張繼瑞生物育種

1、微生物育種技術(shù) 匯報人：張繼瑞匯報人：張繼瑞主要內(nèi)容1、菌種誘變2、基因重組3、菌種篩選4、菌種高通量培養(yǎng)5、菌種檢測微生物育種工作技術(shù)包括構(gòu)建突變菌種庫和菌種篩選兩個主要任務(wù)。高通量育種技術(shù)一般流程：1）高突變庫的建立2）高通量培養(yǎng)3）高通量篩選4）高通量檢測微生物育種方法：自然選育，通過自然突變和富集篩選法，篩選那些含有所需性狀得到改良的菌株。誘變育種，根據(jù)育種需要,有目的地使用誘變因素，使菌株基因發(fā)生突變，以改良其性狀。 雜交育種，通過基因重組菌株可獲得新的遺傳型，從而具有新的優(yōu)良性狀。（原生質(zhì)體融合雜交技術(shù)）推理育種（代謝控制育種），根據(jù)微生物代謝產(chǎn)物的生物合成途徑和代謝調(diào)節(jié)機制，通過

2、人工誘發(fā)突變的技術(shù)篩選獲得改變微生物正常代謝途徑的突變株，從而人為地使目標代謝產(chǎn)物選擇性地大量合成和積累。 基因工程育種，有效地對親本性狀進行重組而在子代群體中產(chǎn)生極大的多樣性。各技術(shù)間相互交叉相互關(guān)聯(lián)，不斷完善。 1、菌種誘變1.1 常規(guī)誘變技術(shù) 物理誘變、化學(xué)誘變、生物誘變物理誘變：紫外線照射、 電離照射、 激光照射、微波、離子輻射等化學(xué)誘變劑：烷化劑、 堿基類似物、金屬鹽類、脫氨基等生物誘變:轉(zhuǎn)導(dǎo)、轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)座突變1.2 常壓室溫等離子體誘變育種 在誘變育種領(lǐng)域常用的大氣壓非平衡等離子體產(chǎn)生方式主要是：大氣壓介質(zhì)阻擋放電（APDBD）大氣壓射頻輝光放電（RF APGD） 面向生物技術(shù)應(yīng)用的

3、溫和RF APGD 等離子體稱為常壓室溫等離子體（ARTP）。ARTP 誘變育種儀，其核心部件是裸露金屬電極結(jié)構(gòu)的RF APGD 等離子體發(fā)生器。等離子體的主要組分是活性粒子。其顯著特點是突變率高、突變庫容大，而且ARTP工作氣源種類、流量、放電功率、處理時間等條件均可控，可改變儀器操作條件，提高菌種突變強度和突變庫容量。1.3 推理育種遺傳物質(zhì)的變異具有不定向性,生物合成受到多基因控制具有復(fù)雜性,可利用生物合成途徑和代謝調(diào)控的原理來指導(dǎo)和設(shè)計育種方案。常用的方法有：1）耐前體及其結(jié)構(gòu)類似物突變株的篩選2）耐自身產(chǎn)物及類似物突變株的篩選3）耐分解阻遏物突變株的篩選4）代謝途徑障礙突變株的篩選5

4、）其他,如形態(tài)突變株、耐磷酸鹽突變株、膜透 性突變株、耐金屬離子突變株的篩選1.4 易錯PCR突變易錯PCR 是指通過改變PCR反應(yīng)條件來調(diào)整PCR反應(yīng)中的突變頻率，降低聚合酶固有的突變序列的傾向性，提高突變譜的多樣性，使得錯誤堿基隨機地以一定的頻率摻入到擴增的基因中，從而得到隨機突變的DNA群體，最后用合適的載體克隆突變基因。其關(guān)鍵在于合適突變頻率的選擇。理想的堿基置換率和易錯的最佳條件主要依賴于突變的DNA片段的長度。連續(xù)易錯 PCR策略：連續(xù)反復(fù)地進行隨機誘變，使每一次擴增得到的正向突變累積而產(chǎn)生重要的有益突變。2、基因重組目的基因的失活常用等位替換。在細菌中通常需要閉合環(huán)狀的克隆載體介

5、導(dǎo)。而如果有外源線性DNA片段可直接與染色體中的靶基因進行同源重組。大多數(shù)細菌因為核酸內(nèi)切酶的存在而不能轉(zhuǎn)化線性DNA。敲除細菌基因可利用RecA重組系統(tǒng)。RecA 重組系統(tǒng)是大腸桿菌內(nèi)源性的同源重組體系, 它由RecA 和RecBCD組成。需要較長的靶基因同源序列, 還需構(gòu)建具有靶位點的質(zhì)粒。Red重組技術(shù)利用噬菌體Red系統(tǒng)介導(dǎo)來實現(xiàn)外源線性DNA片斷與細菌染色體靶基因進行同源重組。外源線性DNA通常是PCR產(chǎn)物、寡核苷酸片斷等, 在它們的兩翼各含有與染色體靶基因兩翼同源的序列40-60bp。Red重組技術(shù)省去了體外DNA酶切、連接等步驟, 使細菌染色體靶基因的敲除與替換操作相對簡單, 逐

6、漸成為基因功能探索以及新菌株構(gòu)建的有力手段。Red 重組系統(tǒng) 利用質(zhì)粒表達 噬茵體的3 個重組蛋白, 宿主菌就具有了同源重組的能力。設(shè)計的引物5 端有30- 50 bp 的擬敲除基因的同源臂, 3端為擴增引物, 以抗性質(zhì)粒為模板,擴增兩側(cè)含F(xiàn)RT 重組位點的抗性基因, 并將此線性片段電轉(zhuǎn)入具有重組功能的感受態(tài)細胞, 利用抗生素平板就可以篩選到陽性轉(zhuǎn)化體。 利用該重組系統(tǒng),可構(gòu)建特定位點基因缺失的大腸桿菌工程菌株。Red 同源重組不存在對RecA 蛋白的絕對依賴性,避免了RecA 蛋白引起的基因重排和隨機重組, 并且Red重組效率遠高于RecA 重組。Red 重組系統(tǒng)相對于宿主菌來說屬于外來的功

7、能單位, 任意限制表達或是存留于細胞中會對細胞造成損害。必須對Red重組系統(tǒng)的表達進行控制，可通過誘導(dǎo)型或者溫度敏感型啟動子控制下適量表達?，F(xiàn)在,微生物育種技術(shù)已從傳統(tǒng)的突變技術(shù)發(fā)展到基因誘變、基因重組、基因工程、代謝工程等,大大提高了微生物育種的效果。無論采用哪種育種方法,最終都需要依靠篩選技術(shù)才能從龐大的菌種庫中檢出目標菌種。因此,要想獲得優(yōu)良性狀的菌株,不僅要提高育種技術(shù),同時還要改進篩選技術(shù)。3、菌種篩選篩選就是應(yīng)用精心設(shè)計的各種模型,在成千上萬個微生物中,將所需要微生物鑒別出來。誘變產(chǎn)生高產(chǎn)菌株的頻率很低,因此可通過擴大篩選量,提高育種效率。篩選是決定菌種選育成敗的一個關(guān)鍵步驟。3.

8、1 隨機篩選法液體培養(yǎng)篩選法,即采用搖瓶逐個進行發(fā)酵培養(yǎng)并測定菌株的目標產(chǎn)量,該方法存在工作量大、周期長和成本高等缺點。其主要優(yōu)勢在于操作簡便易行，通用性較高，仍然被廣為使用。表面培養(yǎng)（平板）篩選法是以在固體培養(yǎng)基上生長的菌落進行的，檢測單個菌落的代謝產(chǎn)物分泌于培養(yǎng)基中形成的抑菌圈或用一種能與菌落代謝產(chǎn)物起顏色反應(yīng)的化合物形成的顯色圈。平板篩選法的通用性非常好：脂肪酶可以分解甘油三酯底物從而在菌落周圍形成透明圈；纖維素酶可以分解纖維素成為葡聚糖從而與剛果紅形成紅色暈圈；磷脂酶則可以分解卵磷脂形成白色沉淀圈。微孔板篩選法是對平板篩選法的一種改進，通常使用 96/384/1536 孔板對于突變庫中

9、的單個突變體進行檢測和篩選。微孔板篩選法優(yōu)勢在于能夠?qū)γ富盍M行準確定量，且可以進行步驟較復(fù)雜的酶反應(yīng)。由于其實驗流程相對固定，基本重復(fù)挑單菌落、移液、震蕩孵育、離心收集、加液反應(yīng)、酶標儀檢測等機械化操作，相對容易實現(xiàn)自動化，目前已有完整的全套篩選工作站，能夠一定程度上減少人力成本的投入。在定向進化策略中，突變體文庫的多樣性和高通量篩選方法的建立是成功的關(guān)鍵。突變體文庫越大，突變體數(shù)量越多，則越有希望篩選到所需要的突變體。對于這些龐大的突變體文庫，高通量的篩選是必需的。3.2 高通量篩選方法3.2.1 體內(nèi)篩選方法 根據(jù)蛋白質(zhì)功能與細胞表型之間的關(guān)聯(lián)關(guān)系來進行篩選。 營養(yǎng)缺陷型菌株篩選法一般要

10、經(jīng)過誘變、抗生素淘汰野生型、缺陷型菌株的檢出和鑒定等步驟。由于營養(yǎng)缺陷型菌株只有在添加了特別成分的培養(yǎng)基中才能生長，因此可以用來對合成這種成分的酶或者合成途徑進行高通量篩選。 酵母雙雜交其利用酵母的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機制來進行篩選。例如，將兩個功能域的編碼基因分別接上不同的蛋白質(zhì)編碼序列，一個是已知蛋白質(zhì)序列，另一個是未知、待篩選蛋白質(zhì)序列，構(gòu)建成融合表達載體。當兩個蛋白質(zhì)能相互作用時，可重組成有活性的轉(zhuǎn)錄激活子，開啟受其調(diào)控的啟動子表達下游的報告基因，通過報告基因的表達可篩選出能和已知蛋白相互作用的蛋白質(zhì)。當兩種蛋白質(zhì)之間的相互作用是由小分子化合物所介導(dǎo)時，酵母雙雜交體系被拓展為酵母三雜交體系，該體系

11、可用于篩選蛋白質(zhì)與小分子化合物之間的相互作用。 轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子篩選法調(diào)控蛋白是結(jié)合特定的DNA 調(diào)控序列，通過控制基因開啟和關(guān)閉來調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄的蛋白。調(diào)控蛋白通常與特定小分子化合物結(jié)合后發(fā)生構(gòu)象變化，從而改變其與相應(yīng)DNA 調(diào)控序列的親和力，激活或者阻遏該啟動子下游基因的轉(zhuǎn)錄。當酶催化生成的小分子化合物可以誘導(dǎo)特定調(diào)控蛋白使之啟動下游報告基因的轉(zhuǎn)錄和表達時，該調(diào)控蛋白可以用作該小分子化合物的信號分子，將該化合物在細胞內(nèi)的濃度與報告基因的表達強度關(guān)聯(lián)起來。 RiboswitchRiboswitch （生物核糖開關(guān)）篩選法核糖開關(guān)指的是mRNA一些非編碼區(qū)的序列折疊成一定的構(gòu)象，這些構(gòu)象的改變應(yīng)答于

12、體內(nèi)的一些代謝分子，從而通過這些構(gòu)象的改變達到調(diào)節(jié)mRNA轉(zhuǎn)錄的目的。這些核糖開關(guān)可將相應(yīng)小分子化合物在細胞內(nèi)的濃度用報告基因的表達強度呈現(xiàn)出來。 細胞內(nèi)熒光標記篩選法熒光標記是首選的高通量篩選標記，因為它可以用流式細胞分選儀進行篩選?？捎脽晒鈽擞浀孜?、產(chǎn)物或者酶的篩選方法用于定向進化。 熒光共振能量轉(zhuǎn)移兩個熒光基團，一個基團 (供體) 的發(fā)射光譜和另一個基團 (受體)的激發(fā)光譜有重疊部分，當它們的空間距離縮小(10 nm) 時，供體基團激發(fā)的能量被受體基團吸收，使得供體的熒光強度減小而受體的熒光強度增強。3.2.2 體外篩選方法盡管體內(nèi)高通量篩選方法應(yīng)用廣泛，它們?nèi)匀皇艿郊毎L壓力及底物跨

13、膜轉(zhuǎn)運等問題的限制。體外高通量篩選方法則可克服這些方面的限制因素，與體內(nèi)篩選方法相互補充。體外篩選主要是各種展示技術(shù)，即運用DNA 重組技術(shù)在噬菌體、細菌、真菌等表面展示外源蛋白 (突變體文庫)，篩選蛋白與蛋白或者蛋白與小分子之間相互作用。噬菌體展示技術(shù)噬菌體展示技術(shù)比較成熟，首先將多肽或蛋白質(zhì)的編碼基因克隆入噬菌體外殼蛋白結(jié)構(gòu)基因的適當位置，使之與外殼蛋白融合表達，融合蛋白隨子代噬菌體的重新組裝而展示在噬菌體表面。細胞表面展示技術(shù)細胞表面展示技術(shù)是通過將靶蛋白 (外源蛋白) 基因序列與特定的載體蛋白基因序列融合后導(dǎo)入細胞，從而使靶蛋白表達并定位在細胞表面的技術(shù)。核糖體展示技術(shù)核糖體展示技術(shù)也

14、是一種篩選功能性蛋白間相互作用的新技術(shù)，正確折疊的蛋白質(zhì)及其mRNA 同時結(jié)合在核糖體上，形成mRNA-核糖體-蛋白質(zhì)三聚體，該結(jié)構(gòu)使目的蛋白的基因型和表型聯(lián)系起來，當目的蛋白能與靶分子高特異性結(jié)合時，可以快速獲得其基因型。3.3 高通量篩選技術(shù)微流體技術(shù)微流體技術(shù)是在微觀尺度下控制、操作和檢測復(fù)雜流體的技術(shù)。微流體裝置被用來分離單個細胞和分選目標細胞。流式細胞術(shù)和細胞分選流式細胞術(shù)是從細胞群中定量分析成千上萬的單個細胞或懸浮顆粒的多個特征的一種方法。當經(jīng)熒光染色或標記的單細胞懸液放入樣品管中，被高壓壓入流動室內(nèi)。流動室內(nèi)充滿鞘液，在鞘液的包裹和推動下，細胞被排成單列，以一定速度從流動室噴嘴噴

15、出，在與細胞液流成90方向上，激光束照射液流，使細胞產(chǎn)生散射光和熒光。通過光學(xué)系統(tǒng)檢測并接收這些光學(xué)信號，同時轉(zhuǎn)換成電脈沖信號。電脈沖信號經(jīng)過計算機處理，得出每個細胞的多種信息參數(shù)。流式細胞術(shù)在微生物學(xué)和生物技術(shù)領(lǐng)域的最廣泛應(yīng)用就是細胞分選。液滴的偏轉(zhuǎn)被用來高通量的分選微生物細胞，由光束強烈的振動使液流產(chǎn)生的每一個液滴包含一個微生物細胞，包含目標微生物的液滴被偏轉(zhuǎn)到一個收集管或微量滴定板中。流式細胞術(shù)可以以104 cells/s 的速度對單個微生物細胞進行高通量的分析和分選。流式細胞儀還可以利用熒光抗體對感興趣的微生物進行快速定量的分選。熒光激活細胞分選（ FACS） 樣品進入流式細胞儀后，單

16、個細胞被鞘液流包裹并分隔成為單個液滴，排列成束狀后通過激光發(fā)射器（Focused Laser Beam）。同時，檢測器對細胞受到激發(fā)后產(chǎn)生的散射、熒光等信號進行記錄及反饋。流式細胞儀將會根據(jù)設(shè)置對細胞加上不同的電荷，細胞進入高壓偏轉(zhuǎn)板之后將會產(chǎn)生不同的路徑，而最終落入相應(yīng)的收集管中。 無論篩選何種類型的突變庫，應(yīng)用 FACS 方法的核心問題在于酶的基因型和表現(xiàn)型的偶聯(lián)，即保證熒光信號的強度與細胞所表達的酶活力一一對應(yīng)。大致方法可分為：熒光表面展示、熒光胞內(nèi)富集和熒光報告蛋白。 熒光激活微液滴分選（FADS） 通過“水-油-水”（water in oil in water, w/o/w）二級微液

17、滴對催化體系中的各個部分（酶、底物和產(chǎn)物）進行包裹的方式實現(xiàn)基因型和表現(xiàn)型的偶聯(lián)，而不需要針對不同的酶設(shè)計復(fù)雜的偶聯(lián)策略，因此具有很好的通用性。w/o/w二級微液滴可以通過流式細胞儀進行酶活性超高通量檢測，從而分選出符合要求的突變體。FADS 法關(guān)鍵在于微液滴，即微反應(yīng)器的生成。理想的微液滴應(yīng)當能夠滿足以下條件： 大小合適（受到后續(xù)分選系統(tǒng)的限制） 均一性高（便于單細胞酶活性的定量分析） 穩(wěn)定性好（在孵育和分選過程中保持形態(tài)） 生物相容性好（對酶反應(yīng)影響小且無細胞毒性）目前已知的 w/o/w 微液滴生成方法有機械分散法（包括勻漿儀法和膜擠出儀法）和微流控芯片技術(shù)。 目前,用于微生物菌種高通量篩

18、選的裝置及相關(guān)技術(shù)已不斷成熟發(fā)展,并且實現(xiàn)了培養(yǎng)基滅菌、倒平板、挑取單菌落、分裝培養(yǎng)基、對發(fā)酵過程進行監(jiān)控等一系列全自動篩菌過程,但篩菌的儀器設(shè)備昂貴。高通量篩菌技術(shù)的微型化、微量化、廉價化和自動化是未來高通量篩菌發(fā)展的主要方向。4、菌種高通量培養(yǎng)4.1 基于稀釋分離的培養(yǎng)板高通量培養(yǎng)法將樣品稀釋至痕量后，寡營養(yǎng)微生物可以不受少數(shù)幾種優(yōu)勢微生物競爭作用的干擾, 被培養(yǎng)的可能性會大大提高。采用小體積48 孔或96孔培養(yǎng)板分離培養(yǎng)微生物。結(jié)合熒光原位雜交技術(shù)，可從培養(yǎng)板各孔中針對性地檢測，大大提高了工作效率。培養(yǎng)板如何滿足菌體生長和產(chǎn)物生成不受影響,是首要解決的技術(shù)問題。4.2 微囊包埋培養(yǎng)技術(shù)一

19、種將單細胞包埋培養(yǎng)與流式細胞儀檢測結(jié)合為一體的高通量分離培養(yǎng)技術(shù)。微包埋技術(shù)是指利用天然或合成高分子材料通過化學(xué)法、物理法或物理化學(xué)法將另一種物質(zhì)包裹起來，形成一種具有半透性或密封囊膜的微型膠囊的技術(shù)。例如，微生物可先進行稀釋, 與融化的瓊脂糖混合,油乳化,形成直徑微滴。之后, 將包埋膠囊裝入層析柱內(nèi), 端口用濾膜封住, 低濃度的有機物培養(yǎng)液連續(xù)通過層析柱對包埋膠囊進行流態(tài)培養(yǎng), 未被包埋的游離細胞則隨培養(yǎng)液流出柱外。結(jié)合流式細胞儀進行檢測, 將長有單菌落的膠囊分選到加有豐富培養(yǎng)基的96 孔板中繼續(xù)培養(yǎng), 最終獲得純培養(yǎng)微生物。4.3 擴散盒高通量培養(yǎng)技術(shù)擴散盒由一個環(huán)狀的不銹鋼墊圈和兩側(cè)膠連

20、的孔徑為0.03 m 濾膜組成，濾膜只能有效地讓培養(yǎng)環(huán)境中的化學(xué)物質(zhì)通過而不地讓微生物細胞通過。一些環(huán)境中不可培養(yǎng)的微生物通過在擴散盒中反復(fù)培養(yǎng)后可以在培養(yǎng)基中生長，由此推斷在擴散盒中的孵化可以提高可培養(yǎng)的微生物物種的多樣性。4.4 中空纖維膜裝置高通量培養(yǎng)技術(shù)中空纖維膜裝置是由中空的纖維膜-聚偏二氟乙烯膜形成一個小室，每個裝置系統(tǒng)包括4896 個這樣的小室單元；該裝置的上部為注射器構(gòu)成的注射進樣口，在培養(yǎng)過程中下部浸在液相中，上部覆蓋一個罩子保持無菌狀態(tài)。將從環(huán)境中抽取的微生物樣品稀釋后注入小室，該裝置可以提供原位環(huán)境，繼而培養(yǎng)微生物。4.5 分離芯片高通量培養(yǎng)技術(shù)分離芯片是由包含有很多小孔

21、的平板構(gòu)成，在培養(yǎng)開始之前，將滅菌的中央板浸泡在微生物細胞懸浮液中，使每個小孔獲得一定數(shù)量的微生物細胞，微生物細胞的數(shù)量取決于稀釋的程度，當微生物細胞懸浮在液態(tài)瓊脂中，微生物細胞進入小的瓊脂球中凝固，被每個小孔分別獲取，從而與其他微生物細胞分離開來。然后用膜將板上的每一個區(qū)域覆蓋，最后將上下兩塊板釘好，形成多個密封的分散小室，在微生物原來的生存環(huán)境下進行原位培養(yǎng)。5、菌種檢測 由于高通量篩選模型是分子、細胞水平上的相互作用, 只有采用適當?shù)臋z測方法才能以可視化的形式反映出來。5.1 分光光度測量法和熒光檢測法兩者原理基本一致, 即通過測定物質(zhì)在特定波長處或一定波長范圍內(nèi)的吸收度來對物質(zhì)進行定性

22、和定量分析。在高通量篩選時,液態(tài)酶活測定一般采用96 孔板微量滴定法 , 目前已自動化，兼容機器手臂、液體處理系統(tǒng)、讀板，結(jié)果也非?？煽?。5.2 酶標儀法酶聯(lián)免疫檢測儀，其核心都是一個比色計,即用比色法來分析抗原或抗體的含量。 首先將抗原(或抗體)物質(zhì)吸附在樣品盤中(96 標準微孔反應(yīng)板)；再將待測樣品加入樣品盤；于是待測未知的抗體(或抗原)與包被的抗原(或抗體)相結(jié)合，成為抗體抗原復(fù)合物。當依次加入酶結(jié)合物和酶的底物時便產(chǎn)生呈色反應(yīng)，呈色程度與被檢測樣品中待測抗體(或抗原)的量相關(guān)，據(jù)此就可以得出定性或定量的檢測結(jié)果。酶標儀具有測定速度快、試劑用量少等特點。合理結(jié)合酶標儀、薄層色譜（TLC）

23、、（高效液相色譜） HPLC 和（超高效液相色譜）UPLC 等測定分析技術(shù)可以進一步提高篩選效率和通量性。 5.3 熒光標記檢測技術(shù) 除常規(guī)的熒光強度檢測外, 還有基于熒光猝滅現(xiàn)象的熒光猝滅檢測、測量熒光分子受偏振光激發(fā)后發(fā)射光偏振程度的熒光偏振檢測、測量由熒光供體向熒光受體能量轉(zhuǎn)移引起光強度變化的熒光共振能量轉(zhuǎn)移檢測和均相時間分辨熒光共振能量轉(zhuǎn)移檢測(HTRF)等。時間分辨熒光分析(TRF) 是一種非同位素分析技術(shù)，它用鑭系元素標記抗原或抗體，根據(jù)鑭系元素螯合物的發(fā)光特點，用時間分辨技術(shù)測量熒光，同時檢測波長和時間兩個參數(shù)進行信號分辨，可有效地排除非特異熒光的干擾。5.4 鄰近閃爍分析技術(shù)（SPA)SPA 技術(shù)主要采用一種鍵合有受體分子的熒光微球, 當同位素標記的配體與受體分子結(jié)合時, 放射性同位