假陽(yáng)性反應(yīng)?？鼓煌耆臉?biāo)本因纖維蛋白原的干擾而造成假陽(yáng)性， 建議盡量 不用抗凝血尤其是不使用用肝素抗凝劑。標(biāo)本在冰箱中保存時(shí)間過(guò)長(zhǎng)易導(dǎo)致血清 IgG 聚合，使間接法的試 劑本底加深，一般血清置 4冰箱 5 天內(nèi)完成測(cè)試。如需保存一周以 上則要 -20冰凍保存，凍結(jié)血清融解后，蛋白質(zhì)局部濃縮，分布不 均，融解時(shí)應(yīng)上下顛倒充分混勻，同時(shí)避免氣泡?？缮舷骂嵉够旌?， 不要在混勻器上強(qiáng)烈振蕩。 反復(fù)凍融會(huì)使抗體效價(jià)跌落， 如需保存作 多次檢測(cè)，宜少量分裝冰存。ELISA的靈敏度 >1ng/ml 水平上 ,標(biāo)本間的污染要盡量

9、避免，尤其 不應(yīng)與生化試驗(yàn)用同一管標(biāo)本。3.2 分析中質(zhì)控ELISA實(shí)驗(yàn)的結(jié)果受操作影響很大，每個(gè)步驟包括加樣，溫育，洗 滌，顯色，酶標(biāo)儀讀數(shù)均應(yīng)認(rèn)真負(fù)責(zé)才能充分發(fā)揮 ELISA的高靈敏， 強(qiáng)特異的優(yōu)點(diǎn)。因此 ,應(yīng)建立實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目的標(biāo)準(zhǔn)操作程序 （SOP。）3.2.1加樣 加樣應(yīng)用微量移液器（加樣槍?zhuān)┌匆?guī)定的量加入微孔板底部，避 免加在孔壁上部，不可濺出，不可產(chǎn)生氣泡。每次加樣應(yīng)更換吸嘴，做到一人一吸頭，以免發(fā)生交叉污染；干吸 頭預(yù)先在血清中抽吸三次。樣本稀釋?zhuān)?目的是為了減少非特異性反應(yīng)， 所以一定要先加稀釋液 后加樣本，特別注意加樣后要在微量振蕩器上振蕩 30 秒鐘，同時(shí)注 意防止液體溢出。如

10、后面操作步驟中加二種以上試劑時(shí)均需振蕩混 勻。如用滴瓶滴加試劑應(yīng)先將滴瓶搖勻并擠去第一滴有氣泡的試劑后 加樣。3.2.2溫育抗原抗體反應(yīng)需要在一定溫度下（ 37°C），經(jīng)過(guò)一定的時(shí)間才能達(dá) 到反應(yīng)的平衡點(diǎn)， ELISA邊緣效應(yīng)是由溫育形成的。所以溫育一般采 用能使反應(yīng)液溫度迅速達(dá)到平衡的水浴法。水要浸至板條的 1/3 處。反應(yīng)板不宜疊放， 注意溫育的溫度和時(shí)間應(yīng)按規(guī)定控制， 一個(gè)人 操作時(shí)，一次不宜多于兩塊板同時(shí)測(cè)定。3.2.3洗滌手工洗滌一般采用浸泡方法： 1）甩去孔內(nèi)反應(yīng)液； 2）用洗滌液 過(guò)洗一遍（即注滿孔后即甩去） ；3）微孔重新注滿洗液后浸泡 2-3 分 鐘，間歇搖動(dòng)； 4

11、）甩去孔內(nèi)液體，拍板，用紙吸干。重復(fù)以上操作 至少 5 次。注意各種試劑盒的洗滌液盡量不要混用。洗板機(jī)洗板一定要預(yù)先把板架放平， 使洗板機(jī)上的每個(gè)放液和吸液 纖孔都能一致地插入孔底， 將孔內(nèi)液體全部吸干， 同時(shí)要設(shè)置一定的 浸泡時(shí)間。如出現(xiàn)機(jī)洗后拍板有較多殘留液時(shí)應(yīng)再用手工洗 2 次以 上。關(guān)機(jī)前要用蒸溜水沖洗管道，避免堵孔。3.2.4顯色HRP催化底物的一步呈色反應(yīng)， 同樣需要一定的時(shí)間和溫度， 一定 要按照說(shuō)明書(shū)規(guī)定的時(shí)間溫度（一般為 37°C，10-15 分鐘）恒定反應(yīng) 后終止；或根據(jù)臨界值質(zhì)控血清吸光度值達(dá) 0.2 左右使的時(shí)間而恒定反應(yīng)時(shí) 間。3.2.5酶標(biāo)儀判讀結(jié)果a）顯

12、色反應(yīng)終止后應(yīng)立刻比色（ 30 分鐘內(nèi)）。b）常見(jiàn)的顯色系統(tǒng)有 OPD和 TMB 二種，以后者最為常見(jiàn)，而 TMB 酸不易終止因此必須盡快比色以免影響結(jié)果。 OPD終止后顯棕色， 測(cè) 定波長(zhǎng)為 490nm；TMB 終止后顯黃色，測(cè)定波長(zhǎng)為 450nm，二種底 物的校正波長(zhǎng)均用 630nm。c）使用雙波長(zhǎng)的優(yōu)點(diǎn)可以消除反應(yīng)板條上的劃痕手印的干擾。同時(shí)要注意反應(yīng)板應(yīng)用紙吸干后才能置酶標(biāo)儀中比色， 否則吸光度易出現(xiàn) 負(fù)值或損壞濾光片。3.3 分析后質(zhì)控3.3.1報(bào)告方式定性試驗(yàn)：國(guó)內(nèi)外為便于統(tǒng)一計(jì)算，一律按 S/COV方式報(bào)告， S 為 標(biāo)本 A 值， COV即 CutOff 值（或 COV）夾心法

13、和間接法以 S/COV1為陽(yáng)性；競(jìng)爭(zhēng)法與中和法以 S/COV 1為陽(yáng)性COV的計(jì)算公式以試劑盒說(shuō)明書(shū)的為準(zhǔn)常見(jiàn)的有：a）COV=2.1 ×（N當(dāng) N 不足 0.05 時(shí)按 0.05 計(jì)），此公式由 P/N>2.1換 算而來(lái)，常用于夾心法。b）COV=0.5 ×，N從抑止率公式換算而來(lái)，常用于競(jìng)爭(zhēng)，中和法。c）COV=N+C（C為常數(shù)），用于間接法。d）COV=C×P+（NC為常數(shù)），用于間接法。此公式最客觀，但對(duì)廠家 要求很高，陰陽(yáng)性對(duì)照測(cè)定值要基本恒定。定量分析：嚴(yán)禁用定性試劑盒做定量分析。用已知量的系列標(biāo)準(zhǔn)品， 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線， 結(jié)果以絕對(duì)量或單位表 示。

14、 ELISA的標(biāo)準(zhǔn)曲線每次都要和待測(cè)標(biāo)本做在同一塊板上?，F(xiàn)有的 ELISA定量試劑盒標(biāo)準(zhǔn)曲線只有在較窄的濃度范圍內(nèi)成直 線，要得到精確的結(jié)果實(shí)屬不易。3.3.2 記錄 所有實(shí)驗(yàn)的原始資料均應(yīng)存檔；所有的記錄均應(yīng)規(guī)范登記在冊(cè)； 原始登記表應(yīng)記錄試劑來(lái)源、 批號(hào)；質(zhì)控血清的來(lái)源及測(cè)定值并注明是否在控；簽上實(shí)驗(yàn)者姓名及審核者姓名。如試驗(yàn)結(jié)果對(duì)臨床診斷有決定意義， 其樣本應(yīng)保留， 至少與病歷 保存期一致。a）定性試驗(yàn)ELISA定性試驗(yàn)的臨床意義在于是否檢出病原體，與檢出量無(wú)關(guān)， 因此 QC要保證試驗(yàn)的靈敏度和特異性。生化的質(zhì)控圖方法僅能觀察 靈敏度而無(wú)法監(jiān)控特異性。 建議使用臨界值血清界定法： 將試劑盒所 設(shè)的陰陽(yáng)性對(duì)照作為內(nèi)對(duì)照指示反應(yīng)；另設(shè)臨界值、高值質(zhì)控血清， 正常人血清作為外對(duì)照，與標(biāo)本同時(shí)檢測(cè)，臨界值 S/C.O，1高值質(zhì) 控血清 S/C.O1，0正常人血清 A 值在 0.05-0.07之間。陽(yáng)性質(zhì)控血清 失控（臨界值為靈敏度，高值為 “HOO”K效應(yīng)監(jiān)控）應(yīng)重做陰性標(biāo)本； 陰性對(duì)照失控應(yīng)重做陽(yáng)性標(biāo)本。 以表格式記錄每塊板的外對(duì)照實(shí)驗(yàn)結(jié) 果，作為 QC資料存檔。b）定量試驗(yàn)ELISA定量試驗(yàn)常見(jiàn)于腫瘤因子 （如 AFP，CEA，CA 系列），激素類(lèi)， 免疫球蛋白類(lèi)，這些物質(zhì)在體內(nèi)有一定的量（正常范圍） ，超出這個(gè) 量才呈病理情況， 故需定量測(cè)定