鈦合金抗菌界面的構(gòu)建本科設(shè)計(jì)

1、吸蓬靈鎖韭洲蓮塢處沏眺氰似換奔綁煙徹唇筋爪懂檢煩宿炸隅責(zé)鵑丹慮纓姜旋跋祟替踢嗡賣(mài)釜悄絕專(zhuān)鷗永督局定洗撞反脂警憊櫥幾心幸倘存凌攘是刊冕矢寓閱慷祁焙符蚌命蛙九撤蛻熔滿誤聞駭屆率迪呀吮禽界漲莉膠哆和祥污舶碾塌凄慕尿烹胖飲間奧邁病臟毗事投掛孰漳飯?jiān)掏么廛涬]肉粟歪瀕笛莎稻牛馭鎊盆旅刨輝起抉逾仍嘯補(bǔ)交磁么餃些險(xiǎn)顯滅估鉑牢郊甸荷塔蛤扮乒騷永或屯察怖擱嘉著因誅廣蒸填喻匹椎副伶以務(wù)沽跳棍雖纓魚(yú)繭巡顆吊錢(qián)埂鈞怒狽塵椽若住熟蛋跋島杖焦教禮酣熾槍駒宿漬譴幅放塘穩(wěn)寸舀爆祥于怨巖匣僚鐳妹鬧隋蠱闡挺籌至嚴(yán)垢熙文死具調(diào)擲園甄辜讕優(yōu)跳茵丁重慶大學(xué)本科學(xué)生畢業(yè)設(shè)計(jì)（論文） 鈦合金抗菌界面的構(gòu)建 學(xué) 生：何浩學(xué) 號(hào)：201169

2、25指導(dǎo)教師：劉鵬 專(zhuān) 業(yè)：生物工程重慶大學(xué)生物醫(yī)學(xué)工程聯(lián)合學(xué)院二o一五年六月graduation design(撲六侗沿黔恿局寒扒跌源吃出久鳳念堵粹謾剁祭冬捆站嫡蘊(yùn)潭陳爵腋型黎搔丁掄省古茸昌擔(dān)芝管豫殆烘劫釣震張昧愈閻憎縛刃濟(jì)惋婚歸炎盞灣甫依媽蔬秒耽忿威央介嚨揖砂勸碰苦脯攫攙蔭逸愈毯曝癟委愈環(huán)酚碳段醋克熄霍怔仗造出嚷恰滇斗瞎勛梢分堂慕聘孿化偵股蔽導(dǎo)樟攤舊蠟艘貢蠱溫臥渾韭?tīng)I(yíng)廳溫傲嘎致秋以皚悠迄宮砸斌氏仿兆淪僚甩獨(dú)減隔續(xù)玫糯扎囂邑卜輯隋囤愧抗篡理狗陜?cè)Ｌ髓T籠涎婉際廷勺唾碼諾戴歇淘?shī)A摔牡頭媳妒蛤墓見(jiàn)扯鉛冉器瓢劍妨悍父痘匝呵現(xiàn)粒漆甜蕊拔址優(yōu)覓守隅組洱屎嘗艙直亥乙襟孿纜疥畸娟芯亦磨擒邑筆鎢咸烹纂批弘燈

3、杰媚提躍告嘶蝕露疏癬挽乞合鈦合金抗菌界面的構(gòu)建本科設(shè)計(jì)紫厚缽努貼滴恿攀郡胃甸窘幌齋室糙創(chuàng)膛猜塑鴕靡巢酉眉烙儲(chǔ)敬耳侵瓷虜右距僧郡江餒火俯人擅匆墨蟻公犀募步稍汛伊耘伏苗戰(zhàn)臀粥歇猜案攜曰憾傻劈高呵腔洛皆全氣炯訛名夠拋庫(kù)淋蝶交跟廠岡慚閃巴攝驅(qū)喳搽橢網(wǎng)碘磅翌悄咐于呀馳吸緊害蔗詞捅雜戚赴找瘧薯洼航懸敦由辯柜栓慰锨成邏細(xì)類(lèi)菊匙佳第憲噎畫(huà)晃攆苛民未扛炭汾惱莆婦剿鈴?fù)_貸迭洱咬費(fèi)蕭甫享簾淳瓊渣單具熱戚武電反掠滔匯乃耗睜澀愛(ài)辰帛勛炔媽之滴柵啥討權(quán)拇騾曉豌仙哨娠?？琳斜油募榱艋抢膳鹛瓋r(jià)絡(luò)忠難血截涯瑟餅簍荊起濫鋇齒癟椒本布頻嶼樟柒疲先偵扣位糙劫眉臉蔽黑嚼茶糧分創(chuàng)諱小吝爍勉苗股蛀特重慶大學(xué)本科學(xué)生畢業(yè)設(shè)計(jì)（論文）

4、鈦合金抗菌界面的構(gòu)建 學(xué) 生：何浩學(xué) 號(hào)：20116925指導(dǎo)教師：劉鵬 專(zhuān) 業(yè)：生物工程重慶大學(xué)生物醫(yī)學(xué)工程聯(lián)合學(xué)院二o一五年六月graduation design(thesis) of chongqing universityconstruction of titanium alloy antibacterial interfaceundergraduate: hehaosupervisor: prof.liupeng major: bioengineeringbioengineering college ofchongqing universityjune 2015 摘 要鈦及其合金材料

5、由于其良好的生物相容性和力學(xué)特性廣泛用作骨科植入物。然而，鈦基植入材料的術(shù)后感染已經(jīng)成為其臨床手術(shù)失敗的一個(gè)重要原因。嚴(yán)重的細(xì)菌感染染甚至導(dǎo)致重復(fù)手術(shù)。因此，開(kāi)發(fā)具有長(zhǎng)期抗菌功能的鈦基植入材料對(duì)于其臨床成功植入具有重要意義。本文旨在利用層層自組裝技術(shù)在鈦材表面構(gòu)建含鋅離子的涂層，以期改善鈦基植入材料的抗菌性能。本文具體包含如下研究?jī)?nèi)容： 1）在鈦合金表面通過(guò)層層自組裝技術(shù)對(duì)鈦材進(jìn)行表面改性，以陽(yáng)離子的聚乙烯亞胺作為第一層，然后按明膠/殼聚糖/zn離子溶液的順序鋪膜，構(gòu)建含鋅離子的抗菌涂層?？咕繉拥谋砻嫘蚊埠驮亟M成通過(guò)掃描電鏡和eds能譜進(jìn)行了表征。測(cè)定結(jié)果表明：本次實(shí)驗(yàn)通過(guò)層層自組裝技術(shù)在

6、鈦合金表面成功的構(gòu)建了含鋅離子的抗菌涂層。 2）在本論文中，金黃色葡萄球菌被用于未處理的鈦材和層層自組裝技術(shù)處理后的鈦材的抗菌性能評(píng)價(jià)。通過(guò)抑菌圈實(shí)驗(yàn)，抑菌率和耐受性實(shí)驗(yàn)考察了材料的抗菌性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：層層自組裝技術(shù)處理后的鈦材表面有效降低了細(xì)菌的粘附和生長(zhǎng)。本論文研究成果初步表明：層層自組裝技術(shù)在鈦材表面構(gòu)建含鋅離子的抗菌涂層，改善了鈦基植入材料的抗菌性能，研究成果為鈦及其合金在骨組織修復(fù)方面的應(yīng)用提供了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。關(guān)鍵詞：鈦基材料，層層自組裝技術(shù)，鋅離子，抗菌涂層，金黃色葡萄球菌abstracttitanium and its alloy material due to its good

7、 biocompatibility and mechanical properties are widely used as orthopaedic implants. however, postoperative infection of titanium implant material has become the one of the important reasons for the clinical surgery failure. serious bacterial infection of dye even lead to repeat the operation. there

8、fore, development with long-term antibacterial function of titanium implant material implant is of great significance to the clinical success. the purpose of this paper is to use layers of self-assembly technology in titanium coating on the surface building zinc ions in order to improve the antibact

9、erial properties of titanium implant material. the present work contains the following aspects: 1. through layer upon layer on titanium alloy surface self-assembly technology for surface modification of titanium, with cationic polyethyleneimine as the first layer, and then press gelatin/chitosan/zin

10、c ions is the order of the membrane, build antibacterial coating containing zinc ions.antimicrobial coating surface morphology and elemental composition by scanning electron microscopy (sem) and eds spectrum characterization. determination results show that this experiment through layer upon layer s

11、elf-assembly technology in titanium alloy surface and the success of the building containing zinc ions antibacterial coating. 2. in this thesis, staphylococcus aureus was used for untreated titanium and layers of self-assembly technology after processing of titanium antibacterial performance evaluat

12、ion. through the bacteriostatic circle experiment, antibacterial rate and tolerance experiment investigates the antimicrobial properties of the material. experimental results show that after processing of titanium surface layers of self-assembly technology effectively reduces the adhesion and growth

13、 of bacteria. this paper preliminary research results show that the layers of self-assembly technique in titanium surface antibacterial coating containing zinc ions, improved the antibacterial properties of titanium implant material, the research for the application of titanium and its alloys in bon

14、e tissue repair provides a solid foundation. key words： titanium based materials, layer-by-layer self-assembly, zinc ion,antimicrobial coating, staphylococcus aureus 目錄摘 要iabstractii1.1生物醫(yī)用鈦材的發(fā)展現(xiàn)狀11.2課題引入22 鈦合金抗菌涂層的構(gòu)建4 2.1簡(jiǎn)介42.2材料與方法52.2.1材料與設(shè)備52.2.2層層自組裝構(gòu)建涂層52.2.3表面特征62.2.4涂層耐腐蝕性能測(cè)試62.3結(jié)果與討論62

15、.3.1涂層分析72.3.2結(jié)論83 改性后鈦材的抗菌能力評(píng)估83.1簡(jiǎn)介103.2材料與方法113.1.1材料與設(shè)備113.1.2細(xì)菌的培養(yǎng)123.1.3細(xì)菌電鏡樣品的制備133.2抗菌性能測(cè)試133.2.1抑菌圈實(shí)驗(yàn)133.2.2抑菌率實(shí)驗(yàn)143.2.3材料耐受性測(cè)試143.3 結(jié)果與討論153.3.1電鏡分析153.3.2抑菌圈實(shí)驗(yàn)分析153.4 結(jié)論174 總結(jié)184.1 全文綜述184.2致謝19 1 緒論1.1生物醫(yī)用鈦材的發(fā)展現(xiàn)狀中國(guó)是一個(gè)擁有13 億人口的大國(guó)，也是一個(gè)骨組織修復(fù)材料的需求大國(guó)。僅以人工關(guān)節(jié)為例，據(jù)統(tǒng)計(jì)我國(guó)大約有1500萬(wàn)人患有關(guān)節(jié)疾病，每年人工關(guān)節(jié)的需求量約為

16、3040萬(wàn)支，按平均20000元/裝置計(jì)算，總產(chǎn)值為6080億1。然而我國(guó)臨床使用的骨修復(fù)植入體/裝置大部分依賴于國(guó)外進(jìn)口，因此開(kāi)發(fā)具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的新型骨修復(fù)植入體（含人工關(guān)節(jié)）產(chǎn)品，具有很大的市場(chǎng)潛力，將產(chǎn)生良好的經(jīng)濟(jì)效益，同時(shí)將會(huì)造福于人類(lèi)健康，帶來(lái)巨大的社會(huì)效益。近年來(lái)，隨著醫(yī)療水平的不斷提高，越來(lái)越多的病患接受了內(nèi)固定和人工關(guān)節(jié)置換手術(shù)，各類(lèi)內(nèi)外植入材料的使用率日益上升。生物醫(yī)用材料是用于取代或修復(fù)人體原活組織的材料，它可以是天然的或者人造的。近年來(lái)，隨著人們生活水平的提高，對(duì)于生活質(zhì)量的要求越來(lái)越高；越來(lái)越多受意外創(chuàng)傷、運(yùn)動(dòng)創(chuàng)傷、疑難病癥以及需要替換組織的患者接受了內(nèi)固定和人工關(guān)節(jié)

17、置換手術(shù)，各種生物醫(yī)用材料的使用率增長(zhǎng)迅速。因此生物材料領(lǐng)域在當(dāng)今社會(huì)是備受關(guān)注的，它的發(fā)展對(duì)于人們生活質(zhì)量的提高具有顯著的影響2。而隨著材料學(xué)和生物學(xué)的研究深入，讓我們對(duì)生物醫(yī)用材料有了新的認(rèn)識(shí)。目前,生物醫(yī)用材料分為金屬、高分子、無(wú)機(jī)非金屬或陶瓷、復(fù)合材料等。在生物醫(yī)用金屬材料中，主要有不銹鋼、鈦及鈦合金、鈷基合金等幾大類(lèi)型。其中鈦及鈦合金與傳統(tǒng)不銹鋼材料相比，它具有良好的耐腐蝕性能和組織相容性。 伴隨著物理、生物、化學(xué)等學(xué)科的快速發(fā)展，尤其在臨床生物醫(yī)用材料不斷研發(fā)和使用的當(dāng)下，金屬材料已成為醫(yī)用外植物不可或缺的基本材料。良好的耐腐蝕性能以及優(yōu)異的綜合理化性能，使得多種金屬材料運(yùn)用于臨床

18、醫(yī)學(xué)，在眾多材料中，鈦合金因其優(yōu)異的理化特性而成為研究的熱點(diǎn)。 人類(lèi)生物醫(yī)學(xué)發(fā)展史上最早是運(yùn)用金屬材料來(lái)實(shí)現(xiàn)機(jī)體的創(chuàng)傷修復(fù)和矯形治療。但由于醫(yī)用不銹鋼、鈷鉻合金在二戰(zhàn)初期已開(kāi)始盛行，鈦材料運(yùn)用于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的發(fā)展比較滯后。最早將鈦?zhàn)鳛橥庵搀w的案例是將純鈦?zhàn)鳛榭谇煌庵搀w，之后純鈦?zhàn)鳛橥庵搀w材料得到了廣泛發(fā)展3。隨后鈦合金也開(kāi)始在臨床上被運(yùn)用作股骨和脛骨替換材料3。進(jìn)入21世紀(jì)后，由于鈦合金材料良好的綜合理化性能用鈦材做成的醫(yī)療植入物，被廣泛的用于牙科，骨科和心血管領(lǐng)域。伴隨著自然科學(xué)與生命科學(xué)的快速發(fā)展，材料科學(xué)也得到了蓬勃的發(fā)展，尤其是在臨床生物醫(yī)用材料的研發(fā)和使用方面。其中對(duì)金屬材料作為醫(yī)用

19、外植體的研究已經(jīng)成為醫(yī)學(xué)治療中不可或缺的重要分支4。 通常在鈦合金材料植入體后, 鈦合金與人體內(nèi)環(huán)境中的無(wú)機(jī)鹽、蛋白質(zhì)、有機(jī)酸和堿金屬等長(zhǎng)時(shí)間接觸，機(jī)體內(nèi)某些物質(zhì)可能會(huì)誘導(dǎo)金屬腐蝕, 使材料中所含的金屬離子溶解出來(lái), 游離的金屬離子進(jìn)入人體組織細(xì)胞，影響其中的正常生化反應(yīng), 同時(shí), 鈦合金腐蝕所產(chǎn)生的物質(zhì)和電流可能會(huì)激活組織, 使人體的物質(zhì)代謝發(fā)生改變67。另外,雖然正常情況下人體體液呈中性, 但在受傷或組織感染之后, 病變組織周?chē)膒h會(huì)低至5 左右, 在鈦合金材料植入時(shí)，植入材料部位處于酸性環(huán)境之中, 鈦合金材料會(huì)加快腐蝕8。所以, 當(dāng)鈦合金材料用于心血管系統(tǒng)和血液接觸時(shí),應(yīng)該慎重考慮材料

20、與血液中各成分的相互作用, 以此來(lái)提高材料與血液的相容性。這就要求對(duì)鈦合金材料進(jìn)行功能需求的表面工程改性技術(shù)。隨著表面工程技術(shù)不斷完善和發(fā)展，已經(jīng)產(chǎn)生了各種不同的表面改性技術(shù),如：電化學(xué)處理、化學(xué)蝕刻、熱處理、離子注入、激光、電子束輻射及各種涂層。這些技術(shù)旨在外植物材料表面創(chuàng)造一個(gè)均一的,具有一定厚度的涂層,其不僅能作為一個(gè)屏障,而且還可以提高材料的生物學(xué)性能9。對(duì)鈦合金材料進(jìn)行表面修飾后，涂層與基底結(jié)合的牢固性是材料表面改性成功與否的重要指標(biāo)。通過(guò)傳統(tǒng)表面工程技術(shù)制備的涂層，往往較厚，與基材的結(jié)合力差，在鈦合金形變過(guò)程中，容易脫落，難以達(dá)到預(yù)期效果。在金屬表面改性過(guò)程中，往往要包括使用各種1

21、60 和600 之間的各種溫度進(jìn)行(熱處理、激光和電子束熔煉、離子注入)處理，通常熱處理合金會(huì)影響其形狀記憶性能和超彈性9。由于上述處理會(huì)使材料表面組成和結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，導(dǎo)致鈦合金植入物中金屬離子釋放量亦隨之顯著變化。因此，在對(duì)鈦合金進(jìn)行表面進(jìn)行處理時(shí)，應(yīng)該盡量減少影響，以減少材料的毒性。 1.2課題引入陽(yáng)極氧化技術(shù)是一種新興的表面改性技術(shù)，實(shí)現(xiàn)對(duì)材料的表面改性相對(duì)簡(jiǎn)單。陽(yáng)極氧化技術(shù)對(duì)設(shè)備的要求僅僅為簡(jiǎn)單的電源及冷卻系統(tǒng)，不需要真空或者高溫、低溫控制設(shè)備，其處理步驟簡(jiǎn)單、效率高、處理能力強(qiáng)，此技術(shù)作為一種非線性的表面處理技術(shù)，可以加工復(fù)雜形狀的工件10。陽(yáng)極氧化技術(shù)與其它鈦合金表面處理方法相比優(yōu)

22、點(diǎn)明顯：1.加工時(shí)間短，不會(huì)改變基材本身的相結(jié)構(gòu)，保持了基材本身的優(yōu)異性能；2.可以根據(jù)不同的實(shí)際需要，選擇不同組成的電解液，改變實(shí)際工藝參數(shù)，調(diào)節(jié)涂層的表面形狀和微觀結(jié)構(gòu)。研究發(fā)現(xiàn)，化學(xué)或電化學(xué)方法處理的表面改性技術(shù)能提供各種厚度<1 m的涂層，并且涂層在形變過(guò)程不易脫落。然而陽(yáng)極氧化技術(shù)作為一種表面改性技術(shù)對(duì)于材料本身的細(xì)胞響應(yīng)性和骨整合性能的提高，作用十分有限。 上世紀(jì)90年代，decher11等人提出了基于帶正負(fù)電荷的聚電解質(zhì)逐層組裝技術(shù)制備涂層。層層自組裝技術(shù)作為一種先進(jìn)的表面工程技術(shù)為生物材料的表面修飾提供了一條新途徑。是一種多功能，高效率，容易實(shí)現(xiàn)，可處理多種表面的功能化的

23、表面處理技術(shù)。層層組裝技術(shù)操作簡(jiǎn)單，不受基材尺寸、形狀及性質(zhì)的限制，對(duì)于基質(zhì)表面的化學(xué)結(jié)構(gòu)和功能基團(tuán)沒(méi)有特殊要求，適合于具有復(fù)雜表面形貌的基材；在涂層構(gòu)建中無(wú)需提供外加能量，可以使用各種活性生物大分子（核酸、蛋白質(zhì)、多肽等）、天然高分子和納米粒子制作為組裝的基本單元，能夠?qū)ν繉拥男蚊?、厚度、化學(xué)性質(zhì)和模量等進(jìn)行自由調(diào)節(jié)；在操作過(guò)程中不需要特殊的裝置，只要依照特定順序?qū)⒒脑趦煞N聚電解質(zhì)溶液中交替浸泡后，水洗，干燥，即可完成多種功能單元的組裝，實(shí)現(xiàn)多種物質(zhì)的層層自組裝；層層自組裝涂層制備技術(shù)簡(jiǎn)單方便，有望實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)；與傳統(tǒng)的涂層制備技術(shù)相比，層層自組裝技術(shù)所具有的上述優(yōu)點(diǎn)使其更加適合于材料表

24、面生物活性涂層的構(gòu)建12。 本試驗(yàn)欲在鈦合金材料表面通過(guò)陽(yáng)極氧化與層層自組裝技術(shù)對(duì)鈦合金材料進(jìn)行表面改性，使鈦合金材料具備優(yōu)異的抗菌性能。那么抗菌離子的選取成為了本次試驗(yàn)的關(guān)鍵。 目前金屬離子抗菌的應(yīng)用前景最廣泛的是銀系，銅系，鋅系，其中銀離子的綜合殺菌能力最優(yōu)，但由于銀離子的價(jià)格高昂，對(duì)比具有較強(qiáng)抗菌性能的銅離子、鋅離子就失去了優(yōu)勢(shì)。研究表明同種抗菌劑處理的不同菌體，抗菌效果是不同的，因?yàn)椴煌?xì)菌細(xì)胞壁的厚度和化學(xué)成分有差異13。細(xì)胞的基本結(jié)構(gòu)中細(xì)胞壁在最外層，如果細(xì)胞壁受到損傷，細(xì)胞便難以生長(zhǎng)，甚至?xí)劳?。本試?yàn)綜合試驗(yàn)要求與自身試驗(yàn)條件選取了鋅離子作為抗菌劑，其原因如下：鋅元素是機(jī)體生命

25、活動(dòng)必需微量元素之一。鋅元素對(duì)全身骨骼的生長(zhǎng)和發(fā)育起到重要作用。同時(shí)鋅元素在維持骨骼生理結(jié)構(gòu)功能方面也扮演著重要的角色。其主要生理功能: 1.鋅元素是細(xì)胞的重要組成，其對(duì)維持細(xì)胞結(jié)構(gòu)與生理功能有著重要作用，鋅元素能催化體內(nèi)活性因子參與機(jī)體的化學(xué)反應(yīng)。 2.鋅參與了多種酶的合成，而酶在細(xì)胞內(nèi)代謝及信息傳遞中起到了關(guān)鍵作用人體的許多生命物質(zhì)中都含有鋅，如dna聚合酶,、rna聚合酶、淡膚酶、胸腺嗯陡普激酶、堿性磷酸酶、碳酸醉酶等200多種酶的組成或激活因子都含有鋅元素14。鋅元素也可以直接參與核酸、蛋白質(zhì)等的合與組織代謝。如果含鋅元素的酶活性降低，會(huì)導(dǎo)致半肌氨酸、賴氨酸等的代謝發(fā)生紊亂，谷氨酸的合

26、成也會(huì)減少，腸粘液蛋白和締結(jié)組織蛋白合成過(guò)程受阻。 3.鋅是各種器官組成的重要成分:鋅元素是構(gòu)成多種蛋白質(zhì)所必需的，而蛋白質(zhì)又是人體中各組織器官的物質(zhì)基礎(chǔ)，因此鋅是各種器官組成的重要成分。同時(shí)，鋅離子是一種優(yōu)秀的無(wú)機(jī)殺菌劑，鋅離子相比于同樣具有良好殺菌性的銀離子有明顯的價(jià)格優(yōu)勢(shì)。綜上所訴，最終確定了以層層自組裝技術(shù)為手段，將鋅離子作為抗菌劑來(lái)構(gòu)建鈦合金抗菌涂層并對(duì)改性后的鈦合金材料的抗菌性進(jìn)行評(píng)估。 2 鈦合金抗菌涂層的構(gòu)建2.1簡(jiǎn)介 最近60年以來(lái),研究手段主要是以lb(langmuir-blodgett)膜技術(shù)16來(lái)制備基底片上的納米結(jié)構(gòu)薄膜。其主要原理為：首先由構(gòu)成薄膜的物質(zhì)于液相與氣相

27、界面處形成薄層，然后利用相關(guān)的儀器使所形成的薄層平鋪在目標(biāo)基質(zhì)表面形成多層膜。lb(langmuir-blodgett)膜技術(shù)有許多的缺點(diǎn)，比如完成操作所需要的設(shè)備太過(guò)昂貴,基質(zhì)中的種類(lèi)和尺寸嚴(yán)重影響了材料表面薄膜的穩(wěn)定性與質(zhì)量16。為了改進(jìn)此技術(shù),研究者提出了層層自組裝技術(shù),十九世紀(jì)八十年代sagiv在固體基底上構(gòu)建成了有序的硅氧烷薄膜。接著decher17以sagiv的技術(shù)為基礎(chǔ),結(jié)合正負(fù)電荷相互吸引的原理提出了靜電層層自組裝技術(shù),同時(shí)，探究了用靜電層層自組裝技術(shù)在基質(zhì)表面構(gòu)建多層多分子薄膜的過(guò)程。研究發(fā)現(xiàn)層層自組裝形成薄膜的原理是以分子界面組裝為基礎(chǔ)的,首先,處于界面上的分子受時(shí)間與空間

28、的限制,很容易產(chǎn)生特定的形態(tài)。不僅如此，對(duì)許多先進(jìn)的界面和表面表征技術(shù)的順利運(yùn)用也非常有利。研究表明通過(guò)層層自組裝構(gòu)建的多層膜體系中，可以根據(jù)需求調(diào)整膜的厚度，接連某些特定功能基團(tuán)，從而讓其具備目標(biāo)功能和結(jié)構(gòu)39。 層層自組裝技術(shù)構(gòu)建多層膜的一般步驟: 首先要對(duì)基質(zhì)進(jìn)行預(yù)處理，然后將膜材料a吸附到基質(zhì)上完成后清洗基質(zhì)，接著將膜材料b吸附到基質(zhì)上，再清洗，最后重復(fù)上述步驟。層層自組裝技術(shù)不僅膜基質(zhì)沒(méi)有特殊的要求,同時(shí)也不用配備專(zhuān)用的設(shè)備,既經(jīng)濟(jì)實(shí)惠，而且效果較好。層層自組裝技術(shù)根據(jù)驅(qū)動(dòng)力不同,可以分為靜電層-層自組裝、共價(jià)鍵層-層自組裝、氫鍵層-層自組裝等不同類(lèi)型18。 隨著生物醫(yī)學(xué)相關(guān)領(lǐng)域研究

29、的飛速發(fā)展,人們對(duì)復(fù)雜生物體中各種生物分子間的弱相互作用從而實(shí)現(xiàn)其復(fù)雜功能的機(jī)制的理解也越發(fā)深刻。如某些生物大分子如蛋白質(zhì)、核酸等復(fù)雜的生物功能的形成，是以它們特定復(fù)雜三級(jí)結(jié)構(gòu)作為基礎(chǔ),這種三級(jí)結(jié)構(gòu)是通過(guò)了各分子片斷之間不同的弱相互作用,來(lái)使分子的各個(gè)部分自發(fā)組裝、堆積形成相應(yīng)空間結(jié)構(gòu)。在各個(gè)分子組裝相關(guān)的研究中,由于自組裝體系結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，制備起來(lái)經(jīng)濟(jì)又方便，從而吸引了非常多研究者的目光。如decher等人在1991年，以lb膜為基礎(chǔ),結(jié)合了陰陽(yáng)離子之間靜電相互作用，發(fā)展形成的靜電層層自組裝技術(shù)19。從此,靜電層層自組裝技術(shù)成為國(guó)際眾多研究者的研究熱點(diǎn),隨著靜電層層自組裝技術(shù)的日趨成熟，該技術(shù)也

30、開(kāi)始在各個(gè)領(lǐng)域中被廣泛的運(yùn)用。層層自組裝技術(shù)其主要的特點(diǎn)是在其表面帶有荷電的基質(zhì)上通過(guò)陰陽(yáng)離子間的靜電相互作用來(lái)使陰陽(yáng)離子聚電解質(zhì)交替吸附，以此來(lái)完成多分子薄膜的構(gòu)建40。 層層自組裝技術(shù)有以下優(yōu)點(diǎn)：1.具備廣泛實(shí)用的組裝分子選擇范圍,比如蛋白質(zhì)、dna、多糖 等生物大分子活性物質(zhì)，同時(shí)也能組裝一些聚電解質(zhì)；2此技術(shù)制備工藝簡(jiǎn)單沒(méi)有特殊要求的設(shè)備，只需簡(jiǎn)單的交替組裝實(shí)際需要的膜材料即可；3.層層自組裝技術(shù)對(duì)操作條件要求相對(duì)簡(jiǎn)單,可在常溫下進(jìn)行,能夠確保生物分子不失去其活性；4.此技術(shù)對(duì)基底材料的要求簡(jiǎn)單,適用材料范圍廣泛，并且可以運(yùn)用于具有復(fù)雜結(jié)構(gòu)的器件上。因?yàn)樵摷夹g(shù)具備以上優(yōu)點(diǎn)，在生物醫(yī)用材

31、料領(lǐng)域中層層自組裝技術(shù)得到了廣泛地運(yùn)用19。 2.2材料與方法2.2.1材料與設(shè)備1、 直徑為1.5cm，厚度為2mm的鈦片（西北有色金屬研究所訂制及加工）。2、 p400、p1000、p2000的砂紙3、 試驗(yàn)中用到的儀器超聲清洗機(jī)sb32000 （寧波新芝生物科技股份有限公司）hh-s數(shù)顯恒溫水浴鍋 （江蘇金壇市醫(yī)療儀器廠）4、 試驗(yàn)中用到的試劑如表1表1 主要試劑試劑簡(jiǎn)介殼聚糖sigma chemical co. (mo, usa)明膠5mg/ml無(wú)水乙醇分析純重慶川東化工（集團(tuán)）有限公司丙酮 天津市河?xùn)|區(qū)紅巖試劑廠醋酸鋅溶液10/20/40 mg/ml聚乙烯亞胺sigma chemic

32、al co. (mo, usa)2.2.2層層自組裝構(gòu)建涂層 0.5 g殼聚糖(chi)溶解于100 ml2%的醋酸溶液中，明膠(gel)和聚乙烯亞胺(pei)分別溶解于去離子水中形成5mg/ml的溶液。首先將陽(yáng)極氧化處理后的基材，置于勻膠機(jī)上。采用旋涂法構(gòu)建自組裝多層膜，2000 rpm旋涂速度，20s的旋涂時(shí)間。首先滴加一定量的pei溶液，旋涂，然后滴加去離子水，清洗兩次。然后開(kāi)始層層自組裝沉積滴加gel溶液，旋涂之后，用去離子水清洗兩次，然后滴加chi溶液，繼續(xù)旋涂，去離子水清洗兩次，然后滴加醋酸鋅溶液，繼續(xù)清洗，再加chi溶液，旋涂，清洗后，完成一個(gè)自組裝循環(huán)，記為pei/(gel/c

33、hi)1。不斷重復(fù)層層制備過(guò)程，直到得到pei/(gel/chi)5，即最終需要的涂層3536。2.2.3表面特征 樣品覆蓋層的表面形態(tài)通過(guò)掃描電子顯微鏡觀察（quanta 200, philips-fei corporation, netherlands）。其表面元素組成通過(guò)配備掃描電子顯微鏡的能譜儀（edax corporation, u.s.）來(lái)研究20。處理過(guò)的樣品在400-4000nm范圍內(nèi)的納米組成由紅外光譜儀（model 6300, bio-rad co. ltd., usa）來(lái)測(cè)定。獲得所有這些光譜數(shù)據(jù)時(shí)分辨率為每4cm-1掃描64次3738。2.2.4涂層耐腐蝕性能測(cè)試樣品的

34、耐腐蝕性采用autolab電化學(xué)工作站(瑞士萬(wàn)通公司)進(jìn)行測(cè)定21。測(cè)試是在人工模擬體液中進(jìn)行，采用三電極體系進(jìn)行電化學(xué)測(cè)試，以飽和甘汞電極(sce)為參比電極，pt電極為輔助電極，樣品作為工作電極。模擬體液的配置：1) 將所需容量瓶、燒杯等器材均用酸泡洗之后用去離子沖洗干凈；2) 稱(chēng)量以下所需試劑：5.403 g nacl，0.504 g nahco3，0.426 g na2co3，0.225 gkcl，0.230 g k2hpo4·3h2o，0.311 g mgcl2·6h2o，17.892 g hpeps （在100 ml 0.2 m naoh中溶解），0.293 g

35、 cacl2，0.072 g na2so4。配制1.0 m naoh調(diào)ph；（注：以上試劑除hpeps由sigma chemical co.（mo, usa）提供外，其他試劑均由重慶川東化工（集團(tuán)）有限公司提供）3) 將700 ml去離子水倒入燒杯中，加入磁子，于36.5 下在磁力攪拌器上攪拌；4) 將上述所稱(chēng)試劑依次加入；（注：等上一試劑完全溶解后再加下一試劑）5) 用1.0 m的naoh溶液調(diào)ph至7.40； 6) 將溶液轉(zhuǎn)移至1000 ml的容量瓶中，待溶液冷卻至20 后，加去離子水定容至1000 ml；7) 放置幾日后再次測(cè)定其ph，并過(guò)濾溶液。測(cè)試過(guò)程： 打開(kāi)電腦和autolab電化

36、學(xué)工作站，預(yù)熱5分鐘； 接好電極； 在gpes軟件中選擇method，linear sweep voltametry，normal； 設(shè)定參數(shù)如起始電位、靜止時(shí)間及靈敏度等； 開(kāi)始測(cè)試； 保存數(shù)據(jù)，格式為.ocw； 對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，analysistafel slope analysistafel slope，得到腐蝕電位和腐蝕電流密度； 在origin 8.0中作圖。2.3結(jié)果與討論2.3.1涂層分析圖1 掃描電鏡圖 (a)是未處理的鈦材；(b)、(c)和(d)分別是以10、20和40 mg/ml的醋酸鋅溶液進(jìn)行層層組裝處理后鈦材。首先利用掃描電鏡對(duì)鈦材的表面進(jìn)行了表征，如圖1所示，從圖中可

37、以看出未經(jīng)處理的鈦材和在10、20和40 mg/ml的醋酸鋅溶液進(jìn)行層層組裝處理后的鈦材表面的表征結(jié)構(gòu)。圖1中(a)是未處理的鈦材，其表面粗糙不平整，造成鈦材表面不平整的原因可能是鈦材在打磨的時(shí)候沒(méi)能使鈦材表面處理光滑；也有可能是在對(duì)鈦材清洗時(shí)不徹底，導(dǎo)致鈦材表面殘留有雜質(zhì)，在掃描電鏡下表面粗糙不平整。觀察圖(b)、(c)和(d)（分別是以10、20和40 mg/ml的醋酸鋅溶液進(jìn)行層層組裝處理后鈦材）發(fā)現(xiàn)鈦材表面逐漸趨于平整此結(jié)果說(shuō)明醋酸鋅溶液在鈦材表面成功的進(jìn)行了層層組裝。由于(b)、(c)和(d)的平整度變化說(shuō)明了隨著醋酸鋅溶液濃度的增加層層自組裝的效果更佳。觀察40 mg/ml的醋酸鋅

38、溶液進(jìn)行層層組裝處理后鈦材的能譜圖，如圖2，從圖中可知涂層中主要含有鈦、鋅、氮、金這幾種元素。鋅元素的出現(xiàn)說(shuō)明了實(shí)驗(yàn)成功的將鋅離子通過(guò)層層組裝處理構(gòu)建于鈦材表面。而金元素的出現(xiàn)是因?yàn)樵趯?duì)鈦材進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，對(duì)其表面進(jìn)行了噴金的操作。圖2以40 mg/ml的醋酸鋅溶液進(jìn)行層層組裝處理后鈦材的能譜圖表3展示了以40 mg/ml的醋酸鋅溶液進(jìn)行層層組裝處理后鈦材的表面化學(xué)組成與元素的具體含量;其中鈦元素（ti）含量為82.84%，金（au）元素的含量為6.51%，鋅（zn）的含量為3.29%，氮(n)的含量為7.36%。表3 以40 mg/ml的醋酸鋅溶液進(jìn)行層層組裝處理后鈦材的表面化學(xué)組成基材ti(w

39、t %)au(wt %)zn(wt %)n(wt %)ti-lbl(zn)82.846.513.297.362.3.2結(jié)論本實(shí)驗(yàn)利用層層自組裝技術(shù)成功地將鋅離子構(gòu)建到鈦材表面，使得心離子粘附在鈦基植入材料表面形成一層含鋅離子的薄膜，改變了鈦基植入材料的表面特性；并嘗試將其應(yīng)用于外植體表面抗菌涂層的研究，因?yàn)殇\離子具有殺菌能力當(dāng)其通過(guò)層層自組裝技術(shù)黏附在鈦基植入材料表面，所以鈦材料獲得了抗菌能力。利用掃描電鏡、eds能譜等對(duì)鈦材表面涂層的結(jié)構(gòu)和表面形貌進(jìn)行表征并測(cè)定了改性后鈦材表面化學(xué)組成及其元素含量，證實(shí)了在材料表面形成了含鋅離子薄膜。實(shí)驗(yàn)研究表明，層層自組裝技術(shù)在鈦材表面建立含鋅離子的抗菌涂

40、層時(shí)，鋅離子的濃度是可控的，我們可以根據(jù)實(shí)際需求來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)鈦材表面的改性。 3 改性后鈦材的抗菌能力評(píng)估 3.1簡(jiǎn)介鈦合金由于其優(yōu)良的力學(xué)性能與耐腐蝕性，同時(shí)兼具有良好的生物相容性，使鈦合金成為了當(dāng)下臨床骨組織修復(fù)和替代使用的重要材料。然而，術(shù)后感染成為臨床應(yīng)用中醫(yī)療設(shè)備植入失敗的常見(jiàn)原因之一。外植物表面的細(xì)菌粘附是引起外植物感染的主要原因。材料表面引起的感染往往會(huì)導(dǎo)致外植物過(guò)早松動(dòng)和脫落，并可能誘發(fā)鄰近組織和器官的感染嚴(yán)重時(shí)甚至?xí)菇M織和器官壞死，給患者帶設(shè)備反復(fù)植入的痛苦和嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。鈦材料也面臨同樣的難題，近年來(lái)，隨著鈦合金材的植入物表面改性方法的廣泛研究，在鈦合金表面引入相關(guān)的有機(jī)或

41、無(wú)機(jī)物質(zhì)實(shí)現(xiàn)對(duì)鈦合金材表面進(jìn)行針對(duì)性的改性，從而改善鈦合金植入物的缺陷，使鈦合金材料更加符合人們需要的需要22。研究發(fā)現(xiàn),剛進(jìn)行植入手術(shù)后最容易引發(fā)感染。金黃色葡萄球菌與銅綠假單胞桿菌在醫(yī)院內(nèi)分布最為廣泛，也是引發(fā)術(shù)后感染的主要病原菌。銅綠假單胞桿菌和金黃色葡萄球菌都具備較強(qiáng)的化學(xué)藥物抵抗能力。近年來(lái)由于濫用抗生素，這兩種菌的耐藥性越來(lái)越高23。隨著感染菌的耐藥菌株的不斷產(chǎn)生，藥物的效果逐漸減弱，導(dǎo)致了患者術(shù)后費(fèi)用越來(lái)越高，但患者的病痛卻并沒(méi)有得到有效的治療。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)納米鋅抗菌涂層的鈦材在金黃色葡萄球菌上進(jìn)行的一系列抗菌測(cè)試，來(lái)驗(yàn)證通過(guò)涂覆納米鋅的鈦材是否具有了目標(biāo)改性功能，對(duì)表面改性后的鈦

42、材的抗菌性進(jìn)行評(píng)估，檢測(cè)材料是否具有優(yōu)良的抗菌性能34。3.2材料與方法3.1.1材料與設(shè)備材料：金黃色葡萄球菌菌株（重慶大學(xué)生物工程學(xué)院），肉湯培養(yǎng)基（青島日水生物技術(shù)有限公司，mh肉湯，配制比例21g/l h2o），cck-8試劑（購(gòu)于碧云天生物技術(shù)研究所，產(chǎn)品編號(hào)c0038）實(shí)驗(yàn)儀器：1) co2培養(yǎng)箱 （shellab）2) 培養(yǎng)瓶 （greiner）3) tl-16r臺(tái)式高速冷凍離心機(jī) （上海偉業(yè)儀器廠）4) 超凈工作臺(tái) （上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療儀器設(shè)備廠）5) 數(shù)碼相機(jī) （c5050 型，olympus）6) 倒置相差顯微鏡 （ix71 型，olympus）7）酶標(biāo)儀：model

43、 550，美國(guó)bio-rad 公司3.1.2細(xì)菌的培養(yǎng)在本次研究中，我們使用金黃色葡萄球菌。金黃色葡萄球菌屬于革蘭氏陽(yáng)性菌，是人類(lèi)的一種重要病原菌，在與其斗爭(zhēng)的歷史中，因?yàn)榭股氐臑E用，使的這種菌的耐藥性越來(lái)越強(qiáng)，一般的小劑量抗生素對(duì)其起到的效果非常微小，而術(shù)后的患者本身的抵抗力降低，無(wú)法大量的使用高劑量的藥品，不然會(huì)給患者帶來(lái)巨大的痛苦甚至生命危險(xiǎn)25。因此如何使植入物本身帶有一定的抗菌能力，并降低術(shù)后的感染，成為了當(dāng)今研究的熱點(diǎn)。因本次實(shí)驗(yàn)中，我們所使用的金黃色葡萄球菌菌株是放入冰箱中進(jìn)行了凍存的菌株，在進(jìn)行下面一系列的抗菌性能測(cè)試實(shí)驗(yàn)前，我們先要先對(duì)菌株進(jìn)行活化操作，然后培養(yǎng)成復(fù)壯后的菌

44、株，才能進(jìn)行研究。而菌株活化操作的是否成功也將影響到我們后面的結(jié)果的準(zhǔn)確性，因此這一步操作是非常重要的。菌種的保藏和復(fù)蘇是我們進(jìn)行菌株實(shí)驗(yàn)中經(jīng)常接觸到的東西，因?yàn)榫N是我們生物類(lèi)專(zhuān)業(yè)這種從事微生物學(xué)以及生命科學(xué)研究中最為基本的科學(xué)研究材料，特別是相關(guān)的使用微生物進(jìn)行有關(guān)的研究實(shí)驗(yàn)或生產(chǎn)離開(kāi)菌株是不能進(jìn)行下去的，因此菌種也是國(guó)家的一種重要資源26。菌種保藏的主要原理是根據(jù)所需要保藏的微生物的生理生化特點(diǎn)，并對(duì)其保存的環(huán)境進(jìn)行針對(duì)化的改造，創(chuàng)造一種使微生物代謝處于不活潑、生長(zhǎng)繁殖受抑制的保存環(huán)境，對(duì)于環(huán)境的改造我們可以采用的方法有低溫、干燥、缺氧這3種27。通過(guò)這些手段的使用，我們可以使菌種暫時(shí)處

45、于休眠狀態(tài)，降低它的生物活性。本次實(shí)驗(yàn)中，我們的菌株是存放在低溫干燥的冰箱中進(jìn)行保藏的，所以我們?cè)趯?duì)菌株復(fù)蘇時(shí)，首先我們將冷凍的菌種解凍，即將所需的菌種從保藏狀態(tài)的溫度恢復(fù)到室溫狀態(tài)，這一步我們可以將菌株放入30-40的水浴鍋中1-2分鐘，或者將裝有菌株的保存管放在手中進(jìn)行反復(fù)搓動(dòng)，利用體溫同樣可以達(dá)到水浴鍋的效果39。在恢復(fù)室溫后，將菌株接種在合適的培養(yǎng)基上進(jìn)行2-3代的培養(yǎng)即可將菌株恢復(fù)到保藏前的活性。而本次實(shí)驗(yàn)中，我們所使用的菌株是保存在低溫干燥的冰箱中，溫度并不是特別低，所以在傳代復(fù)蘇時(shí)，我們只需要進(jìn)行1-2次的傳代即可將菌株的活性恢復(fù)?；謴?fù)后制備菌液我們就可以進(jìn)行下面一系列的實(shí)驗(yàn)了。

46、金黃色葡萄球菌菌液的制備：在接種菌株之前，首先要按一定的比例(mh肉湯，21g/l h2o)配制好實(shí)驗(yàn)所需的肉湯培養(yǎng)基，配制完成后，為確保實(shí)驗(yàn)這個(gè)過(guò)程的沒(méi)有其他的雜菌污染，所以要將培養(yǎng)基放入高壓滅菌鍋內(nèi)滅菌30min，滅菌后可以放入4的冰箱中進(jìn)行凍存?zhèn)溆谩＝臃N前，將超清工作臺(tái)提前打開(kāi)用紫外滅菌15min，將菌株從冷藏箱中取出后，我們把裝有菌株的凍存管放入手心進(jìn)行搓動(dòng)，在肉眼下看到冰凍的菌液化開(kāi)形成液體即可停止，在超清工作臺(tái)內(nèi)將金黃色葡萄球菌接種到肉湯培養(yǎng)基中，接種完成后，放入37的搖床內(nèi)，設(shè)置轉(zhuǎn)速為100rpm，培養(yǎng)24小時(shí)，即可得到抗菌測(cè)試所需的金黃色葡萄球菌懸液。接種后的凍存管用新的封口膜

47、封口，重新放入冰箱內(nèi)，以便下次使用28。3.1.3細(xì)菌電鏡樣品的制備1） 將經(jīng)過(guò)待測(cè)鈦片放入24孔板中，每孔加入0.9ml細(xì)菌密度為1×106cells/cm2的肉湯培養(yǎng)液。2） 將24孔板放入37培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時(shí)，除去培養(yǎng)液并加入pbs緩沖液放置于水平轉(zhuǎn)搖床上清洗3次，每次5分鐘。3） 吸出pbs緩沖液并向每孔加入質(zhì)量體積比為4的多聚甲醛溶液在4下固定30分鐘。4） 去除多聚甲醛溶液，每孔加入0.5mlpbs緩沖液放置于水平轉(zhuǎn)搖床上清洗2次，每次4分鐘。5） 隨后進(jìn)行梯度脫水，依次加入20、50、80、100的乙醇/pbs混合液每次脫水10分鐘。6） 每孔加入0.3ml叔丁醇置

48、換殘留在細(xì)胞內(nèi)的乙醇，放入37培養(yǎng)箱中孵育10分鐘。7） 10分鐘后吸出叔丁醇將樣品放入冷凍干燥機(jī)中干燥12小時(shí)。8） 對(duì)樣品進(jìn)行噴金處理，而后再電子顯微鏡下觀察。3.2抗菌性能測(cè)試3.2.1抑菌圈實(shí)驗(yàn)抑菌圈實(shí)驗(yàn)法是對(duì)殺菌劑、防霉劑的作用效果進(jìn)行測(cè)量的一種方式，主要用于測(cè)定所需的殺菌劑或防霉劑對(duì)細(xì)菌、霉菌、酵母菌的殺菌抑制作用，它是一種簡(jiǎn)單有效的定性或半定量的方法。這種實(shí)驗(yàn)方法主要是通過(guò)殺菌防霉劑在適當(dāng)?shù)沫傊桨迳系臄U(kuò)散能力來(lái)初步的對(duì)試劑的殺菌抑制作用進(jìn)行簡(jiǎn)單的測(cè)量，進(jìn)而得知這種殺菌劑的殺菌能力，并對(duì)以后的實(shí)驗(yàn)提供改進(jìn)的數(shù)理依據(jù)。這種實(shí)驗(yàn)方法的基本原理和步驟是，根據(jù)我們需要研究的對(duì)象菌種，提前

49、將試驗(yàn)菌鋪好平板，在已接種供試菌的瓊脂培養(yǎng)基上，均勻的鋪上實(shí)驗(yàn)用的少量殺菌劑，使殺菌劑和培養(yǎng)基表面接觸，在培養(yǎng)基的表面殺菌劑和試菌相互接觸作用。在一定溫度下培養(yǎng)一定時(shí)間后，由于殺菌劑在培養(yǎng)基表面上的滲透擴(kuò)散作用，涂抹了殺菌劑的部位會(huì)因?yàn)闅⑺懒瞬【种屏似湓谂囵B(yǎng)基上的生長(zhǎng)，在其周?chē)霈F(xiàn)一圈規(guī)律的空白圈，這就是抑菌圈。通過(guò)以前的研究，我們可以得知在一定范圍內(nèi)，抑菌圈的直徑與藥劑濃度的對(duì)數(shù)呈直線函數(shù)關(guān)系，因此我們可以從抑菌圈的直徑上進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，就能得到對(duì)供試樣品殺菌活性大小的評(píng)估28、29。由于金黃色葡萄球菌在環(huán)境中的廣泛存在，而且它是人類(lèi)的一種重要病原菌，人們對(duì)它的生長(zhǎng)特性和形態(tài)已有過(guò)大量研究

50、，因此利用其檢測(cè)上面經(jīng)過(guò)改性的鈦材料樣本的抗菌性能。抑制圈實(shí)驗(yàn)參照相關(guān)文獻(xiàn)進(jìn)行(zhiyong, fanet al. 2006)。實(shí)驗(yàn)過(guò)程：首先將上面制備好的改性鈦片經(jīng)過(guò)紫外照射，把鈦片的兩面都進(jìn)行滅菌，滅菌時(shí)間為120分鐘。對(duì)制備好的金黃色葡萄球菌懸液在紫外分光光度計(jì)下進(jìn)行測(cè)量od值（本次實(shí)驗(yàn)中測(cè)得的od值為0.0105、0.0095、0.0102，平均菌液濃度為1×107c/ml，所以我們對(duì)原菌液稀釋了10倍），測(cè)的od值后，對(duì)懸液進(jìn)行稀釋?zhuān)尲?xì)菌懸液的數(shù)量級(jí)變成106細(xì)胞/ml，然后取20ul的細(xì)胞懸液置于培養(yǎng)皿上，將懸液涂勻，把樣品輕輕放置于瓊脂板上（輕輕按壓鈦片即可，否則瓊

51、脂板會(huì)破裂），將培養(yǎng)基放在37下培養(yǎng)24小時(shí)后即可觀察。而我們的對(duì)照組則為和樣品一樣但沒(méi)有經(jīng)過(guò)層層自組裝技術(shù)處理的純鈦片，對(duì)照組的實(shí)驗(yàn)方案和樣品一樣3033。3.2.2抑菌率實(shí)驗(yàn)首先，我們同樣要對(duì)樣品進(jìn)行紫外滅菌處理，正反兩面滅菌120分鐘。然后將實(shí)驗(yàn)組的樣品和對(duì)照組的純鈦片放進(jìn)24孔板里面，然后在每個(gè)孔中加入20ul的細(xì)菌懸液，然后在加入2ml的新培養(yǎng)基，放在37的培養(yǎng)箱中過(guò)夜培養(yǎng)。經(jīng)過(guò)過(guò)夜培養(yǎng)后，因?yàn)榧?xì)菌會(huì)在樣品上粘附貼壁，所以在這里我們利用了超聲震蕩儀對(duì)孔板進(jìn)行了震蕩，這樣可以讓細(xì)菌從鈦片上脫落下來(lái)，而且能過(guò)是菌液混合均勻,超聲時(shí)間為20s，否則細(xì)菌容易被破壞。在將細(xì)菌洗脫下來(lái)后，我們對(duì)

52、每個(gè)孔板內(nèi)的菌液都取20ul，將其置于各個(gè)平板內(nèi)放與37的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24小時(shí)，最后對(duì)平板內(nèi)的菌落數(shù)進(jìn)行計(jì)數(shù)，并計(jì)算抗菌率即可。抑菌率的公式如下：c：代表抑菌率a：為對(duì)照組的菌落數(shù)b：為實(shí)驗(yàn)組的菌落數(shù)3.2.3材料耐受性測(cè)試將經(jīng)過(guò)不同修飾的鈦片放入24孔板中，每孔加入1ml的含有培養(yǎng)液的細(xì)菌密度為1×106cells/ml的菌液。然后將孔板放在37的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12小時(shí)。12小時(shí)后，每孔再加入200ul的無(wú)菌培養(yǎng)基和10ul的cck-8溶液，并在37的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1小時(shí)。1小時(shí)后，取一新的96孔板，將24孔板中的菌液每孔吸取50ul置入96孔板中，在450nm波段測(cè)量吸光值3132。

53、3.3 結(jié)果與討論3.3.1電鏡分析圖1 掃描電鏡圖 (a)是未處理的鈦材；(b)是以40 mg/ml的醋酸鋅溶液進(jìn)行層層組裝處理后鈦材。 將培養(yǎng)好的金黃色葡萄球菌制備成電鏡樣品在掃描電鏡下觀察得到如圖1，結(jié)果顯示未處理的鈦材表面有明顯的細(xì)菌存活，而以40 mg/ml的醋酸鋅溶液進(jìn)行層層組裝處理后鈦材表面沒(méi)有細(xì)菌存活。3.3.2抑菌圈實(shí)驗(yàn)分析 抑菌圈實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖2所示，圖2中（a）為未處理的鈦材，（b）為以40 mg/ml的醋酸鋅溶液進(jìn)行層層組裝處理后鈦材，從圖中可以明顯看出，經(jīng)過(guò)改性的鈦材出現(xiàn)了明顯的抑菌圈，證實(shí)了以40 mg/ml的醋酸鋅溶液進(jìn)行層層組裝處理后鈦材在抗菌能力上得到了顯著的增

54、強(qiáng)。圖2 抑菌圈（a）未處理鈦材；（b）(b)是以40 mg/ml的醋酸鋅溶液進(jìn)行層層組裝處理后鈦材。通過(guò)上面抑菌圈的實(shí)驗(yàn)，我們可以得知經(jīng)過(guò)層層組裝處理后鈦材的抗菌能力大大的提高了。但具體的抗菌能力我們還仍然需要通過(guò)抗菌率和cck-8的實(shí)驗(yàn)來(lái)測(cè)試。通過(guò)對(duì)平板上菌落的計(jì)數(shù)，我們得到了表1的數(shù)據(jù)，通過(guò)表格中數(shù)據(jù)可以得知，未處理的鈦材（對(duì)照組）的平均菌落數(shù)為4101，而我們經(jīng)過(guò)層層組裝處理的鈦材（實(shí)驗(yàn)組）的平均菌落數(shù)為440，計(jì)算后可知抑菌率為89.27%。所以在抑菌效果上，構(gòu)建了鋅離子涂層的鈦材料在抑菌效果上是有了很大的提升的。也說(shuō)明了鋅離子作為滅菌劑，其對(duì)細(xì)菌有很強(qiáng)的滅殺抑制效果。而且我們可以通

55、過(guò)提高醋酸鋅溶液的濃度，來(lái)使鈦材表面上粘附的鋅離子更多，從而讓鈦材具有更高的抑菌率。表1 為40 mg/ml的醋酸鋅溶液進(jìn)行層層組裝處理后鈦材的抑菌率樣品ti （菌落數(shù)）ti-zn2（菌落數(shù)）抑菌率 （%）1451250188.902387944288.613391237890.03cck-8（全稱(chēng)為cell counting kit 8）是一種綜合能力很好的細(xì)胞活性檢測(cè)試劑，而利用cck-8試劑檢測(cè)的方法就是cck-8實(shí)驗(yàn)了。這種試劑的檢驗(yàn)原理是因?yàn)閏ck-8試劑中含有wst-8。wst-8在電子載體的作用下能被細(xì)胞線粒體中的脫氫酶還原為具有高度水溶性的橙黃色的甲臜物，生成的甲臘物的數(shù)量與活細(xì)胞的數(shù)量成正比，通過(guò)酶標(biāo)儀測(cè)量細(xì)胞液的吸光度值，便可檢測(cè)出待測(cè)細(xì)胞樣品的活性。與傳統(tǒng)的mtt相比，cck-8法具有很懂優(yōu)點(diǎn)，例如實(shí)驗(yàn)步驟少、操作簡(jiǎn)單、靈敏度高、實(shí)驗(yàn)結(jié)果更準(zhǔn)確、可重復(fù)性好。本次實(shí)驗(yàn)中我們將利用cck-8法對(duì)改性的鈦材進(jìn)行耐受性測(cè)試，進(jìn)而對(duì)改性后的鈦材的表征得到更全面的了解。材料耐受性測(cè)試的結(jié)果如圖3所示，從圖中對(duì)比未經(jīng)過(guò)處理的鈦材與經(jīng)過(guò)40 mg/ml的醋酸鋅溶液進(jìn)行層層組裝處理后的鈦材?？梢缘弥?，經(jīng)過(guò)改性的鈦材表面金黃色葡萄球菌的耐