骨形成蛋白微球溫敏性凝膠復(fù)合系統(tǒng)的制備及釋藥特性研究

1、文檔來源為 :從網(wǎng)絡(luò)收集整理.word 版本可編輯.歡迎下載支持骨形成蛋白微球溫敏性凝膠復(fù)合系統(tǒng)的制備及釋藥特性研究 符旭東1,劉宏，湯韌，張孟佑(廣州軍區(qū)武漢總醫(yī)院藥劑科，武漢， 430070 ) 摘要 目的 考察了處方和制備工藝對人重組骨形成蛋白2 (rhbmp-2)微球釋放度的影響，并比較bmp微球和bmp微球溫敏性凝膠復(fù)合系統(tǒng)的體外釋藥特性。方法采用w/o/w型乳化溶劑揮發(fā)法以聚乳 酸-乙醇酸共聚物(plga)為材料制備空白微球，通過吸附 法制備rhbmp-2載藥微球。以單甲基聚乙二醇羥基乙酸共聚物( mpeg-plga )為材料 制備凝膠，采用夾心法酶聯(lián)免疫吸附法測定釋藥速度。結(jié)果微

2、球呈現(xiàn)三相釋藥模式，而微球凝膠劑體外釋藥曲線符合higuchi方程。采用 plga-cooh制備的rhbmp-2微球，其突釋明顯小于以plga為材料制備的微球，增加內(nèi)水相與油相 的體積比、在內(nèi)水相中加入氯化鈉均可以在一定程度上減小突釋。結(jié)論bmp微球溫敏性凝膠復(fù)合系統(tǒng)制備工藝，具有比 rhbmp-2微球劑更理想的體外釋藥特 性。關(guān)鍵詞：人重組骨形成蛋白-2;聚乳酸-乙醇酸共聚物；單甲基聚乙二醇-羥基乙酸共聚 物；微球；溫敏性凝膠；突釋preparation of recombinant human bone morphogenetic protein-2 loaded microspheres

3、/ thermosensitive hydrogels complex and its in vitro release characteristicfu xu-dong , liu hong , tang ren, zhang meng-you (wuhan general hospital of guanzhou command wuhan 430030, china)abstract : objective to examine the effects of formulation factors on in vitro release rate of recombinant human

4、 bone morphogenetic protein-2 (rhbmp-2) 1基金項目：湖北省科技攻手計劃 (2005aa301c38通訊作者：符旭東，女，副主任藥師 tel/fax:(027) e-mail:fuxudong2005loaded microspheres and compare drug release profiles of microspheres and microspheres/ thermosensitive hydrogels complex. methods blank microspheres were prepared with w/o/w emulsi

5、on solvent evaporation method.rhbmp-2 loaded microspheres was prepared with absorption method. thermosensitive hydrogels were prepared with mpeg-plga.enzyme-linked immunosorbent assay was used to determine drug content and in vitro release rater. esults the profiles of rhbmp-2 microspheres were char

6、acterized by three phase, while the in vitro release profile of rhbmp-2 microspheres/ thermosensitive hydrogels complex conformed to higuchi equation. the amount of rhbmp-2 released from microspheres in the initial burst phase was decresed markedly when plga-cooh was used to prepare microspheres ins

7、tead of plga. increasing the volume ratio of internal aqueous and adding nacl to internal aqueous phase could reduce initial releaseconclusion rhbmp2 -loaded microspheres/ thermosensitive hydrogels complex exerted a desirable release characteristic.key words recombinant human bone morphogenetic prot

8、ein-2; plga; mpeg-plga; thermosensitive hydrogels; microsphere； initial burst release牙周病是世界衛(wèi)生組織列為重點防治的、人類普遍罹患的口腔疾病之一，是成年人失牙的主要原因， 其治療的最終目標(biāo)是實現(xiàn)牙周組織包括牙槽骨、 牙骨質(zhì) 和牙周膜的完全功能性再生，而牙周組織再生的基礎(chǔ)是牙周膜細胞( pdlcs) ， 但在牙周損傷部位pdlcs 的來源非常有限，以致牙周組織很難達到有效地再生和重建。骨形成蛋白( bone morphogenetic protein ,bmp )是目前發(fā)現(xiàn)的唯一能在體內(nèi)誘導(dǎo)骨與軟骨的細胞因子

9、，業(yè)已證實bmpfg夠促進pdlc5曾殖及牙周組 織的修復(fù) 1 ，但是 bmp 在體內(nèi)溫度和酶的作用下非常容易代謝失活，限制了其發(fā)展和應(yīng)用。尋找適宜的藥物遞送系統(tǒng)一直是bmp勺研究熱點之一，以生物可降解材料制備的微球或納米粒制劑作為bmp牙周袋局部治療的載體受到研究者的青睞， 但是這種給藥系統(tǒng)體外釋藥曲線并不是非常理想， 表現(xiàn)出一定的突釋或不 規(guī)則的三相釋藥模式23 ，而且微粒制劑用于牙周袋局部給藥還存在使用不便等缺點。筆者以聚乳酸-乙醇酸共聚物為材料制備 bmp散球，通過處方和工藝的優(yōu) 化在一定程度上可降低突釋；將制備的微球分散在以聚乙二醇單甲醚/聚乳酸-乙醇酸共聚物（ mpeg-plga

10、） 為材料制備的凝膠中， bmp 在微球凝膠復(fù)合系統(tǒng)中的釋藥速度得到進 一步改善 。 mpeg-plga 具有溫敏性 ， 一定濃度的 mpeg-plga 水溶液在室溫下為自由流動的液態(tài)可以方便醫(yī)生用藥， 在體溫下可 發(fā)生膠凝而起到控制藥物釋放的作用。本文主要報道了處方和制備工藝對bmp微球以及 bmp 微球凝膠劑體外釋藥曲線的影響。 1 材料和儀器骨形成蛋白（北京環(huán)亞泰克生物醫(yī)學(xué)技術(shù)有限公司） ；聚（乳酸乙醇酸）共聚物50/50 （plga乳酸：乙醇酸比例為50:50,分子量為10000,山東省醫(yī) 療器械研究所）；端竣基聚乳酸羥基乙酸共聚物（plga-cooh，酸：羥基乙酸 比例為 50:50

11、, 分子量為 10000， 山東省醫(yī)療器械研究所） ， 聚乙烯醇（pva 124，日產(chǎn)進口分裝，北京化學(xué)試劑公司） ； mpeg-plga （la:ga:eo 的比例是 8： 2： 1，分子量4000-5000， peg 分子量1000，濟南岱罡生物技術(shù)有限公司）； bmp-2elisa試劑盒（武漢博士德試劑公司）。數(shù)顯式電動攪拌器 （上海司樂儀器有限公司） ； jy9202d 超聲波細胞粉碎機 （寧波新芝生物科技股份有限公司） ； sk 1 快速混勻器 （常州國華電器有限公司） ； uv-260 型紫外分光光度計 （日本島津公司） ； shz 82恒溫振蕩器 （常州國華電 器有限公司） ；

12、bx-50 光學(xué)顯微鏡 （日本 olympus 公司） ； s 450 掃描電鏡 （日 本 hitachi 公司） ； alpha1-4 冷凍干燥機（ christ, 德國） 。2 實驗方法2.1 bmp 微球的制備空白微球采用 w/0/w乳化溶劑揮發(fā)法制備，取適量水加入到2ml含有200mg plga勺二氯甲烷中，冰浴條件下超聲 30s,然后將其倒入15ml 3 %的pva溶液 中，冰浴條件下600rpm攪拌10min后，將轉(zhuǎn)速降至300rpm加入35ml水，在室 溫下繼續(xù)攪拌4h,然后過濾，洗滌，真空五氧化二磷干燥 48h。bmpt球通過吸附法載藥，將10mg空白微球混懸在100d含50聞

13、ml-1的 bmp2.5%甘氨酸緩沖液中，4c下吸附24h后冷凍干燥。2.2 bmp 微球凝膠的制備稱取 mpeg-plga 4g 置于 20ml 水中，攪拌后靜置于4冰箱中，并時時振蕩，待mpeg-plga充分溶脹后，即得20%mpeg-plga水凝膠。取10mg載 藥微球，加入2.5ml凝膠，在冰浴條件下充分混勻，即得含 bmp 2仙g ml-1的微 球凝膠。2.3 bmp 微球及微球凝膠劑體外釋放度的測定 4將載有5仙bmp的微球分別混旋在2.5ml的0.1mol l-1 ph7.4的磷酸鹽緩沖 液、 10和 20的 mpeg-plge 水溶液中，精密量取0.1ml 分別置于 1ml 的

14、離心管中， 加入 1 ml ph7.4 的磷酸鹽緩沖液， 置于恒溫振蕩器中， 振蕩速度為 100r ?min-1、溫度為（37±1） c,分別在 0.5h、1、3、5、7、14、21 和 28d 取樣， 2000rpm離心10min后，棄掉上清夜，沉淀物中加入1mlpbs,超聲15min,2000rpm 離心 10min 后， 取上清液 0.lml 按 1:10 比例稀釋后， 采用夾心法酶聯(lián)免疫吸附法測定樣品中殘留的藥物， 通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計算bmp 的含量， 該方法的檢測范圍 62.5-4000pg/ml,每份樣品平行測定2次。釋放度為釋放前后系統(tǒng)中的藥物含量之 差與釋放前系統(tǒng)的藥物含

15、量的百分比。2.4 微球粒徑及表面形態(tài)觀察用光學(xué)顯微鏡及掃描電鏡觀察微球的外觀形態(tài)，測定不少于 200 個的粒徑， 計算算術(shù)平均粒徑。 3 結(jié)果與討論3.1 內(nèi)水相與油相的體積比對bmp 微球初始釋藥行為的影響以plga50/50為材料，考察當(dāng)內(nèi)水相與油相的體積比分別為1:5、1:10和1:20時微球的形態(tài)和釋藥行為。 如圖 1 所示， 隨著內(nèi)水相與油相的體積比的增加， 微 球的粒徑?jīng)]有明顯的變化（大約在 2030而，但是微球表面的孔洞增加5,微 球在0.5h3d的釋放度降低。這可能因為 bmp!通過吸附作用載藥的，隨著內(nèi) 水相體積相對減少，微球內(nèi)部和表面的孔洞減少（見圖2）,微球與bmp容液

16、接觸面積減少，bmp被吸附的量減少，沒有被吸附的 bmps釋藥初期很快擴散到釋 放介質(zhì)，微球的突釋增加。4文檔來源為：從網(wǎng)絡(luò)收集整理.word版本可編輯.歡迎下載支持80兩度放釋積累4000.52472t/h口內(nèi)水相：油相1 : 5內(nèi)水相：油相1 : 10 口內(nèi)水相：油相1: 20圖1內(nèi)水相與油相的體積比對 bmp微球072h釋藥行為的影響圖2內(nèi)水相與油相的體積比對 bmp微球形態(tài)的影響內(nèi)水相和油相的體積比 a 1 :5 b 1 :10 c 1 :203.2 內(nèi)水相中氯化鈉含量對bmp微球初始釋藥行為的影響將內(nèi)水相與油相的體積比固定在1:5,用10%的氯化鈉溶液替代水作為內(nèi)水 相，可以發(fā)現(xiàn)微球

17、表面的孔洞明顯增加（如圖 3所示），因為隨著內(nèi)水相滲透壓 增高，外相的水更容易進入微球的內(nèi)部，表面的孔洞明顯增加（見圖4）,和“3.1 項下觀察到的結(jié)果相似微球在 0.5h3d的釋放度顯著降低。這可能同樣是因為 bmp1通過吸附載藥，微球內(nèi)部和表面的孔洞為bmp容液的滲透提供了很多的通道，有利于藥物的吸附口未加naclt/ 含10%氯化鈉o圖3內(nèi)水相中氯化鈉含量對bmp微球072h釋藥行為的影響bmp微球形態(tài)的影響圖4內(nèi)水相與油相的體積比對a內(nèi)水相中未加氯化鈉b內(nèi)水相中含10%氯化鈉3.3 plga及plga-cooh 對bmp微球釋放度的影響如圖5所示，采用plga-cooh備的微球在0.5

18、h3d的釋放度明顯低于plga 微球，這是因為bmp1一種堿性蛋白（等電點在 9.0左右），可與plga-cooh 子鏈中的竣基可以發(fā)生離子相互作用而使 bmpm附量增加6,因此plga-cooh 球中未吸附的bmp®少，突釋明顯降低。60外度放釋積累50403020100 10.52472t/hli plga plga-cooh圖5 plga種類對bmp微球072h釋藥行為的影響3.4 mpeg-plga濃度對微球凝膠劑中bmp釋放度的影響如圖6所示，bmp微球表現(xiàn)出三相釋藥模式7:01d的快速釋放期。這 是由于表面未吸附藥物快速溶解所導(dǎo)致的，約有30%左右的藥物釋放；第1d 5d

19、的時滯期藥物釋放速度非常緩慢，這是因為吸附于微球表面的藥物已經(jīng)釋放 完畢，而plga的降解速度較慢，分子量為12.1kda的bmp很難從微球中擴散 出來；第5d14d后釋藥速度明顯加快，是由于隨著 plga逐漸降解成水溶 性小分子，微球內(nèi)部和表面的孔隙增大，為藥物的擴散提供了更多通道。bmp微球凝膠劑沒有表現(xiàn)出明顯的三相釋藥模式，體外曲線符合higuichi方程，q 15.542d 6.6631 r=0.9884。其突釋明顯低于微球劑，而在15d的釋藥速度 又略快于微球劑，可能是混懸在凝膠中的微球就像是包上了一層衣，高粘度的凝膠層，降低了微球上未被吸附的bmp向介質(zhì)擴散的速度。bmp微球凝膠劑

20、在5 14d也沒有像微球劑那樣呈現(xiàn)快速釋放的特征， 這是因為凝膠層阻止了水分的滲 透，plga降解速度減慢所致。t/dt微球tl微球凝膠”度放釋積累圖6 mpeg-plga濃度對bmp微球釋藥曲線的影響4結(jié)論本文比較了 bmp散球和bmp散球凝膠劑的體外釋藥特征，同時還考察了處方 和制備工藝對bmpk藥微球釋放度的影響。研究表明bmpt球呈現(xiàn)三相釋藥模式， 而bmp散球凝膠劑體外釋藥曲線符合 higuchi方程，控釋效果更理想。研究結(jié)果 還顯示采用plga-cooh備的bmp散球，其突釋明顯小于以 plgaj材料制備的 微球，增加內(nèi)水相與油相的體積比、在內(nèi)水相中加入氯化鈉均可以在一定程度上 減

21、小突釋。參考文獻1趙征，張廣耘.bfgf和rhbmp對牙周膜細胞增殖和膠原酶水平的影響d.青 島：青島大學(xué)，2002.2 schrier ja.,deluca pp. recombinant human bone morphogenetic protein-2 bingding and incorporation in plga microsphere delivery systemsjpharm develop and tech1999,4(4):611621.3 schrier ja.,deluca pp.porous bone morphogenetic protein-2 microspheres: polymer binding and in vitro releasej. aaps pharmscitech 2001,2(3) article174 chung yong