DNA技術(shù)在海洋食品物種鑒定中的應(yīng)用

1、hereditas beijing 2010 年 6 月 326: 555560 issn 0253-9772 綜 述 收稿日期: 200909修冋日期:20100103基金項(xiàng)目:廣東海洋大學(xué)博士啟動基金項(xiàng)目編號0712130資助 作者簡介:張 麗1976女講師聘士研究方向生物技術(shù)與動物育種。e-mail: 通訊作者：劉書成 1977 男 副教授 博士研究方向水產(chǎn)食品學(xué)。e-mail: l doi: 10.3724/sp.j.1005.2010.00555 dna技術(shù)在海洋食品物種鑒定中的應(yīng)用張麗1張良2劉書成2張義軍3韓藝4 1.廣東海洋大學(xué)農(nóng)學(xué)院 湛江524025 2.廣東海洋大學(xué)食品科技

2、學(xué)院湛江524025 3.河南省內(nèi)黃縣安鄉(xiāng)農(nóng)業(yè)服務(wù)中心安陽456300 4.河南省鹿邑縣畜牧局周口 477200摘要：隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展海洋食品物種鑒定方法由原來的 蛋白質(zhì)水平深入到了 dna水平。目前應(yīng) 用于海洋食品物種鑒定的dna技術(shù)主要是finsforcnsically informative nucleotide sequencings pcr-rflp和物種特異性pcr標(biāo)記技術(shù)等 能夠?qū)崿F(xiàn)對新鮮、冰凍、腌制 或灌裝食品物種進(jìn)行鑒定而対混合樣本的鑒足及量化分析是尚待解決的一個問題。基因數(shù)據(jù)庫對物種鑒疋 的影響也越來越大是海洋加工食品物種鑒定可利川的另-種重耍信息資源。文章綜述了

3、dna技術(shù)在海洋 食品物種罄定中的應(yīng)用研究進(jìn)展 并展望dna技術(shù)在海洋食品檢測中的發(fā)展趨勢。關(guān)鍵詞:dna技術(shù) 海 洋食品 物種鑒定 dna-bascd methods for identification of seafood species zhang u1 zhang liang2 liu shu-cheng2 zhang yi-jun3 han yi4 1. agricultural college guangdong ocean university zhanjiang 524025 china 2. college of food science and technology gu

4、angdong ocean university zhanjiang 524025 china 3. anxiang agricultural service center neihuang county anyang 456300 china 4. luyi farming bureau henan province zhoukou 477200 china abstract: with the development of molecular biotechnology methods for identification of seafood species arc developed

5、from protein to dna. at present the main dna-bascd methods for species identification are fins pcr-rflp and spe-cific-pcr which have been used to identify the species of fresh frozen and pickled or canned seafood. however qualita-tive and quantitative methods for identification of the mixed seafood

6、species remain to be resolved. the gene databases play an important role in identifying species and are valuable infonnation resources for identification of seafood species. in this paper recent progresses of major dna-bascd methods for identification of seafood species arc reviewed and the pcrspcc-

7、tivcs of this field arc discussed. keywords: dna biotechnology seafood species identification 曲丁-海洋仗品具冇較高的營養(yǎng)價值 近些年來國際上海洋食品的消費(fèi)逐漸上升。一些商家為了迫求高的商業(yè)利潤便在海洋加工食品中摻假造假 以低價海洋食品代替高價海洋食品岀售一方面大大損害了消費(fèi)者的利益另一方面也造成了不正當(dāng)?shù)纳虡I(yè) 競爭。為杜絕此類現(xiàn)象的發(fā)生國際上很多556 hereditas beijing 2010第32卷國家都制定了標(biāo)簽法 規(guī) 定在海洋食品標(biāo)簽中明確海洋食品的種類和來源1。然而摻假造假的判定和標(biāo)簽制

8、度的冇效實(shí)施必須建 立在快速、準(zhǔn)確的海洋食品物種鑒定的基礎(chǔ)上。在海洋食品加工中物種的原始可識別形態(tài)特征消失這使 得物種的鑒別變得相對困難。因此迫切需耍一些靈敏的和可靠的檢測方法來鑒定加工海洋食品的物種來源。 目前 海洋食品物種的鑒定方法主耍有兩種。一種是蛋口質(zhì)鑒定方法 該法主耍采用等電聚焦電泳、毛細(xì)管 電泳、酶聯(lián)免疫吸附、高效液相色譜等技術(shù)12這些技術(shù)通常適用于新鮮或冰凍組織而海洋食品在加工過 程中的處理蛋白質(zhì)的生化特性及結(jié)構(gòu)完整性都被破壞因此對于海洋加工食品不能使用這些技術(shù)雖然酶 聯(lián)免疫吸附法elisa可以分析經(jīng)過高溫滅菌后的產(chǎn)品該法也已被用于許多魚種的鑒定但不足的是該方法 在區(qū)分十分相近物

9、種時還需耍挖掘更多新的抗體來吸附特異蛋白質(zhì)3。另一種是基t dna技術(shù)的分子生 物學(xué)方法利jij dna技術(shù)進(jìn)行物種鑒別比蛋口質(zhì)技術(shù)具有更高的特異性、靈戚度和可靠性其原因主耍有：1 dna比蛋口質(zhì)的耐熱性強(qiáng) 盡管dna分子在加工過程中存在降解 但仍能捉収出小片段的dna4 2山于遺 傳密碼的簡并性及非編碼區(qū)的存在dna能提供更多信息3dna技術(shù)不受組織類型、年齡及狀態(tài)等因素的 影響。因此利用dna技術(shù)鑒別加工海產(chǎn)品比傳統(tǒng)技術(shù)更具冇優(yōu)勢。目前基于dna技術(shù)的分子生物學(xué)方 法在鑒定海洋加工食品物種方面已成為研究的熱點(diǎn)。本文主要從dna序列、分子標(biāo)記技術(shù)、dna芯片及 其他技術(shù)、網(wǎng)絡(luò)dna信息資源等

10、方面綜述其在鑒別海洋加工食品物種中的應(yīng)用并展望了其發(fā)展趨勢。1 海洋食品物種罄定中用到的dna序列 利用dna技術(shù)罄定海洋加工食品基本上都是以pcr擴(kuò)增為基礎(chǔ) 因 此dna原材料、目標(biāo)dna片段的完整性、基因組變異率及序列長度等性狀是重要的決定因素。但是海洋 食品在加工過程中通常經(jīng)過加熱、高壓、輻射等處理dna發(fā)勺倆裂可供提取的dna減少因此選擇合 適的分析叢因是實(shí)現(xiàn)海洋食品物種鑒定的關(guān)鍵因索。一般在對經(jīng)過深加工的海洋食品進(jìn)行鑒定時選擇的基 因片段應(yīng)盡疑在300 bp以下。目前在海洋食品物種鑒定中選擇的dna類烈有：1線粒體dnae mtdna 的環(huán)狀結(jié)構(gòu)使其具冇更好的耐熱性和相對高的豐度 使

11、mtdna在海洋加工食品物種鑒定屮一般作為首選。 其屮 應(yīng)用最為普遍的是cytb基因 已經(jīng)被用于鑒醍別科engraulidae5.鮑科gadous6、鰥形目 pleuronectifbrmes7 鰻屈 anguilla8 和餚亞 h scombroidei 等 9c此外 線粒體 cyt b 及jt相鄰的（rna 序列 區(qū)域irnaglu-cyt blo、12s rrna基因、16s rrna叢因11、調(diào)控區(qū)dloop、細(xì)胞色素氧化酶亞基hi皐因 cytochrome oxidase subunitlll cox iii以及,coxiii和atpase之間的側(cè)翼區(qū)atco12均己用于海洋食品的物

12、 種鑒定2核基因。用于鑒定的核dna序列主要冇5s rrna基因、p53基因、its2位點(diǎn)the nuclear ribosomal internal transcribed spacer 2 locus18s rrna基因-actin 基因和主要組織相容性復(fù)合體 ii 1 基因。如：5s rrna 基兇已經(jīng)被用作鑒定魴、s3、鮭salmonidae和鯊selachii等幼蟲或卵的冷凍或讎裝食品13 14。對于生鮮 和冷凍等粗加工的海洋食品由于dna降解相對較少可以使用傳統(tǒng)的dna提取方法或根據(jù)情況稍作調(diào)整 對于深加工的海洋食品如罐頭可根據(jù)加工過程中所使用的配料 選擇合適的dna捉収方法4以保

13、證獲得 質(zhì)量較好的dna?？倆海洋食品物種的鑒別一般選擇mtdna的相關(guān)序列為研究對彖其次是核基因序列。 此外微衛(wèi)星標(biāo)簽已被用作人量海洋物種系統(tǒng)發(fā)育的研究目前還沒冇廣泛應(yīng)用于海洋食品物種的鑒別研究。 而基于巫復(fù)dna序列的多態(tài)性、多基因家族是另一類可利用的資源1。如肌動資白多基因家族已被用來 鑒定多種脊椎動物種類。肌動蛋口基因家族各基因編碼序列、內(nèi)含子序列長度及數(shù)量的差別有里用于海洋 食品物種罄定。2分子標(biāo)記技術(shù)在海洋食品物種鑒別中的應(yīng)用 據(jù)報(bào)道目前鑒定海產(chǎn)品的dna技術(shù)90 是 rflp、fins 或物種特異性 pcr 的研究。2finsforcnsically informative nu

14、cleotide sc-qucncing fins 第一次由bartlett and davidson于1992年 第6期 張麗等:dna技術(shù)在海洋食品物種鑒定中的應(yīng)用557提 出15。利用fins鑒定物種首先對特異dna片段進(jìn)行pcr擴(kuò)增獲得待檢樣品的dna序列然后利用種 系發(fā)生分析方法將該序列與數(shù)據(jù)庫中相關(guān)序列進(jìn)行比對與待檢樣木具有最小遺傳距離或最少核苜酸替代 數(shù)序列的物種表明待檢樣本屬于該種群或與其親緣關(guān)系最近。該方法的優(yōu)勢在于：不受種內(nèi)多態(tài)性的影響 能鑒定親緣關(guān)系較近的物種可以直接判斷食品中未知成分的種屬來源。其缺點(diǎn)是山于使用了通用引物食 品混合物中通常冇多種成分被同時擴(kuò)増會造成測序結(jié)

15、果的雜亂因此該方法不適用于混合物的鑒定。由于 fins是基丁核苻酸序列替換dna片段的選擇尤其巫要這些片段耍求高的種間變異及低的種內(nèi)變異。通 常選擇線粒體cytb基因進(jìn)行fins6。該方法已經(jīng)成功的用于鑒定多種海洋食品包括新鮮、冰凍、腌制或 灌裝的鮭、餾、m clupeiformes.沙丁魚、風(fēng)尾魚、頭足類產(chǎn)品。此外 利用該技術(shù)分析16s1rna基因 可 以區(qū)分多種新鮮、冷凍或加丁的頭足類動物16。2.2限制性片段長度多態(tài)性restriction fragment length polymorphism rflp利用pcr-rflp進(jìn)行物種鑒定 首先需要對目標(biāo)dna片段進(jìn)行pcr擴(kuò)增 然后選擇

16、能 識別及剪切特界dna序列的限制性內(nèi)切酚切割擴(kuò)增片段通過瓊脂糖凝膠電泳獲得不同物種的限制性酶切 片段圖譜。該方法花費(fèi)低操作簡單適宜常規(guī)的實(shí)驗(yàn)室分析已被廣泛應(yīng)川于海洋食品物種鑒定研究。 pcr-rflp技術(shù)鑒定海洋食品物種一般選用線粒體cytb基因17己經(jīng)用于鑒定的他類有魴亞目、比目角、 脩和鮭等。此外利用該技術(shù)通過分析其他序列也冇許多成功地例子11 18 19如：核5s rrna鑒定魴p53、 線粒體 16s rrna 及 coxiii鑒定人西洋鮭 salmo salar 線粒體 16s rrna 鑒定帶魚 trichiurus leptums cox iii 和atpase基因間的間隔序列

17、鑒定鰭亞m線粒體12s rrna基因鑒定格陵蘭犬比h魚hippoglossus stenolepis中的比目魚pleuronectiformes20 21。這些研究結(jié)果顯示pcr-rflp適丿u于分析親緣關(guān)系近的物種 和含多種物種的樣本包括新鮮、冰凍和經(jīng)歷不同程度加工的樣木共至高溫滅菌樣木。址然pcr-rflp 在物種鑒定中已成為一個重要的方法但也存在諸多缺點(diǎn)。首先主要是對種內(nèi)變異山于密碼子的簡并性 同-物種不同個體可能存在不同的限制片段酶切圖譜其次海洋食品加工過程中dna的降解也可能導(dǎo)致 岀現(xiàn)酶切片段的多態(tài)性。因此同一物種的大量個體必須經(jīng)過分析確定其在h標(biāo)位點(diǎn)是否存在種內(nèi)多態(tài)性 或者對至少兩

18、個限制性位點(diǎn)進(jìn)行分析以防誤判。2.3其他分子標(biāo)記技術(shù)有文獻(xiàn)報(bào)道利川單鏈構(gòu)彖多態(tài) 性single-strand conformation polymorphism sscp技術(shù)分析線粒體cyt b基因序列的變并雰定鮭、沙丁角.、 飾、鱗、金槍価、鰹katsuwonus pclamis和輻acipcnscridac22。但是sscp分析法比rflp的條件要求史窩 pcr- sscp的高靈敏性也要求其具冇更高的可重復(fù)性在同等條件下兩次分析沒冇差異且基準(zhǔn)樣品與未知 樣本必須總在同一凝膠上電泳。sscp既能分析小dna片段接近100 bp亦能檢測混合樣本。隨機(jī)擴(kuò)增多 態(tài)性 dnarandom ampli

19、fied polymoiphic dna rapd 和擴(kuò)增片段長度多態(tài)性 amplified fragment length polymorphism aflp這兩種標(biāo)記技術(shù)目前主要用于海洋生物群體遺傳圖譜繪制23 24尚未用于物種鑒定。 隨著研究的深入和擴(kuò)展這些技術(shù)都冇可能用于鑒定海洋加工食品的物種來源以期建立準(zhǔn)確的鑒定方法。 3 dna芯片及其他技術(shù)在海洋食品物種鑒別中的應(yīng)用近兒年一些研究嘗試將牛物芯片技術(shù)應(yīng)用于海洋食 品物種鑒定。kochzius等25以16s1dna為目標(biāo)序列 制作了可鑒定11種魚的dna芯片。雖然該芯片對 混合物的檢測還需要進(jìn)一步研究但在將芯片技術(shù)用于水產(chǎn)品鑒定的研究

20、中做了非常冇意義的探索。目前該 研究組計(jì)劃制備能同時鑒定50種魚的芯片。dna芯片結(jié)合了 pcr的靈敏度和芯片雜交的特界性是食品 成分鑒定的冇效方法。目前dna芯片在海洋食品物種鑒定中處于定性研究的階段尚沒冇定量分析的報(bào)道。 itoi等26利用taqman探針進(jìn)彳了成功地區(qū)分了 2類鱗。taqman探針是基于snps single nucleotide 558 hereditas beijing 2010第32卷polymorphism設(shè)計(jì)具備物種特異性。在pcr過程中 通過探針的熒光 強(qiáng)度顯示差異 從而證實(shí)物種存在與否 可用于新鮮樣木和加工處理樣木。hird等27于2005年首次報(bào)道利 用r

21、eal-time pcr技術(shù)定量分析魚類dna和罐頭肉制品對含量在7的成分能夠檢出表明研究人員己經(jīng)開 始利用dna技術(shù)對海洋仗品成分進(jìn)行量化分析。4網(wǎng)絡(luò)dna信息資源在鑒別海洋食品物種來源中的應(yīng) 用海洋食品物種的鑒定也能從數(shù)據(jù)庫的發(fā)展中受益。11前大多數(shù)食品中牛物種類分析依賴t genbank數(shù) 據(jù)庫。近年來許多在線資源已經(jīng)被專門用于海洋食品的鑒定研究如表1所示。魚類生命條碼資料庫the consortium for the barcoding of life fishbol己經(jīng)建立了至少4 500種海洋及淡水物種的條形碼 主要是利用 線粒體cyt b和cox i基因信息。魚類17科全書the

22、 regulatory fish encyclopedia rfe詳細(xì)收集了美國94種 重要的商品魚類信息每種魚的具體數(shù)據(jù)特征在網(wǎng)上可隨時查詢包括完整魚體和魚片的高分辨率影像、地 理學(xué)、分類學(xué)、命名法的信息以及預(yù)期的1ef蛋白質(zhì)譜帶和分析技術(shù)。除了蛋白質(zhì)譜帶外該機(jī)構(gòu)正在著手 公布這些魚的物種特異性dna譜帶和序列信息。yancy等28最近報(bào)道魚類百科全書正在完善的72種魚 的dna cox i條碼也可作為一個鑒定資源并h這些信息是經(jīng)過嚴(yán)格的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證能用于商品樣木。魚類 溯源數(shù)據(jù)庫fishtracc database將位于不同染色體位置和不同進(jìn)化率的基因聯(lián)介例如線粒體cyt b和視紫紅質(zhì) 基因提

23、供多種魚類的詳細(xì)信息魚類溯源數(shù)據(jù)庫所用的dna信息比研究cox i序列長以增加物種鑒定的 有效性。歐洲、中東和非洲食品與飲料技術(shù)中心azti-tecnalia建立了關(guān)于重要商品魚種的線粒體序列信息 的數(shù)據(jù)庫 包括5科：engraulidae、gadidae、merlucciidae> scombridae和zeidae。該數(shù)據(jù)庫可以提供至少 700個線粒體dna不同區(qū)域的序列 包括cytb、djoop、16srrna、12srrna和trna-val另外 還捉供 一個核dna位點(diǎn)tropomyosinc的序列信息。azti-tccnalia正在開發(fā)dna序列相應(yīng)的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品用于鑒 定海洋

24、ft illi o此外 諸如偵類起源遺傳學(xué)鑒定數(shù)據(jù)庫genetics for identification of fish origin的建立都將為海 洋食品物種鑒別提供更多的佶息。美國食品安全及應(yīng)用營養(yǎng)中心center for food safety and applied nutrition cfsan匯總了美國國內(nèi)以及進(jìn)口海產(chǎn)品名稱并在線公布以供查詢hl中:/www.cfsan.w/frfrfeo.htmlo 5結(jié)語與展望國際上利用dna技術(shù)鑒別海洋食品物種來源己經(jīng)彳j了大量的研究這為判定海洋食品摻假 造假捉供了技術(shù)支持其中一些方法冇較強(qiáng)的實(shí)用性己經(jīng)或町能作為海洋食品鑒定的標(biāo)準(zhǔn)

25、方法。但是關(guān)于 鑒別海洋食品物種來源的研究還面臨許多困難。首先據(jù)估計(jì)全世界人們消費(fèi)的海洋食品冇兩萬余種鑒別 方法主耍是利用蛋白質(zhì)和dna多態(tài)性現(xiàn)有的分析技術(shù)常建立于物種特有的指紋圖譜z上而很多物種貝 有相似的指紋圖譜或者同一物種的個體因種內(nèi)變異而顯示不同的指紋圖譜這使得鑒別變得異常復(fù)雜其 次 海洋食品加工過程中蛋口質(zhì)發(fā)生變性及dna部分降解 使加工海產(chǎn)品的分析方法變得尤為困難 第三 海洋食品加工過程中通常會加入植物油、各種添加劑和調(diào)味料等這些物質(zhì)一方血會彩響dna的冇效提取 另一方面可能會衣1魚類及海產(chǎn)品品種鑒定網(wǎng)絡(luò)資源在線資源靶dna網(wǎng)址魚類生命條碼資料庫線 粒體cox i基因http:/w

26、/魚類百科全巧線粒體cox 1某因 http:/www.cfsan.f(/frf7rfeo.html 魚類溯源數(shù)據(jù)庫線粒體 cyt b 和 rhodopsin 城因 歐洲、中東和非洲食品與飲料技術(shù)中心 cyt b d-loop 16s rna 12s rna trna-val 和tropomysinc基|大http:/www.azti.es/dna database価,類起源遺傳學(xué)鑒定數(shù)據(jù)庫微衛(wèi)星dna等 http:/fishgen.jrc.it/welcome.php3第6期 張麗籌:dna技術(shù)在海洋釦物

27、種鑒定屮的應(yīng)用559在pcr擴(kuò)増 過程中起到抑制劑的作川因此在物種鑒定之前要對dna的提取進(jìn)行優(yōu)化以保證提取出足夠量的dna 并h減少或消除pcr抑制劑 這些限制條件使dna相關(guān)技術(shù)在食品行業(yè)中的應(yīng)用變得相對 很難。目前利 用dna技術(shù)鑒別海洋食品物種的技術(shù)方法上還存在諸多挑戰(zhàn)如：對鬲度加工及混介物產(chǎn)品dna的修復(fù) 建立更簡便快捷和廉價的分析方法能同時對食品中品種繁多的物種進(jìn)行鑒定以及對混合樣本的鑒定及量 化分析等。因此基因芯片、芯片實(shí)驗(yàn)室、定量實(shí)時pcr技術(shù)以及物種特杲性引物多巫pcr技術(shù)等可能在 將來海洋食品物種來源鑒定中發(fā)揮作用。此外壟因數(shù)據(jù)庫收集整理的各種海洋食品物種的信息對海洋加i

28、-食品鑒定的影響將越來越大。參考文獻(xiàn) references: 1 moretti vm turchini gm bellagamba f caprino f. trace ability issues in fishery and aquaculture products. vet res commun 2003 27suppl. 1: 497-505. 2 civera t. species identification and safety of fish products. vet res commun 2003 27suppl. 1: 481189. 3 woolfe m primro

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