應(yīng)用ROC曲線評(píng)價(jià)耐甲氧西林葡萄球菌的檢測(cè)方法

1、應(yīng)用ROC曲線評(píng)價(jià)耐甲氧西林葡萄球菌的檢測(cè)方法摘nbsp;要nbsp;目的:nbsp;nbsp;通過(guò)對(duì)耐甲氧西林葡萄球菌(MRS的常用檢測(cè)方法及實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行評(píng)價(jià)，選擇特異性和敏感性較 nbsp;nbsp;好的方法和理想的實(shí)驗(yàn)條件。方法：nbsp;nbsp;以PCR法檢測(cè)葡萄球 菌的mecA基因?yàn)椤敖饦?biāo)準(zhǔn)王震，周麗萍， 劉智成，莊建偉，汪海青 摘 要 目 的：通過(guò)對(duì)耐甲氧西林葡萄球菌(MR$的常用檢測(cè)方法及實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行評(píng)價(jià)，選擇特異性和敏感性較好的方法和理想的實(shí)驗(yàn)條件。方法： 以PCF法檢測(cè)葡萄球菌的mecA基因?yàn)椤敖饦?biāo)準(zhǔn)”，比較PBP2a交乳凝集試驗(yàn)法、頭抱 西丁( FOX瓊脂篩選法、苯唑西林

2、(OXA瓊脂稀釋法(MIC)、FOX紙片擴(kuò)散 法、OXA瓊脂篩選法、OXA紙片擴(kuò)散法檢測(cè)MRS勺敏感性和特異性。同時(shí)應(yīng)用 ROC曲線對(duì)實(shí)驗(yàn)方法及不同的實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行評(píng)價(jià)。結(jié)果：PCR法共檢出79株mecA基因陽(yáng)性菌株，陽(yáng)性率為73.8%。以PCR法為“金標(biāo)準(zhǔn)”，上述6種 方法的 ROC曲線下面積分別為0.994，0.964，0.955，0.946，0.932，0.862。結(jié)論： 選擇最佳實(shí)驗(yàn)條件，用兩種表型檢測(cè)方法作平行檢測(cè)，對(duì)可疑 結(jié)果用PBP2a交乳凝集試驗(yàn)或PCR法確診。關(guān)鍵詞 耐甲氧西林葡萄球菌 ; 藥敏實(shí)驗(yàn) ; 評(píng)價(jià)Application of ROC curve in theeval

3、uation of the methods for detectionof methicillin-resistantstrains of staphylococciWANG Zhe，n ZHOU Li-ping ， LIUZhi-cheng ， ZHUANG Jian-wei， WANG Hai-qing(1.Department ofClinical Laboratory ， the Second People ' s Hospital of Zhenjiang，Zhenjiang Jiangsu 212002;2. Department of Molecular Biol-ogy

4、，School of Medical Technology ， Jiangsu University， Zhenjiang Jiangsu212001;3. Department Nosocomial Infection Control， theSecondPeople' s Hospital of Zhenjiang， Zhenjiang Jiangsu212002， China )Abstract Objective： To evaluate of sixtests for detection of methicillin-esistant strains of staphyloc

5、occi. Then choosed the better methods and conditions for clinical experiment. Methods： To compare the sen-sitivity and thespecificity of the PBP2a latex agglutination method， efoxitin agarscreening method ， oxacillinagar dilution method( MIC)，cefoxitin disk diffusion method， oxacillin agar screening

6、 test andoxacillin diskdiffusion method for detecting of MRS using PCRamplification mecA gene as “ gold standard ” . Receiver op - erating characteristic( ROC) curve was drawn ， and the area under the curvewas calculated. Results： Therewere 79 isolates showing mecA-positive among 107 staphylococcal

7、isolates by PCR， the rate was73.8%. The area under ROC curve of the six methods was 0.994，0.964， 0.955， 0.946， 0.932， 0.862 respectively.Conclusion： Foradvancing the sensitivity and the specificity， two methods should betested simultaneously.If the results were conflicting， the PCRassay or PBP2a lat

8、ex agglutination test for detection of MRS should be operated.Key wordsMRS;antimicrobialsusceptibility test;evaluation近年來(lái)，隨著廣譜抗菌藥物的應(yīng)用，耐甲氧西林凝固酶陰性葡萄球菌（MRCNS的分離率逐漸增高、耐藥 性不斷增強(qiáng) 1，據(jù)報(bào)道該菌對(duì)苯唑西林的耐藥率達(dá) 70%以上 2，因此，對(duì)臨床分離的葡萄球菌進(jìn)行耐甲氧西林葡萄球菌（MRS檢測(cè)具有非常重要的臨床意義。目前臨床實(shí)驗(yàn)室對(duì) MRS的常用表型檢測(cè)方法有苯唑西林（OXA紙片擴(kuò)散法、OXA瓊脂稀釋法（MIC）、OXA瓊脂篩選法，2

9、004年美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)（NCCLS推薦使用含30卩g /片的頭抱西?。‵OX進(jìn)行紙片擴(kuò)散試驗(yàn)3，也有報(bào)道用FOX瓊脂篩選法進(jìn)行檢測(cè)4。而判斷MRS勺“金標(biāo)準(zhǔn)”，仍是PCR法檢測(cè)葡萄球菌mecA基因，或檢 測(cè)該基因編碼的青霉素結(jié)合蛋白（PBP 2a，但由于實(shí)驗(yàn)條件限制及試劑價(jià)格昂 貴，這兩種方法在一般基層實(shí)驗(yàn)室難以開(kāi)展。而表型檢測(cè)法仍然是大部分實(shí)驗(yàn)室的首選方法，但其實(shí)驗(yàn)影響因素較多，且各實(shí)驗(yàn)室之間檢測(cè)條件及判斷標(biāo) 準(zhǔn)不一，使結(jié)果缺乏可比性。本文對(duì) 107株臨床送檢標(biāo)本中分離的 CNS以PCR 法擴(kuò)增mecA基因片段作為“金標(biāo)準(zhǔn)”，對(duì)不同實(shí)驗(yàn)條件下的多種表型檢測(cè)方法 進(jìn)行檢測(cè)，利用RO

10、C曲線進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)。1材料和方法1.1 材 料1.1.1 菌株來(lái)源葡萄球菌臨床分離株 107株，從 2005年 1 月至 2006年 6月期間由本室及江蘇大學(xué) 附屬 醫(yī)院檢驗(yàn)科、江蘇大學(xué)附屬人民醫(yī)院檢驗(yàn)科從臨床標(biāo)本中留取，所有菌株按全 國(guó)臨床檢驗(yàn)操作規(guī) 程第二版鑒定到種，包括表皮葡萄球菌 51 株、溶血葡萄 球菌 16株、腐生葡萄球菌 10株、人葡萄球菌 6 株、模仿葡萄球菌 5株、頭 狀葡萄球菌 5株、耳葡萄 球菌 4株、華納葡萄球菌 4株、孔氏葡萄球菌 3 株、木糖葡萄球菌 3 株。質(zhì)控菌株為金黃色葡萄球菌 ATCC 25923（ MSSA）、 ATCC2921（MSSA，購(gòu)于浙江杭州天和

11、微生物有限公司。JS0405 （MRSA由江蘇省臨床檢驗(yàn)中心程梅老師提供。1.1.2試劑及儀器OXA紙片（1 卩 g/ 片），F(xiàn)OX紙片（30 卩 g/ 片），Mueller-Hinton（MH 瓊脂為Oxoid 公司商品。OXA FOX抗生素標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)于中國(guó)藥品生物制品檢定所;抗PBP2aK乳凝集試劑為法國(guó)生物梅里埃公司商品（批號(hào)：796773801） ;PCR所需的各種試劑均為TAKARA公司商品，引物參照文獻(xiàn)由寶生物工程（大連）有限公司合成5， P1:5 5 -GTA GAA ATG ACT GAA CGT CCG ATA A3', P2:5 5 -CCA ATT CCA CAT

12、TGT TTC GGT CTA A-;儀器: Hettich- UNIVERSAL 16型 低溫高速離心機(jī)，德國(guó)Mastercycler Perso nal 5332型PCRT增儀。1.2方法1.2.1 OXA紙片擴(kuò)散法采用 K-B 法，把 0.5 麥?zhǔn)蠁挝粷岫鹊木鷳乙悍謩e均勻涂布于普通 M-H瓊脂以及加入1% 2% 3% 4% NaC1的 M-H瓊脂表面上，貼 OXA氏片（1 卩g/片），置30E和35C于24 h和48 h兩個(gè)時(shí)點(diǎn)孵育后，對(duì)著透射光線仔 細(xì)觀察，測(cè)量抑菌環(huán)直徑，CNS以18 mm為敏感，w 17 mm 為耐藥。質(zhì)控菌 株為金黃色葡萄球菌ATCC259231.2.2 OXA瓊

13、脂稀釋法將0.5 麥?zhǔn)蠁挝粷岫鹊?菌懸液用無(wú)菌生理鹽水 10倍稀釋后，接種在 OXA 濃 度（卩 g/ml ）分別為 0.125，0.25，0.40，0.50，0.60，0.70，0.80，1.0， 2.0，4.0，6.0，8.0并含2% NaCl的MH瓊脂上，接種量大約為 104 CFU, 35C培養(yǎng)24 h，仔細(xì)觀察，判定MICo質(zhì)控菌株為金黃色葡萄球菌ATCC292131.2.3 OXA瓊脂篩選法將0.5麥?zhǔn)蠁挝粷岫鹊木鷳乙悍謩e點(diǎn)種在 OXA濃度為 0.40, 0.50, 0.60，0.70，0.80，1, 2, 4，6卩g/m1并含4%NaC的MH®脂上，35 C培養(yǎng)48 h

14、，仔細(xì)觀察，只要有一個(gè)菌落生長(zhǎng)即判為陽(yáng)性。質(zhì)控菌株為金黃色葡萄球菌ATCC29213用不同OXA濃度所檢測(cè)的結(jié)果，計(jì)算ROCS線下面積，選擇面積最大時(shí)的 OXA濃度作為瓊脂 篩選法的最適藥物濃度。1.2.4 FOX 紙片擴(kuò)散法采用普通M-H瓊脂，培養(yǎng)溫度為35 C,其他操作同苯唑西林紙片擴(kuò)散法。判斷標(biāo)準(zhǔn)：CNS以抑菌環(huán)直徑25 mm為敏感，w 24 mm為耐藥。質(zhì)控菌株為金黃色葡萄球菌 ATCC 25923。1.2.5 FOX 瓊脂篩選法參照文獻(xiàn) 4進(jìn)行。頭抱西丁的濃度分別為1, 2, 4, 8, 16卩g/m1。平板上只要有一個(gè)菌落生長(zhǎng)即判為MRS1.2.6抗PBP2at乳凝集法操作嚴(yán)格按說(shuō)

15、明書進(jìn)行。1.2.7 PCR 反應(yīng) 參照文獻(xiàn) 5操作，以 310 bp處 出現(xiàn)區(qū)帶判為mecA基因陽(yáng)性。金黃色葡萄球菌ATCC25923( MSSA為陰性對(duì)照， JS0405(MRS)A 為陽(yáng)性對(duì)照。1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS10.0統(tǒng)計(jì)軟件繪制ROCS線并計(jì)算曲線下面積。本文以O(shè)XA瓊脂稀釋法為例作圖，其他方法圖略。2結(jié)果2.1 mecA基因及PBP2a檢測(cè)結(jié)果107株CNS中檢出mecA基因陽(yáng)性為79株，陰性28株。陽(yáng)性檢出率為73.8%。以mecA基因 檢測(cè)結(jié)果作為“金標(biāo)準(zhǔn)”,PBP2at乳凝集法的敏感性為98.7%(78/79)，特異性為100% (28/28 )。其ROCS線下面

16、積為0.994。2.2 OXA紙片擴(kuò)散法檢測(cè)結(jié)果孵育24h與48 h的結(jié)果基本一致；相同條件下30 C比35 C特異性高；用不同NaCI 濃度的MH 瓊脂置30E孵育24 h檢測(cè)，其ROCS線下面積分別為：S普通 MH =0.734， S1%NaCI=0.807， S2%NaCI=0.862 ， S 3%NaCI =0.843，S4%NaCl=0.8302.3 OXA瓊脂稀釋法檢測(cè)結(jié)果按CLSI / NCCLS 2005 標(biāo)準(zhǔn) 6, CNS以 MIC <0.25 卩 g/m1 為敏感，0.50 卩g/m1為耐藥作為判斷標(biāo)準(zhǔn)，有2株MIC處于0.25和0.50卩g/m1之間，而無(wú)法判斷其敏

17、感性。去除該 2 株后的敏感性為 98.7%(76/77)，特異性為 75.0% (21/28 )。通過(guò)ROCS線發(fā)現(xiàn)本次OXA瓊脂稀釋法的折點(diǎn)為0.70 卩g/m1，其曲線下面積為0.955，見(jiàn)圖1。如果以w 0.25卩g/m1為敏感， >0.70卩g/m1為耐藥作為判斷標(biāo)準(zhǔn)，有 13株MIC處于0.25和0.70卩g/m1 之間，而無(wú)法判斷其敏感性，去除該 13株后敏感性為 98.6% (71/72) ，特異 性為95.5% (21/ 22 )。2.4 OXA瓊脂篩選法檢測(cè)結(jié)果OXA濃度分別為 0.40, 0.50, 0.60 , 0.70 , 0.80 ,1 , 2,4, 6 卩

18、g/m1 時(shí)，ROC曲線下面積為 0.869 , 0.856 , 0.879 , 0.932 , 0.862 , 0.818 , 0.799 , 0.729 , 0.729。在 0.70 卩 g/m1 時(shí)，ROCS線下面積最 大。有文獻(xiàn)報(bào)道最佳藥物濃度分別為 0.75卩g/m1和4卩g/m1 7, 8。2.6 FOX瓊脂篩選法檢測(cè)結(jié)果含1, 2,4, 8, l6卩g/m1頭抱西丁的瓊脂篩選法，其 ROCS線下面積分別是0.607 , 0.750 , 0.964 , 0.812 , 0.754。以含4卩g/m1頭抱西丁時(shí)的 ROCS線下面積最 大。與文獻(xiàn)報(bào)道的結(jié)果一致4。2.7 6種MRS表型檢

19、測(cè)法結(jié)果比較見(jiàn)表1。表1 6種MRS表型檢測(cè)法結(jié)果比較(略)3討論近幾年MRCN的檢出率及耐藥率逐年增高1,本研究結(jié)果也顯示 MRCN的檢出率高達(dá)73.8%。國(guó)內(nèi)外關(guān)于MRS勺檢 測(cè)方法報(bào)道較多，但 由于實(shí)驗(yàn)條件不一，各實(shí)驗(yàn)室之間的檢測(cè)結(jié)果缺乏可比 性8-12。表型檢測(cè)法及實(shí)驗(yàn)條件的選擇將直接影響到結(jié)果的準(zhǔn)確性，應(yīng)引 起臨床實(shí)驗(yàn)室關(guān)注。本研究對(duì)目前常用的MRS僉測(cè)方法及部分實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行評(píng)價(jià)，結(jié)果顯示，以PCR法作為“金標(biāo)準(zhǔn)”，PBP2a8交乳凝集試驗(yàn)的敏感性及特 異性最高，ROCS線下面積最大（0.994）;經(jīng)不同含藥濃度的FOX瓊脂篩選法 試驗(yàn)，以4卩g/m1作為最佳藥物濃度時(shí)，ROCS線下

20、面積最大（0.964 ）;在 OXA瓊脂稀釋法中，以0.50卩g/m1作為耐藥的判斷標(biāo)準(zhǔn)時(shí)，會(huì)出現(xiàn)假陽(yáng)性率偏高的情況，本次實(shí)驗(yàn)用 ROCS線得其折點(diǎn)在0.70卩g/m1，ROC曲線下面 積為0.955，如果以0.70卩g/m1作為耐藥的判斷標(biāo)準(zhǔn)，其特異性有所提 高，但是會(huì)出現(xiàn)較多結(jié)果處于中介值而無(wú)法判斷；由于FOX在體外能誘導(dǎo)PBP2a 的產(chǎn)生9，敏感性及特異性較高，且結(jié)果易讀，F(xiàn)OX紙片擴(kuò)散法被作為MRS僉測(cè)的首選表型檢測(cè)法，本次實(shí)驗(yàn)中，其ROCS線下面積為0.946;OXA瓊脂篩選法中OXA濃度為0.70卩g/m1時(shí)，ROCS線下面積最大（0.932 ），與有 關(guān)文獻(xiàn)一致7，有文獻(xiàn)報(bào)道最佳

21、藥物濃度為4卩g/m1 8，這是否與菌株 的地區(qū)差異有關(guān)，需進(jìn)一步探討；OXA紙片擴(kuò)散法是臨床實(shí)驗(yàn)室鑒定 MRS勺常用 方法，但由于該法影響因素多，從表型上進(jìn)行診斷，其結(jié)果有時(shí)不夠準(zhǔn)確，致 使其特異 性低于其他方法。本次實(shí)驗(yàn)在不同溫度，不同孵育時(shí)間的情況下， 用含不同NaCI濃度的MH瓊脂進(jìn)行試驗(yàn)，以30E，孵育24 h，NaCl濃度為2%寸的ROC曲線下面積最大（0.862 ）。綜上結(jié)果，作者認(rèn)為各實(shí)驗(yàn)室應(yīng)根 據(jù)自己的情況，選擇合適的檢測(cè)方法，標(biāo)化實(shí)驗(yàn)條件，并選用兩種以上的方法 進(jìn)行檢測(cè)。比如，本實(shí)驗(yàn)室采用頭孢西丁紙片擴(kuò)散法和苯唑西林（ 0.70 卩g/m1）瓊脂篩選法作為表型檢測(cè)方法，當(dāng)兩

22、種方法的結(jié)果出現(xiàn)不一致時(shí)，再 用PBP2aK乳凝集試驗(yàn)確定。從而在提高敏感性和特異性的同時(shí)，可以降低成 本和減輕工作量。參考文獻(xiàn) 1 呂火祥，沈禧瓊，潘立勇，等.19972001年耐甲氧西林葡萄球菌臨床分離率及耐藥性分析 J . 檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)， 2004， 19（ 3） :220-224. 2 Diekema DJ， PfaIIer MA ， Schmitz FJ ， et a1.Survey of in-fections due to StaphyIococcus species:frequency of oc-currence andantimicrobiaI susceptibiIity o

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