第一章 植物組織培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室的構(gòu)建和操作技術(shù)

1、第一章 組培的基本條件及一般技術(shù)植物組織培養(yǎng)植物組織培養(yǎng) 第一章第一章 植物組織培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室的構(gòu)建植物組織培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室的構(gòu)建和操作技術(shù)和操作技術(shù) 第一章 組培的基本條件及一般技術(shù)第一節(jié)第一節(jié) 實(shí)驗(yàn)室及主要設(shè)備實(shí)驗(yàn)室及主要設(shè)備 第一章 組培的基本條件及一般技術(shù)主要內(nèi)容主要內(nèi)容 植物組織培養(yǎng)的設(shè)計(jì)原則 組培室的組成及其功能 無(wú)菌操作設(shè)備 常用工具 常用儀器設(shè)備第一章 組培的基本條件及一般技術(shù)組織培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室布局的總體要求便于隔離便于隔離便于操作便于操作便于滅菌便于滅菌便于觀察便于觀察第一章 組培的基本條件及一般技術(shù)實(shí)驗(yàn)室設(shè)計(jì)原則實(shí)驗(yàn)室設(shè)計(jì)原則：保證無(wú)菌操作，達(dá)到工作方便，防止污染。 實(shí)驗(yàn)室的大小應(yīng)取決于

2、工作的目的和規(guī)模實(shí)驗(yàn)室的大小應(yīng)取決于工作的目的和規(guī)模 按按組織培養(yǎng)流程組織培養(yǎng)流程來(lái)設(shè)計(jì)，避免某些環(huán)節(jié)倒來(lái)設(shè)計(jì)，避免某些環(huán)節(jié)倒排，引起日后工作混亂排，引起日后工作混亂 利用一定的設(shè)備、器材和特殊的實(shí)驗(yàn)室結(jié)利用一定的設(shè)備、器材和特殊的實(shí)驗(yàn)室結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)，達(dá)到嚴(yán)格無(wú)菌的條件構(gòu)設(shè)計(jì)，達(dá)到嚴(yán)格無(wú)菌的條件第一章 組培的基本條件及一般技術(shù)一、實(shí)驗(yàn)室設(shè)置及儀器設(shè)備 實(shí)驗(yàn)室是進(jìn)行組培研究的主要場(chǎng)實(shí)驗(yàn)室是進(jìn)行組培研究的主要場(chǎng)所，應(yīng)能滿足清洗、培養(yǎng)基制備、所，應(yīng)能滿足清洗、培養(yǎng)基制備、儲(chǔ)藏、無(wú)菌操作、培養(yǎng)、鑒定等多儲(chǔ)藏、無(wú)菌操作、培養(yǎng)、鑒定等多方面的工作。方面的工作。第一章 組培的基本條件及一般技術(shù)輔助實(shí)驗(yàn)室實(shí)驗(yàn)室組

3、成準(zhǔn)備室緩沖室無(wú)菌操作室培養(yǎng)室細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室溫 室生化分析實(shí)驗(yàn)室基本實(shí)驗(yàn)室基本實(shí)驗(yàn)室布局平面圖實(shí)驗(yàn)臺(tái)擱架培養(yǎng)架培養(yǎng)架培養(yǎng)架培養(yǎng)架藥品及儀器柜無(wú)菌臺(tái)無(wú)菌臺(tái)擱架拉窗冰箱擱 架水槽電爐門4.5m3.0m3.5m4.0m準(zhǔn)備室準(zhǔn)備室緩沖室緩沖室無(wú)菌室無(wú)菌室培養(yǎng)室培養(yǎng)室A Glimpse of Plant Tissue Culture第一章 組培的基本條件及一般技術(shù)（1）準(zhǔn)備室）準(zhǔn)備室 所需器具的清洗、干燥和保存所需器具的清洗、干燥和保存 培養(yǎng)基的配制和滅菌培養(yǎng)基的配制和滅菌 生理生化測(cè)定等生理生化測(cè)定等組織培養(yǎng)準(zhǔn)備實(shí)驗(yàn)室 1 1）洗滌間洗滌間 根據(jù)工作量的大小決定其大小，一般根據(jù)工作量的大小決定其大

4、小，一般面積控制在面積控制在30-50m30-50m2 2。在實(shí)驗(yàn)室的一側(cè)設(shè)置。在實(shí)驗(yàn)室的一側(cè)設(shè)置專用的洗滌水槽，用來(lái)清洗玻璃器皿。中專用的洗滌水槽，用來(lái)清洗玻璃器皿。中央實(shí)驗(yàn)臺(tái)還應(yīng)配置央實(shí)驗(yàn)臺(tái)還應(yīng)配置2 2個(gè)水槽，用于清洗小型個(gè)水槽，用于清洗小型玻璃器皿。如果工作量大，可以購(gòu)置一臺(tái)玻璃器皿。如果工作量大，可以購(gòu)置一臺(tái)洗瓶機(jī)。準(zhǔn)備洗瓶機(jī)。準(zhǔn)備1-21-2個(gè)洗液缸，專門用于洗滌個(gè)洗液缸，專門用于洗滌對(duì)潔凈度要求很高的玻璃器皿。此外還應(yīng)對(duì)潔凈度要求很高的玻璃器皿。此外還應(yīng)配置落水架、干燥箱、柜子、超聲波清洗配置落水架、干燥箱、柜子、超聲波清洗器等。地面應(yīng)耐濕并排水良好。器等。地面應(yīng)耐濕并排水良好。

5、 面積面積60平方米左右，配備的主要儀器設(shè)平方米左右，配備的主要儀器設(shè)備有備有 ：冰箱、天平、微波爐、：冰箱、天平、微波爐、pH計(jì)、培養(yǎng)計(jì)、培養(yǎng)基分裝器、藥品柜、器械柜、抽氣泵、電基分裝器、藥品柜、器械柜、抽氣泵、電爐、各種規(guī)格的培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)皿、移液管、爐、各種規(guī)格的培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)皿、移液管、燒杯、量筒、容量瓶、儲(chǔ)藏瓶等。冰箱以燒杯、量筒、容量瓶、儲(chǔ)藏瓶等。冰箱以體積體積180-200L為宜，用于儲(chǔ)存培養(yǎng)基母液、為宜，用于儲(chǔ)存培養(yǎng)基母液、激素維生素等貴重藥品、彩色膠卷、及保激素維生素等貴重藥品、彩色膠卷、及保存植物材料。天平應(yīng)有不同感量。存植物材料。天平應(yīng)有不同感量。2）培養(yǎng)基配制間）培養(yǎng)基配制

6、間 配備實(shí)驗(yàn)臺(tái)、高壓滅菌鍋、排風(fēng)滅火設(shè)備、細(xì)配備實(shí)驗(yàn)臺(tái)、高壓滅菌鍋、排風(fēng)滅火設(shè)備、細(xì)菌過(guò)濾設(shè)備、干熱消毒柜、電爐等。滅菌鍋的選擇菌過(guò)濾設(shè)備、干熱消毒柜、電爐等。滅菌鍋的選擇應(yīng)根據(jù)不同的要求選擇不同型號(hào)的滅菌鍋。一般實(shí)應(yīng)根據(jù)不同的要求選擇不同型號(hào)的滅菌鍋。一般實(shí)驗(yàn)室可選用小型的醫(yī)用手提式高壓滅菌鍋，較大的驗(yàn)室可選用小型的醫(yī)用手提式高壓滅菌鍋，較大的實(shí)驗(yàn)室可選用立式自動(dòng)控制壓力和溫度的滅菌鍋。實(shí)驗(yàn)室可選用立式自動(dòng)控制壓力和溫度的滅菌鍋。生產(chǎn)性的實(shí)驗(yàn)室可選用大型的臥式滅菌鍋。生產(chǎn)性的實(shí)驗(yàn)室可選用大型的臥式滅菌鍋。 如果沒(méi)有條件的話，可以將上述工作間合并成如果沒(méi)有條件的話，可以將上述工作間合并成一個(gè)準(zhǔn)

7、備間，要求是設(shè)備的安裝和排列要合理、房一個(gè)準(zhǔn)備間，要求是設(shè)備的安裝和排列要合理、房間要寬敞、明亮、透風(fēng)，地面要便于清潔、防滑。間要寬敞、明亮、透風(fēng)，地面要便于清潔、防滑。3） 消毒間消毒間（2 2）緩沖室緩沖室（注意門的朝向）（注意門的朝向） 工作人員在此換上工作服、拖鞋，戴上口工作人員在此換上工作服、拖鞋，戴上口罩罩 功能功能 減少人體從外界帶入的塵埃等污染物。減少人體從外界帶入的塵埃等污染物。 要求要求 緩沖間需緩沖間需3-5平方米，應(yīng)保持清潔無(wú)菌；平方米，應(yīng)保持清潔無(wú)菌； 有清潔的實(shí)驗(yàn)用拖鞋、已滅菌過(guò)的工作服；有清潔的實(shí)驗(yàn)用拖鞋、已滅菌過(guò)的工作服； 1-2盞紫外燈定時(shí)照射，對(duì)衣物及空間進(jìn)

8、盞紫外燈定時(shí)照射，對(duì)衣物及空間進(jìn)行滅菌。行滅菌。無(wú)菌操作室主要用于實(shí)驗(yàn)材料的接種操作，所以又叫無(wú)菌操作室主要用于實(shí)驗(yàn)材料的接種操作，所以又叫接種室。通常由里外兩間組成，外間是緩沖間，用于接種室。通常由里外兩間組成，外間是緩沖間，用于準(zhǔn)備工作，還有防止污染的作用。緩沖間的門應(yīng)該與準(zhǔn)備工作，還有防止污染的作用。緩沖間的門應(yīng)該與接種室的門錯(cuò)開，兩個(gè)門也不要同時(shí)開啟，以保證無(wú)接種室的門錯(cuò)開，兩個(gè)門也不要同時(shí)開啟，以保證無(wú)菌室不因開門和人的進(jìn)出帶進(jìn)雜菌。緩沖間內(nèi)應(yīng)該設(shè)菌室不因開門和人的進(jìn)出帶進(jìn)雜菌。緩沖間內(nèi)應(yīng)該設(shè)有水槽、實(shí)驗(yàn)臺(tái)、鞋帽架、和柜子、紫外燈。無(wú)菌操有水槽、實(shí)驗(yàn)臺(tái)、鞋帽架、和柜子、紫外燈。無(wú)菌操

9、作室的內(nèi)壁應(yīng)當(dāng)用塑鋼板或瓷磚裝修，工作人員進(jìn)入作室的內(nèi)壁應(yīng)當(dāng)用塑鋼板或瓷磚裝修，工作人員進(jìn)入操作間前要穿上消過(guò)毒的工作服和拖鞋。操作間前要穿上消過(guò)毒的工作服和拖鞋。 室內(nèi)應(yīng)配有超凈工作臺(tái)，紫外燈、解剖鏡、各種室內(nèi)應(yīng)配有超凈工作臺(tái)，紫外燈、解剖鏡、各種接種器械等。接種器械等。 （3） 無(wú)菌操作室無(wú)菌操作室無(wú)菌室（一）無(wú)菌室（二） 為了控制培養(yǎng)室的溫度和光照時(shí)間及其強(qiáng)度，培養(yǎng)為了控制培養(yǎng)室的溫度和光照時(shí)間及其強(qiáng)度，培養(yǎng)室的房間不要窗戶，但應(yīng)當(dāng)留一個(gè)通氣窗，并安上排氣室的房間不要窗戶，但應(yīng)當(dāng)留一個(gè)通氣窗，并安上排氣扇。室內(nèi)溫度由空調(diào)控制，光照由日光燈控制。天花板扇。室內(nèi)溫度由空調(diào)控制，光照由日光燈控

10、制。天花板和內(nèi)墻最好用塑料鋼板裝修，地面用水磨石或瓷磚鋪設(shè)，和內(nèi)墻最好用塑料鋼板裝修，地面用水磨石或瓷磚鋪設(shè)，一般要分兩間，一為光照培養(yǎng)室，一為暗培養(yǎng)室。培養(yǎng)一般要分兩間，一為光照培養(yǎng)室，一為暗培養(yǎng)室。培養(yǎng)室外應(yīng)有一預(yù)備間或走廊。室外應(yīng)有一預(yù)備間或走廊。 培養(yǎng)室應(yīng)配有培養(yǎng)架、轉(zhuǎn)床、搖床、光照培養(yǎng)箱、培養(yǎng)室應(yīng)配有培養(yǎng)架、轉(zhuǎn)床、搖床、光照培養(yǎng)箱、生化培養(yǎng)箱、自動(dòng)控時(shí)器等。日光燈一般用生化培養(yǎng)箱、自動(dòng)控時(shí)器等。日光燈一般用40W，固定，固定在培養(yǎng)架的側(cè)面或擱板的下面，每層有兩支日光燈，距在培養(yǎng)架的側(cè)面或擱板的下面，每層有兩支日光燈，距離在離在20cm，光照強(qiáng)度為，光照強(qiáng)度為2000-3000lx。（

11、4）培養(yǎng)室）培養(yǎng)室培養(yǎng)室l 植物組織培養(yǎng)材料移到田間前，通常植物組織培養(yǎng)材料移到田間前，通常先移到溫室進(jìn)行練苗，待生根成活后，先移到溫室進(jìn)行練苗，待生根成活后，再移到大田。再移到大田。2 2輔助實(shí)驗(yàn)室輔助實(shí)驗(yàn)室（1）鑒定室鑒定室 細(xì)胞學(xué)鑒定室細(xì)胞學(xué)鑒定室 其功能是對(duì)培養(yǎng)材料進(jìn)行細(xì)胞學(xué)鑒其功能是對(duì)培養(yǎng)材料進(jìn)行細(xì)胞學(xué)鑒定和研究。要求清潔、明亮、干燥，使各種光學(xué)儀定和研究。要求清潔、明亮、干燥，使各種光學(xué)儀器不受潮濕和灰塵污染。應(yīng)配置各種顯微鏡、照相器不受潮濕和灰塵污染。應(yīng)配置各種顯微鏡、照相系統(tǒng)等。系統(tǒng)等。 生化分析室生化分析室 在以培養(yǎng)細(xì)胞產(chǎn)物為主要目的的實(shí)驗(yàn)在以培養(yǎng)細(xì)胞產(chǎn)物為主要目的的實(shí)驗(yàn)室中

12、，應(yīng)建立相應(yīng)的分析化驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室，以便于對(duì)培室中，應(yīng)建立相應(yīng)的分析化驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室，以便于對(duì)培養(yǎng)物的有效成分隨時(shí)進(jìn)行取樣檢查。養(yǎng)物的有效成分隨時(shí)進(jìn)行取樣檢查。 離心機(jī)、酶離心機(jī)、酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀、天平、聯(lián)免疫檢測(cè)儀、天平、PCRPCR儀等。儀等。為試管苗提供滿足生長(zhǎng)的適宜環(huán)境條件。為試管苗提供滿足生長(zhǎng)的適宜環(huán)境條件。（2）溫室）溫室（一）無(wú)菌操作設(shè)備一）無(wú)菌操作設(shè)備 .烘箱：烘箱： 作用作用：干燥洗后的器皿：干燥洗后的器皿l 高溫干熱滅菌高溫干熱滅菌l 測(cè)定培養(yǎng)物的干重時(shí)烘干培測(cè)定培養(yǎng)物的干重時(shí)烘干培l(xiāng) 養(yǎng)材料。養(yǎng)材料。 2.滅菌鍋滅菌鍋l類型類型：普通醫(yī)用消毒鍋：普通醫(yī)用消毒鍋l 大的高壓滅菌鍋大的高壓

13、滅菌鍋l作用作用：培養(yǎng)基、水和各種用具的消毒：培養(yǎng)基、水和各種用具的消毒3.超凈工作臺(tái)超凈工作臺(tái)l陳列于操作室（接種室）內(nèi)陳列于操作室（接種室）內(nèi)l類型類型：垂直式和水平式：垂直式和水平式l作用作用：無(wú)菌操作：無(wú)菌操作（二）藥品貯存和配制儀器設(shè)備（二）藥品貯存和配制儀器設(shè)備1.冰箱冰箱l作用作用：低溫保存材料，存：低溫保存材料，存放藥品、培養(yǎng)基母液、激放藥品、培養(yǎng)基母液、激素、酶制劑。素、酶制劑。2.天平天平l陳列于制備室中陳列于制備室中l(wèi)作用：作用：稱取大量元素、微量稱取大量元素、微量元素、酶制劑元素、酶制劑3.酸度計(jì)酸度計(jì)l陳列于制備室中陳列于制備室中l(wèi)作用作用：測(cè)定培養(yǎng)基及酶制劑的：測(cè)定

14、培養(yǎng)基及酶制劑的pH值值PHS-802中文臺(tái)式酸度計(jì)中文臺(tái)式酸度計(jì)通用型或經(jīng)濟(jì)型酸度計(jì)通用型或經(jīng)濟(jì)型酸度計(jì)（三）觀察分析儀器設(shè)備（三）觀察分析儀器設(shè)備l顯微鏡顯微鏡l類型：類型：l 倒置顯微鏡倒置顯微鏡 原生質(zhì)體觀察原生質(zhì)體觀察l 普通顯微鏡普通顯微鏡 染色體和葉片氣孔觀察染色體和葉片氣孔觀察l 熒光顯微鏡熒光顯微鏡 細(xì)胞活力觀察細(xì)胞活力觀察l 電子顯微鏡電子顯微鏡 病毒檢測(cè)、細(xì)胞器變化病毒檢測(cè)、細(xì)胞器變化l 體視顯微鏡體視顯微鏡 形態(tài)分化的實(shí)體觀察形態(tài)分化的實(shí)體觀察（四）培養(yǎng)設(shè)備（四）培養(yǎng)設(shè)備1.空調(diào)空調(diào)l作用：控制培養(yǎng)溫度作用：控制培養(yǎng)溫度2.加濕器和去濕機(jī)加濕器和去濕機(jī)l控制培養(yǎng)室內(nèi)濕度

15、狀況控制培養(yǎng)室內(nèi)濕度狀況3.定時(shí)器定時(shí)器l控制光照時(shí)間控制光照時(shí)間4.培養(yǎng)架培養(yǎng)架l盛放培養(yǎng)物盛放培養(yǎng)物5.搖床和旋轉(zhuǎn)床搖床和旋轉(zhuǎn)床l進(jìn)行液體培養(yǎng)時(shí)用以改善氣體狀況進(jìn)行液體培養(yǎng)時(shí)用以改善氣體狀況小型臭氧發(fā)生器小型臭氧發(fā)生器不銹鋼蒸餾水器（單蒸水）不銹鋼蒸餾水器（單蒸水）（一）玻璃器皿（一）玻璃器皿1.培養(yǎng)器皿培養(yǎng)器皿培養(yǎng)用的：試管、三角瓶、培養(yǎng)皿等培養(yǎng)用的：試管、三角瓶、培養(yǎng)皿等2.分注器分注器類型：注射器式分注器、漏斗式分注器、類型：注射器式分注器、漏斗式分注器、 量筒漏斗式分注器量筒漏斗式分注器3.其他玻璃儀器其他玻璃儀器燒杯、量筒、移液管、容量瓶、試劑瓶等燒杯、量筒、移液管、容量瓶、試劑

16、瓶等（二）器械類（二）器械類1.鑷子鑷子l類型：槍式鑷子（接種、轉(zhuǎn)移）、尖頭鑷類型：槍式鑷子（接種、轉(zhuǎn)移）、尖頭鑷子（莖尖）子（莖尖）2.剪刀剪刀l類型：大剪刀、小剪刀、彎頭剪刀類型：大剪刀、小剪刀、彎頭剪刀3.解剖刀解剖刀l類型：固定式和活動(dòng)式類型：固定式和活動(dòng)式4.接種針接種針l用來(lái)轉(zhuǎn)移細(xì)胞或愈傷組織用來(lái)轉(zhuǎn)移細(xì)胞或愈傷組織5.細(xì)菌過(guò)濾器細(xì)菌過(guò)濾器l用來(lái)去除細(xì)菌（高溫的影響）用來(lái)去除細(xì)菌（高溫的影響）1.1.洗滌液的配制洗滌液的配制二、實(shí)驗(yàn)基本操作二、實(shí)驗(yàn)基本操作（一）洗滌技術(shù)（一）洗滌技術(shù)A A、新購(gòu)買的玻璃儀器表面常附著有游離的堿性新購(gòu)買的玻璃儀器表面常附著有游離的堿性物質(zhì)，可先用物質(zhì)，

17、可先用0.5的去污劑洗刷，再用自來(lái)水洗的去污劑洗刷，再用自來(lái)水洗凈，然后浸泡在凈，然后浸泡在12鹽酸溶液中過(guò)夜（不可鹽酸溶液中過(guò)夜（不可少于四小時(shí)），再用自來(lái)水沖洗，最后用無(wú)離子少于四小時(shí)），再用自來(lái)水沖洗，最后用無(wú)離子水沖洗兩次，在水沖洗兩次，在100120烘箱內(nèi)烘干備用。烘箱內(nèi)烘干備用。2.2.洗滌方法洗滌方法 先用自來(lái)水洗刷至無(wú)污物，再用合適的先用自來(lái)水洗刷至無(wú)污物，再用合適的毛刷沾去污劑（粉）洗刷，或浸泡在毛刷沾去污劑（粉）洗刷，或浸泡在0.50.5的清洗劑中超聲清洗（比色皿決不可超聲），的清洗劑中超聲清洗（比色皿決不可超聲），然后用自來(lái)水徹底洗凈去污劑，用無(wú)離子水然后用自來(lái)水徹底洗凈

18、去污劑，用無(wú)離子水洗兩次，烘干備用（計(jì)量?jī)x器不可烘干）。洗兩次，烘干備用（計(jì)量?jī)x器不可烘干）。清洗后器皿內(nèi)外不可掛有水珠，否則重洗，清洗后器皿內(nèi)外不可掛有水珠，否則重洗，若重洗后仍掛有水珠，則需用洗液浸泡數(shù)小若重洗后仍掛有水珠，則需用洗液浸泡數(shù)小時(shí)后（或用去污粉擦洗），重新清洗。時(shí)后（或用去污粉擦洗），重新清洗。B B、使用過(guò)的玻璃儀器的清洗、使用過(guò)的玻璃儀器的清洗 聚乙烯、聚丙烯等制成的塑料器皿，在生物化學(xué)聚乙烯、聚丙烯等制成的塑料器皿，在生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)中已用的越來(lái)越多。第一次使用塑料器皿時(shí)，實(shí)驗(yàn)中已用的越來(lái)越多。第一次使用塑料器皿時(shí)，可先用可先用8mol/L尿素（用濃鹽酸調(diào)尿素（用濃鹽酸調(diào)p

19、H = 1）清洗，接）清洗，接著依次用無(wú)離子水、著依次用無(wú)離子水、1 mol/L KOH和無(wú)離子水清洗，和無(wú)離子水清洗，然后用然后用103 mol/L EDTA 除去金屬離子的污染，最除去金屬離子的污染，最后用無(wú)離子水徹底清洗，以后每次使用時(shí)，可只用后用無(wú)離子水徹底清洗，以后每次使用時(shí)，可只用0.5的去污劑清洗，然后用自來(lái)水和無(wú)離子水洗凈的去污劑清洗，然后用自來(lái)水和無(wú)離子水洗凈即可。即可。C、 塑料器皿的清洗塑料器皿的清洗金屬用品一般不宜用各種洗滌液洗滌（新的金屬用品一般不宜用各種洗滌液洗滌（新的可以用熱洗衣粉水洗凈），需要清洗時(shí)，一可以用熱洗衣粉水洗凈），需要清洗時(shí)，一般用酒精擦洗，然后火焰

20、干燥。般用酒精擦洗，然后火焰干燥。 E E、除菌過(guò)濾器用清水沖洗后，用洗液沖洗，、除菌過(guò)濾器用清水沖洗后，用洗液沖洗，再用清水沖洗，最后用蒸餾水沖洗，晾干備再用清水沖洗，最后用蒸餾水沖洗，晾干備用。用。D D、金屬用品洗滌、金屬用品洗滌1.1.滅菌工作是極其重要的。滅菌工作是極其重要的。 首先應(yīng)建立有菌和無(wú)菌的概念有菌的范疇：首先應(yīng)建立有菌和無(wú)菌的概念有菌的范疇：有菌：有菌：凡是暴露在空氣中的物體，至少其表面都是有菌的。如植物的表面、凡是暴露在空氣中的物體，至少其表面都是有菌的。如植物的表面、超凈工作臺(tái)的臺(tái)面，未處理的工具和手等。超凈工作臺(tái)的臺(tái)面，未處理的工具和手等。 無(wú)菌無(wú)菌：高壓高溫處理（

21、工具、器皿、培養(yǎng)基等）：高壓高溫處理（工具、器皿、培養(yǎng)基等） 物理或化學(xué)處理；物理或化學(xué)處理； 火烤后的物體；火烤后的物體； 健康的動(dòng)植物不與內(nèi)外部表面接觸的組織健康的動(dòng)植物不與內(nèi)外部表面接觸的組織 內(nèi)部可能是無(wú)菌的（有時(shí)也有內(nèi)生菌，但內(nèi)部可能是無(wú)菌的（有時(shí)也有內(nèi)生菌，但 不會(huì)影響培養(yǎng)，也不會(huì)污染）不會(huì)影響培養(yǎng)，也不會(huì)污染）（二）滅菌技術(shù)（二）滅菌技術(shù)（1 1）物理方法物理方法：干熱、濕熱、過(guò)濾（：干熱、濕熱、過(guò)濾（0.250.25微米）紫外燈、超聲波等。微米）紫外燈、超聲波等。 （2 2）化學(xué)方法化學(xué)方法：使用滅菌劑或抗菌素，如：使用滅菌劑或抗菌素，如酒精、次氯酸鈉、升汞、漂白粉、高錳酸鉀、

22、酒精、次氯酸鈉、升汞、漂白粉、高錳酸鉀、雙氧水、福爾馬林等雙氧水、福爾馬林等 2.2.滅菌的方法滅菌的方法干熱滅菌干熱滅菌 玻璃器皿、器械玻璃器皿、器械 濕熱滅菌濕熱滅菌 培養(yǎng)基、蒸餾水、器械、棉塞等培養(yǎng)基、蒸餾水、器械、棉塞等熏蒸滅菌熏蒸滅菌 接種室、培養(yǎng)室接種室、培養(yǎng)室過(guò)濾滅菌過(guò)濾滅菌 液體培養(yǎng)基、蒸餾水液體培養(yǎng)基、蒸餾水藥劑滅菌藥劑滅菌 培養(yǎng)材料培養(yǎng)材料燒灼滅菌燒灼滅菌 器械、瓶口、棉塞、包頭紙器械、瓶口、棉塞、包頭紙輻射滅菌輻射滅菌 接種室。培養(yǎng)間接種室。培養(yǎng)間各種滅菌方法及其使用范圍各種滅菌方法及其使用范圍適用于玻璃器皿和金屬器械的滅菌。操作方適用于玻璃器皿和金屬器械的滅菌。操作方法

23、：法：150 150 、40min40min或或120 120 、120min120min，如，如果發(fā)現(xiàn)芽孢桿菌，果發(fā)現(xiàn)芽孢桿菌，160 160 、9090120min120min1 1）干熱滅菌）干熱滅菌適用于各種器皿、培養(yǎng)基、器皿、蒸餾水、適用于各種器皿、培養(yǎng)基、器皿、蒸餾水、棉塞、紙等。棉塞、紙等。121 121 維持維持202030min30min注意點(diǎn)：加足水、排盡氣、氣壓降到注意點(diǎn)：加足水、排盡氣、氣壓降到0 0時(shí)，時(shí)，才能開蓋才能開蓋2 2）濕熱滅菌）濕熱滅菌 培養(yǎng)基的滅菌一般用高壓高溫處理，但如果培養(yǎng)基的滅菌一般用高壓高溫處理，但如果培養(yǎng)基中某些成分遇到高溫分解（如某些生長(zhǎng)調(diào)培

24、養(yǎng)基中某些成分遇到高溫分解（如某些生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑節(jié)劑GA3GA3、玉米素等），就需要過(guò)濾滅菌。另外酶、玉米素等），就需要過(guò)濾滅菌。另外酶、血清等也需要過(guò)濾滅菌血清等也需要過(guò)濾滅菌 滅菌方法：將生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑或酶配成一定濃度，滅菌方法：將生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑或酶配成一定濃度，用注射器注入微孔濾膜慮，濾膜孔徑用注射器注入微孔濾膜慮，濾膜孔徑0.220.220.450.45微米。制培養(yǎng)基時(shí)，現(xiàn)將培養(yǎng)基高壓滅菌，待降微米。制培養(yǎng)基時(shí)，現(xiàn)將培養(yǎng)基高壓滅菌，待降至至5050左右時(shí)，加入適量的激素，然后分裝。左右時(shí)，加入適量的激素，然后分裝。3 3）過(guò)濾滅菌）過(guò)濾滅菌主要是利用紫外燈進(jìn)行照射，適合實(shí)驗(yàn)室主要是利用紫外燈進(jìn)行照

25、射，適合實(shí)驗(yàn)室空氣、操作臺(tái)等，滅菌時(shí)間空氣、操作臺(tái)等，滅菌時(shí)間202030min30min。注意：關(guān)燈后注意：關(guān)燈后5min5min后再進(jìn)入。超凈工作臺(tái)后再進(jìn)入。超凈工作臺(tái)關(guān)燈后要打開風(fēng)機(jī)。關(guān)燈后要打開風(fēng)機(jī)。4 4）射線滅菌）射線滅菌用火焰灼燒達(dá)到滅菌目的，適用于用火焰灼燒達(dá)到滅菌目的，適用于接種器皿的滅菌。接種器皿的滅菌。5 5）火焰灼燒滅菌）火焰灼燒滅菌適用外植體、實(shí)驗(yàn)器皿、操作表面、皮膚等。適用外植體、實(shí)驗(yàn)器皿、操作表面、皮膚等。幾種常用消毒劑的效果比較幾種常用消毒劑的效果比較消消 毒毒 劑劑使用濃度使用濃度(%)(%)消毒時(shí)間消毒時(shí)間(min.)(min.)效效 果果殘液去除殘液去除難

26、易難易乙醇乙醇70-7570-750.1-30.1-3好好易易新潔爾滅新潔爾滅101020205 53030好好易易氯化汞氯化汞0.10.11 12 21515最好最好最難最難過(guò)氧化氫過(guò)氧化氫101012125 51515較好較好最易最易抗菌素抗菌素4 450mgl50mgl-1-130306060較好較好較難較難次氯酸鈣次氯酸鈣/ /納納9 9 10105 53030好好易易6 6）消毒劑）消毒劑長(zhǎng)期不用的培養(yǎng)室或接種室要進(jìn)行熏蒸。方法：長(zhǎng)期不用的培養(yǎng)室或接種室要進(jìn)行熏蒸。方法：甲甲醛、高錳酸鉀熏蒸醛、高錳酸鉀熏蒸。 甲醛的用量通常按每立方米空間甲醛的用量通常按每立方米空間2-62-6毫升計(jì)

27、算，毫升計(jì)算，高錳酸鉀的用量是甲醛的一半。室內(nèi)準(zhǔn)備妥當(dāng)后，高錳酸鉀的用量是甲醛的一半。室內(nèi)準(zhǔn)備妥當(dāng)后，把稱好的高錳酸鉀放在瓷碗或燒杯內(nèi)把稱好的高錳酸鉀放在瓷碗或燒杯內(nèi)( (最好在碗或最好在碗或杯下面鋪一張報(bào)紙，以利清洗杯下面鋪一張報(bào)紙，以利清洗) )，然后將甲醛也倒，然后將甲醛也倒入碗或杯內(nèi)，立即出屋關(guān)門。幾秒鐘后，甲醛溶液入碗或杯內(nèi)，立即出屋關(guān)門。幾秒鐘后，甲醛溶液即沸騰揮發(fā)。高錳酸鉀是一種氧化劑，當(dāng)它與一部即沸騰揮發(fā)。高錳酸鉀是一種氧化劑，當(dāng)它與一部分甲醛作用時(shí)，由氧化反應(yīng)產(chǎn)生的熱可使其余的甲分甲醛作用時(shí)，由氧化反應(yīng)產(chǎn)生的熱可使其余的甲醛揮發(fā)為氣體。醛揮發(fā)為氣體。7 7）熏蒸滅菌）熏蒸滅菌

28、甲醛熏蒸接種室應(yīng)至少在使用前甲醛熏蒸接種室應(yīng)至少在使用前2424小時(shí)進(jìn)行，熏蒸后小時(shí)進(jìn)行，熏蒸后密閉保持密閉保持4 4小時(shí)以上再進(jìn)入室內(nèi)工作。甲醛對(duì)人的眼、小時(shí)以上再進(jìn)入室內(nèi)工作。甲醛對(duì)人的眼、鼻有強(qiáng)烈刺激作用。因此，可在使用前用氨進(jìn)行中和。鼻有強(qiáng)烈刺激作用。因此，可在使用前用氨進(jìn)行中和。取與甲醛等量的氨水，倒在另一個(gè)燒杯里，迅速放入取與甲醛等量的氨水，倒在另一個(gè)燒杯里，迅速放入熏蒸室內(nèi)，使甲醛和氨水發(fā)生中和反應(yīng)，以消除甲醛熏蒸室內(nèi)，使甲醛和氨水發(fā)生中和反應(yīng)，以消除甲醛味，減少對(duì)人體的刺激作用。使用氨水應(yīng)在工作前味，減少對(duì)人體的刺激作用。使用氨水應(yīng)在工作前2 2小時(shí)進(jìn)行。小時(shí)進(jìn)行。 對(duì)有材料的

29、培養(yǎng)室，也可以采用乙二醇加熱熏蒸對(duì)有材料的培養(yǎng)室，也可以采用乙二醇加熱熏蒸人為因素（工作人員本身）：工作服、帽、口罩、酒精擦手。人為因素（工作人員本身）：工作服、帽、口罩、酒精擦手。物品因素物品因素器器皿皿和和用用具具培養(yǎng)皿：洗培養(yǎng)皿：洗熱壓熱壓 玻璃器皿：洗玻璃器皿：洗干熱（干熱箱）或晾干干熱（干熱箱）或晾干 接種用具：用接種用具：用CCLCCL4 4布擦布擦濕布擦濕布擦 泡泡75%95%75%95%酒精酒精燒燒培養(yǎng)基：濕熱培養(yǎng)基：濕熱培培養(yǎng)養(yǎng)材材料料外部細(xì)菌：用水沖洗外部細(xì)菌：用水沖洗化學(xué)藥劑處理化學(xué)藥劑處理 內(nèi)部細(xì)菌內(nèi)部細(xì)菌 莖尖培養(yǎng)莖尖培養(yǎng) 加抗生素：青霉素、利福平加抗生素：青霉素、利

30、福平操作的空氣：洗刷地板操作的空氣：洗刷地板95%酒精擦超凈工作臺(tái)酒精擦超凈工作臺(tái) 用化學(xué)試劑薰蒸用化學(xué)試劑薰蒸污染來(lái)源污染來(lái)源（三）無(wú)菌操作技術(shù)（三）無(wú)菌操作技術(shù)1 1. .實(shí)驗(yàn)器具和材料的準(zhǔn)備實(shí)驗(yàn)器具和材料的準(zhǔn)備2 2. .用用75%75%的酒精擦拭超凈工作臺(tái)，然后室內(nèi)及超的酒精擦拭超凈工作臺(tái)，然后室內(nèi)及超凈工作臺(tái)用紫外燈殺菌凈工作臺(tái)用紫外燈殺菌20min-30min20min-30min。注意：臺(tái)。注意：臺(tái)面上的用品不要放置太多或重疊放置，以免降低面上的用品不要放置太多或重疊放置，以免降低滅菌效果。滅菌效果。3 3. .關(guān)紫外燈、打開風(fēng)機(jī)，過(guò)關(guān)紫外燈、打開風(fēng)機(jī)，過(guò)5-10min5-10m

31、in進(jìn)入緩沖間，進(jìn)入緩沖間，以以75%75%洗手和手臂，更換無(wú)菌服、帽子和口罩。洗手和手臂，更換無(wú)菌服、帽子和口罩。進(jìn)入接種室。（注：沒(méi)有特別情況，盡量不要下進(jìn)入接種室。（注：沒(méi)有特別情況，盡量不要下工作臺(tái)）工作臺(tái)）4 4. .用用70707575的酒精拭擦臺(tái)面并消毒雙手。試驗(yàn)的酒精拭擦臺(tái)面并消毒雙手。試驗(yàn)用具也應(yīng)該用酒精消毒。點(diǎn)燃酒精燈，將金屬器用具也應(yīng)該用酒精消毒。點(diǎn)燃酒精燈，將金屬器械在其火焰上灼燒，冷卻待用。械在其火焰上灼燒，冷卻待用。注意：所有操作應(yīng)在火焰近處并經(jīng)過(guò)灼燒進(jìn)行。注意：所有操作應(yīng)在火焰近處并經(jīng)過(guò)灼燒進(jìn)行。金屬器械不能過(guò)度灼燒，以防退火。移液管不能金屬器械不能過(guò)度灼燒，以防

32、退火。移液管不能灼燒，培養(yǎng)瓶口、塑料材料、橡膠材料過(guò)火焰不灼燒，培養(yǎng)瓶口、塑料材料、橡膠材料過(guò)火焰不能時(shí)間太長(zhǎng)。能時(shí)間太長(zhǎng)。5 5. .取流水沖洗（至少取流水沖洗（至少30min30min）過(guò)的外植體，用一定）過(guò)的外植體，用一定的消毒劑浸泡消毒，用無(wú)菌水沖洗的消毒劑浸泡消毒，用無(wú)菌水沖洗3 34 4次，放入無(wú)次，放入無(wú)菌培養(yǎng)皿中，置于酒精燈火焰下方，用無(wú)菌的接種菌培養(yǎng)皿中，置于酒精燈火焰下方，用無(wú)菌的接種器械進(jìn)行分離、切割或其他處理。器械進(jìn)行分離、切割或其他處理。6 6. .打開培養(yǎng)瓶，瓶口在燈焰處旋轉(zhuǎn)灼燒，打開培養(yǎng)瓶，瓶口在燈焰處旋轉(zhuǎn)灼燒，用鑷子將培養(yǎng)材料置于培養(yǎng)基上，灼燒鑷用鑷子將培養(yǎng)材料

33、置于培養(yǎng)基上，灼燒鑷子放回，灼燒瓶口，蓋上瓶塞。子放回，灼燒瓶口，蓋上瓶塞。7 7. .用酒精擦洗工作臺(tái)和手。進(jìn)行下一輪操用酒精擦洗工作臺(tái)和手。進(jìn)行下一輪操作。作。注意（注意（1 1）進(jìn)行培養(yǎng)時(shí)，動(dòng)作要準(zhǔn)確敏捷，但又不必）進(jìn)行培養(yǎng)時(shí)，動(dòng)作要準(zhǔn)確敏捷，但又不必太快，以防空氣流動(dòng)，增加污染機(jī)會(huì)。（太快，以防空氣流動(dòng)，增加污染機(jī)會(huì)。（2 2）不能用）不能用手觸及已消毒器皿，如已接觸，要用火焰燒灼消毒或手觸及已消毒器皿，如已接觸，要用火焰燒灼消毒或取備品更換。取備品更換。 （3 3）為拿取方便，工作臺(tái)面上的用品）為拿取方便，工作臺(tái)面上的用品要有合理的布局，原則上應(yīng)是右手使用的東西放置在要有合理的布局，

34、原則上應(yīng)是右手使用的東西放置在右側(cè)，左手用品在左側(cè)，酒精燈置于中央。（右側(cè)，左手用品在左側(cè)，酒精燈置于中央。（4 4）工）工作由始至終要保持一定順序性，組織或細(xì)胞在未做處作由始至終要保持一定順序性，組織或細(xì)胞在未做處理之前，勿過(guò)早暴露在空氣中。同樣，培養(yǎng)液在未用理之前，勿過(guò)早暴露在空氣中。同樣，培養(yǎng)液在未用前，不要過(guò)早開瓶；用過(guò)之后如不再重復(fù)使用，應(yīng)立前，不要過(guò)早開瓶；用過(guò)之后如不再重復(fù)使用，應(yīng)立即封閉瓶口直立可增加落菌機(jī)會(huì)。即封閉瓶口直立可增加落菌機(jī)會(huì)。（5 5）吸取營(yíng)養(yǎng)液、細(xì)胞懸液及其它各種用液時(shí)，均）吸取營(yíng)養(yǎng)液、細(xì)胞懸液及其它各種用液時(shí)，均應(yīng)分別使用吸管，不能混用，以防擴(kuò)大污染或?qū)е录?xì)應(yīng)

35、分別使用吸管，不能混用，以防擴(kuò)大污染或?qū)е录?xì)胞交叉污染。胞交叉污染。（6 6）工作中不能面向操作區(qū)講話或咳嗽，以免唾沫）工作中不能面向操作區(qū)講話或咳嗽，以免唾沫把細(xì)菌或支原體帶入工作臺(tái)面發(fā)生污染。把細(xì)菌或支原體帶入工作臺(tái)面發(fā)生污染。（7 7）手或相對(duì)較臟的物品不能經(jīng)過(guò)開放的瓶口上方，）手或相對(duì)較臟的物品不能經(jīng)過(guò)開放的瓶口上方，瓶口最易污染，加液時(shí)如吸管尖碰到瓶口，則應(yīng)將吸瓶口最易污染，加液時(shí)如吸管尖碰到瓶口，則應(yīng)將吸管丟掉。管丟掉。接種時(shí)在近火焰處打開瓶口，使瓶?jī)A斜，接種時(shí)在近火焰處打開瓶口，使瓶?jī)A斜，以免空氣中微生物落入瓶中以免空氣中微生物落入瓶中正正 確確 錯(cuò)錯(cuò) 誤誤整個(gè)接種操作應(yīng)在近火焰

36、處進(jìn)行，且動(dòng)作要整個(gè)接種操作應(yīng)在近火焰處進(jìn)行，且動(dòng)作要迅速迅速正正 確確 錯(cuò)錯(cuò) 誤誤接種過(guò)程中盡可能達(dá)到懸空要求防止操作帶來(lái)的污染防止操作帶來(lái)的污染正正 確確 錯(cuò)錯(cuò) 誤誤接種時(shí)不得用手接觸瓶蓋內(nèi)壁或瓶口正正 確確 錯(cuò)錯(cuò) 誤誤瓶蓋朝上放，接種完畢后立即蓋好瓶口正正 確確 錯(cuò)錯(cuò) 誤誤接種完一瓶用火燒用具以防止交叉污染產(chǎn)生接種完一瓶用火燒用具以防止交叉污染產(chǎn)生種子和分生組織：培養(yǎng)時(shí)通常將其貼放在培養(yǎng)基表種子和分生組織：培養(yǎng)時(shí)通常將其貼放在培養(yǎng)基表面，而不是插到培養(yǎng)基內(nèi)部，以免供氧不足面，而不是插到培養(yǎng)基內(nèi)部，以免供氧不足正正 確確 錯(cuò)錯(cuò) 誤誤接種莖段：注意形態(tài)學(xué)下端插入培養(yǎng)基內(nèi)，而形接種莖段：注意形

37、態(tài)學(xué)下端插入培養(yǎng)基內(nèi)，而形態(tài)學(xué)上端露于空氣中態(tài)學(xué)上端露于空氣中正正 確確 錯(cuò)錯(cuò) 誤誤第二節(jié)第二節(jié) 培養(yǎng)基及其配制培養(yǎng)基及其配制主要內(nèi)容主要內(nèi)容一、一、 培養(yǎng)基的成分培養(yǎng)基的成分 二、二、 培養(yǎng)基的配制培養(yǎng)基的配制三、三、 常用培養(yǎng)基配方及其特點(diǎn)常用培養(yǎng)基配方及其特點(diǎn) 一、一、 培養(yǎng)基的成分培養(yǎng)基的成分 n水水n無(wú)機(jī)鹽無(wú)機(jī)鹽n炭源和能源炭源和能源 n維生素類維生素類 n氨基酸及有機(jī)附加物氨基酸及有機(jī)附加物 n植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì) n瓊脂瓊脂 n活性炭活性炭 （一）無(wú)機(jī)營(yíng)養(yǎng) 無(wú)機(jī)營(yíng)養(yǎng)包括水和各種無(wú)機(jī)鹽，它們提供了除碳源以外的幾乎所有的營(yíng)養(yǎng)元素。1.水 是植物原生質(zhì)的組成成分，也是一切代

38、謝過(guò)程的介質(zhì)和溶媒，為生命活動(dòng)不可缺少。 配制培養(yǎng)基時(shí)一般用離子交換水、蒸餾水、重蒸餾水。2.無(wú)機(jī)鹽無(wú)機(jī)鹽 n無(wú)機(jī)鹽包括大量元素和微量元素。大量元素是指碳、氫、氧、氮、磷、鉀、硫、鈣、氯、鎂。n氮通常是指硝態(tài)氮或氨態(tài)氮，但在培養(yǎng)基中多以KNO3或Ca（NO3）2的硝態(tài)氮形式來(lái)滿足培養(yǎng)物對(duì)氮素的需求，或?qū)煞N混合使用，有時(shí)也以硝態(tài)氮為主，補(bǔ)加（NH4）2SO4以滿足酸性植物的需要。n磷是植物的必須元素之一，參與植物生命活動(dòng)中核酸、蛋白質(zhì)合成、光合作用、呼吸作用、及能量的貯存、轉(zhuǎn)化與釋放等重要生理生化過(guò)程，因此在組織培養(yǎng)物中需大量的磷。n鉀是主要的陽(yáng)離子，近年來(lái)在培養(yǎng)基中的用量呈逐漸提高的趨勢(shì)。鈣

39、、鈉、鎂的用量較少。n微量元素是指鐵、硼、錳、鋅、鈷、鉬、銅等，其需要量很少，一般多為10-510-7mol.L-1，稍多則產(chǎn)生毒害。 1.碳源(能源) n植物組織培養(yǎng)中被培養(yǎng)的外植體，由于其光合作用的能力較低，需要在培養(yǎng)基中添加一些碳水化合物作為生長(zhǎng)發(fā)育的能源。一般是添加蔗糖、葡萄糖和果糖，其中以蔗糖為最常用，效果也最好。然而在體細(xì)胞組織培養(yǎng)中，葡萄糖、麥芽糖和山梨醇也有影響；在花藥培養(yǎng)中，麥芽糖也有促進(jìn)作用。糖類在培養(yǎng)基中除了作為碳源和能源以外，還具有維持培養(yǎng)基一定的滲透壓的作用。大多數(shù)植物細(xì)胞對(duì)蔗糖的需求范圍是1%5%，但個(gè)別植物組織培養(yǎng)中蔗糖的濃度也可高達(dá)7%甚至15%，如玉米、油菜等

40、植物的花藥培養(yǎng)。一般來(lái)說(shuō)，蔗糖作為碳源和滲透劑的比例約為3：13：2，即約有1/42/5的蔗糖用于保持培養(yǎng)基的滲透壓。 （二）有機(jī)成分（二）有機(jī)成分2 2. .維生素類維生素類 n維生素類與植物體內(nèi)各種酶的形成有關(guān)。維生素的種類很多，在植物組織培養(yǎng)中通常以在植物組織培養(yǎng)中通常以B族族維生素為主，使用濃度一般為維生素為主，使用濃度一般為0.11.0mg/L，其中以鹽酸硫胺素（B1）、鹽酸吡哆素（B6）、維生素B12、煙酸、生物素和維生素C最為常用。在各種維生素中，Vit.B1可能是必需的。其它可能只對(duì)外植體的生長(zhǎng)起促進(jìn)作用。肌醇本身不促進(jìn)外植體的生長(zhǎng)，但可能有助于活性物質(zhì)發(fā)揮作用，從而促進(jìn)外植體

41、生長(zhǎng)、胚狀體及芽的形成。培養(yǎng)基中肌醇的用量為50100mg/L。3 3. .氨基酸及有機(jī)添加物氨基酸及有機(jī)添加物 n在一些培養(yǎng)基中可加入一些氨基酸，如甘氨酸（Gly）、絲氨酸（Ser）、酪氨酸（Tyr）、谷氨酰胺（Gln）、天冬酰胺（Asn）等，它們是培養(yǎng)基中重要的有機(jī)氮源。水解酪蛋白（CH）和水解乳蛋白（LH）也是多種氨基酸的混合物，對(duì)胚狀體或不定芽或多胚的分化有良好的促進(jìn)作用，常用量為500mg/L。水解酪蛋白（CH）和水解乳蛋白（LH）也是多種氨基酸的混合物，對(duì)胚狀體或不定芽或多胚的分化有良好的促進(jìn)作用，常用量為500mg/L。 n在某些植物組織培養(yǎng)中還加入一些天然的有機(jī)物，例如椰子乳1

42、020%，酵母提取物0.5%，番茄汁510%，香蕉泥100200mg/L，其作用是提供一些必要的微量營(yíng)養(yǎng)成分、生理活性物質(zhì)和生長(zhǎng)激素等。如培養(yǎng)基中加入100200mg/L的香蕉泥，具有較大的pH緩沖作用，主要用于蘭花的組織培養(yǎng)，對(duì)幼苗的發(fā)育有較大的促進(jìn)作用。 （三三）植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì) n生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)是培養(yǎng)基中不可缺少的關(guān)鍵物質(zhì)，其用量雖極少，但它們對(duì)外植體愈傷組織的誘導(dǎo)和器官分化起著重要和明顯的調(diào)節(jié)作用，其中以生長(zhǎng)素類和細(xì)胞分裂素最為常用。 1 1. .生長(zhǎng)素生長(zhǎng)素 n它們的主要作用是誘導(dǎo)愈傷組織的形成、胚狀體的產(chǎn)生及試管苗的生根，更重要的是配合一定比例的細(xì)胞分裂素誘導(dǎo)腋芽及不

43、定芽的產(chǎn)生。 n生長(zhǎng)素常用的是2.4-D（2，4-二氯苯氧乙酸）、NAA（萘乙酸）、IAA（吲哚乙酸）、IBA（吲哚丁酸），它們作用的強(qiáng)弱順序?yàn)?.4-DNAAIBAIAA。 n2,4-D常用于誘導(dǎo)愈傷組織，NAA、IBA、IAA常用于生根。使用濃度范圍一般為0.1mg/l10.0mg/l。2.細(xì)胞分裂素細(xì)胞分裂素 n它們的主要作用是促進(jìn)細(xì)胞的分裂和器官的分化、延緩組織的衰老、增強(qiáng)蛋白質(zhì)的合成、抑制頂端優(yōu)勢(shì)、促進(jìn)芽的生長(zhǎng)及顯著改變其它的激素的作用。 n常用的細(xì)胞分裂素類有：激動(dòng)素（KT）、6-芐基腺嘌呤（6-BA）、玉米素（ZT）、2-異戊烯腺嘌呤（2-iP）、吡效?。?PU，CPPU）和噻重

44、氮苯基脲（TDZ）。 n它們作用的強(qiáng)弱順序?yàn)門DZ 4PU ZT 2-Ip 6-BA KT。但在組織培養(yǎng)中通常使用人工合成的、性能穩(wěn)定的而價(jià)格適中的KT和6-BA，二者的最適濃度為1-10mg/L。n它們作用的強(qiáng)弱順序?yàn)門DZ，4PU ZT 2-Ip 6-BA KT。常用濃度為1-10mg/L。(四) 瓊脂n瓊脂是從海藻中提取的一種高分子碳水化合物，它的主要作用是使培養(yǎng)基在常溫下凝固，同時(shí)不參與代謝，所以在組織培養(yǎng)中一直被作為首選的培養(yǎng)基質(zhì)而廣泛應(yīng)用。 (五) 活性炭n活性炭加入培養(yǎng)基中的目的主要是利用其吸附能力，減少一些有害物質(zhì)的影響。例如可以防止酚類物質(zhì)的污染而引起組織褐化死亡。在蘭花組織

45、培養(yǎng)中的效果更明顯。另外，活性炭使培養(yǎng)基變黑，有利于某些植物生根。活性炭對(duì)形態(tài)發(fā)生和器官形成有良好的效應(yīng)。 n常用濃度為0.10.5%。二、二、 培養(yǎng)基的配制培養(yǎng)基的配制n準(zhǔn)備工作準(zhǔn)備工作 n母液的配制和保存母液的配制和保存 n培養(yǎng)基配制程序培養(yǎng)基配制程序培養(yǎng)基配制程序培養(yǎng)基配制程序 1. 水和藥品水和藥品 n用于配制培養(yǎng)基的水最好是用玻璃容器蒸餾過(guò)的蒸餾水 或去離子水；n化學(xué)藥品應(yīng)盡可能采用分析純或化學(xué)純級(jí)別的試劑 ；n生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)在應(yīng)用前有時(shí)還需要進(jìn)行重結(jié)晶或選用純度更高的 ；n蛋白質(zhì)水解物最好是用酶水解的 ；n藥品的稱量及定容都要準(zhǔn)確 。2. 母液的配制和保存母液的配制和保存n配制培養(yǎng)基

46、最方便的方法是預(yù)先配制好不同組分的培養(yǎng)基母液，配成培養(yǎng)基配方使用濃度的10倍100倍，甚至1000倍；n在配制母液時(shí)為減少工作量可以把幾種藥品（如培養(yǎng)基中的大量元素或微量元素）配在同一母液中，但應(yīng)注意各種化合物的組合以及加入的先后順序，以免發(fā)生沉淀 ；n鐵鹽宜單獨(dú)配制 ；n對(duì)于植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)，配制成母液時(shí)，通常用mg/ml較為方便，一般宜配制成0.5mg/ml的母液，這樣的濃度既便于計(jì)算也可避免冷藏時(shí)形成的結(jié)晶。 由于多數(shù)生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)難溶于水，因此配法各不相同：nIAA，IBA和GA3可先用少量95%酒精溶解，再加水定容，搖勻后貯于試劑瓶中，貼上標(biāo)簽后存放在冰箱中；NAA可溶于熱水或少量95

47、%酒精中，再加水定容至一定體積；n2，4-D不溶于水，可用少量1N的NaOH溶解后，再加水定容；KT和6-BA應(yīng)先溶于少量1N的HCl中，再加水定容；n玉米素先溶于少量95%的酒精中再加水定容至一定濃度。n椰子汁的活性成分是耐熱的，椰子汁從椰子中倒出后應(yīng)立即煮沸過(guò)濾去除蛋白質(zhì)，高壓消毒后貯于-20低溫冰箱中備用。 3. 培養(yǎng)基配制程序 三、常用培養(yǎng)基及其特點(diǎn)nMS培養(yǎng)基是1962年Murashige和Skoog為培養(yǎng)煙草材料而設(shè)計(jì)的。特點(diǎn)是無(wú)機(jī)鹽的濃度高，有加速愈傷組織生長(zhǎng)的作用，能滿足植物組織對(duì)礦質(zhì)營(yíng)養(yǎng)的要求。銨鹽和硝酸鹽含量高，比例也較為合適，也不需要添加更多的有機(jī)附加物，這是目前應(yīng)用的最

48、廣泛的一種培養(yǎng)基。與MS較為接近的還有LS、RM、等培養(yǎng)基。nN6培養(yǎng)基是1974年由我國(guó)的朱至清等為水稻等禾谷類作物花藥培養(yǎng)而設(shè)計(jì)的，其KNO3和（NH4）2SO4高且不含鉬。目前在國(guó)內(nèi)已廣泛用于小麥、水稻及其它植物的花粉和花藥的培養(yǎng)和其它的組織培養(yǎng)。 nB5培養(yǎng)基它的主要特點(diǎn)是含有較低的銨鹽，該營(yíng)養(yǎng)成分可能對(duì)不少培養(yǎng)物的生長(zhǎng)有抑制作用，對(duì)有些植物如雙子葉植物特別是木本植物更加適合。第三節(jié) 外植體的選擇與培養(yǎng)外植體的選擇外植體的選擇 1外植體的滅菌外植體的滅菌 2外植體的接種培養(yǎng)外植體的接種培養(yǎng)3外植體的成苗途徑外植體的成苗途徑4污染的原因及其預(yù)防措施污染的原因及其預(yù)防措施 5外植體的褐變及

49、其防止措施外植體的褐變及其防止措施 6培養(yǎng)物的玻璃化現(xiàn)象及其預(yù)防措施培養(yǎng)物的玻璃化現(xiàn)象及其預(yù)防措施 7一、外植體的選擇 n1.選擇優(yōu)良品種n2.選擇健壯植株n3.選擇最適時(shí)期n4.選擇適宜的大小n0.51.0cm 二、外植體的滅菌n1.外植體滅菌的流程把采來(lái)的材料事先截剪，除去不用的部分將需要的部分仔細(xì)弄干凈，用流水沖洗肥皂水浸洗 自來(lái)水沖洗70%75%的酒精浸泡30s滅菌劑滅菌無(wú)菌水沖洗遍35遍接種。n2. 滅菌劑的種類n（1）70%75%酒精n比其他濃度的酒精殺菌效果強(qiáng)，組織穿透力也強(qiáng)。它對(duì)材料氣泡內(nèi)空氣進(jìn)行殺菌，可以濕潤(rùn)材料，有利于其他消毒劑的滲入，具濕潤(rùn)和殺菌的雙重作用。n酒精滅菌時(shí)間

50、不宜過(guò)長(zhǎng)，浸漬30s可達(dá)表面滅菌。因不能徹底殺菌，往往需用其他滅菌劑滅菌。n（2）氯化汞n這是一種重金屬化合物 ，有劇毒 。對(duì)人、動(dòng)物和植物的毒性非常大。常用濃度為1%，處理時(shí)間510min，殺菌效果好，但殘毒很大。外植體滅菌后，需用無(wú)菌水沖洗至少35次。n（3）次氯酸鈉n濃度可為2%10%，消毒時(shí)間1530min，殺菌效果比較好，很容易去除，對(duì)植物無(wú)害。n（4）漂白粉n這是一種常用的低毒的消毒劑，是含有多種成分的復(fù)合化合物，一般含10%20%的次氯酸鈣。使用濃度一般為5%10%，或飽和溶液，取其上清液，處理1030min，殺菌效果好，且不傷組織，容易洗凈。n（5）次氯酸鈣n粉狀，可以很好溶解

51、于水，待澄清后取上清液用以消毒，常用濃度為9%10%，消毒時(shí)間為530min。次氯酸鈣進(jìn)入植物組織內(nèi)的速度低于次氯酸鈉。由于它易潮解，只能存儲(chǔ)有限時(shí)間。三、外植體的接種和培養(yǎng)n（一）外植體的接種無(wú)菌操作外植體的接種是把經(jīng)外植體的接種是把經(jīng)過(guò)表面滅菌后的植物過(guò)表面滅菌后的植物材料切碎或分離出器材料切碎或分離出器官、組織、細(xì)胞，轉(zhuǎn)官、組織、細(xì)胞，轉(zhuǎn)放到無(wú)菌培養(yǎng)基上的放到無(wú)菌培養(yǎng)基上的全部操作過(guò)程。全部操作過(guò)程。 n1無(wú)菌操作n（1）接種4h前用甲醛熏蒸接種室，并打開其內(nèi)紫外燈進(jìn)行滅菌； n（2）在接種前20min，打開超凈工作臺(tái)的風(fēng)機(jī)以及臺(tái)上的紫外燈；n（3）接種員先洗凈雙手，在緩沖間換好專用實(shí)

52、驗(yàn)服，并換穿托鞋等；n（4）上工作臺(tái)后，用（70%）酒精棉球擦拭工作臺(tái)面；然后擦拭雙手，特別是指甲處。n（5）先用酒精棉球擦拭接種工具，再將鑷子和剪子從頭至尾過(guò)火一遍，然后反復(fù)過(guò)火尖端處，對(duì)培養(yǎng)皿要過(guò)火烤干；n（6）接種時(shí)，接種員雙手不能離開工作臺(tái)，不能說(shuō)話、走動(dòng)和咳嗽等；n（7）接種完畢后要清理干凈工作臺(tái)，可用紫外燈滅菌30min。若連續(xù)接種，每5天要大強(qiáng)度滅菌一次。123456n2. 接種n(1) 將初步洗滌及切割的材料放入燒杯，帶入超凈臺(tái)上，用消毒劑滅菌，再用無(wú)菌水沖洗，最后瀝去水分，取出放置在滅過(guò)菌的4層紗布上或?yàn)V紙上。n(2) 材料吸干后，一手拿鑷子，一手拿剪子或解剖刀，對(duì)材料進(jìn)行適

53、當(dāng)?shù)那懈睢Ｔ诮臃N過(guò)程中要經(jīng)常灼燒接種器械，防止交叉污染。n(3) 用灼燒消毒過(guò)的器械將切割好的外植體插植或放置到培養(yǎng)基上。 n（二）外植體的培養(yǎng)n1.光照n通常對(duì)愈傷組織的誘導(dǎo)來(lái)說(shuō)，暗培養(yǎng)比光培養(yǎng)更適合，但器官的分化需要光照。 n每日光照1216h，光照度10005000lx n如果培養(yǎng)材料要求在黑暗中生長(zhǎng)，可用鋁箔或者適合的黑色材料包裹在容器的周圍，或置于暗室中培養(yǎng)。n2.溫度n大多數(shù)植物在2332之間。n培養(yǎng)室一般所用的溫度是252。低于15或高于35，對(duì)生長(zhǎng)都不利。n3.濕度n培養(yǎng)容器內(nèi)的濕度；培養(yǎng)室的濕度 n要求室內(nèi)保持70%80%的相對(duì)濕度。n4.氧氣n液體培養(yǎng)：振蕩培養(yǎng)n固體培養(yǎng)：

54、采用通氣性好的瓶蓋或瓶塞。四、外植體的成苗途徑外植體外植體愈傷組織愈傷組織根、芽根、芽芽芽根根根根芽芽根、芽根、芽胚狀體胚狀體試試管管苗苗從器官上發(fā)生從器官上發(fā)生 從愈傷組織發(fā)生從愈傷組織發(fā)生 從游離單細(xì)胞發(fā)生從游離單細(xì)胞發(fā)生 從小孢子發(fā)生從小孢子發(fā)生數(shù)量多數(shù)量多 速度快速度快 結(jié)構(gòu)完整結(jié)構(gòu)完整五、污染的原因及其預(yù)防措施n（一）污染的原因n污染：指在組織培養(yǎng)過(guò)程中培養(yǎng)基和培養(yǎng)材料滋生雜菌，導(dǎo)致培養(yǎng)失敗的現(xiàn)象。n污染的原因：n病原菌污染：細(xì)菌、真菌；n污染的途徑n外植體、培養(yǎng)基、培養(yǎng)器皿帶菌；n操作人員未遵守操作規(guī)程等。n（二）污染的預(yù)防措施n1防止材料帶菌的措施n取材以春夏生長(zhǎng)旺季，當(dāng)年生的嫩

55、梢為佳；n應(yīng)盡量選擇晴天中午進(jìn)行；n取離體枝梢在潔凈空氣條件下抽芽，然后從新生組織中取材接種。n2. 外植體的滅菌n根據(jù)不同材料選擇合適的消毒劑和消毒方法。對(duì)于材料內(nèi)部帶菌的組織，有時(shí)還需在培養(yǎng)基中加入適量抗生素。n多次滅菌法；n多種藥液交替浸泡法。n3. 器皿與金屬器械的滅菌n4.布質(zhì)制品及無(wú)菌操作室的滅菌n5.操作人員嚴(yán)格按照無(wú)菌操作的程序進(jìn)行接種六、外植體的褐變及其防止措施n褐變是指外植體在培養(yǎng)過(guò)程中，體內(nèi)的多酚氧化酶被激活，使細(xì)胞里的酚類物質(zhì)氧化成棕褐色的醌類物質(zhì)，這種致死性的褐化物不但向外擴(kuò)散致使培養(yǎng)基逐漸變成褐色，而且還會(huì)抑制其他酶的活性，嚴(yán)重影響外植體的脫分化和器官分化，最后變褐

56、而死亡的現(xiàn)象。n（一）褐變的原因植物品種n多酚氧化酶活性上的差異。生理狀態(tài)n老熟的組織褐變程度較幼嫩的組織嚴(yán)重。培養(yǎng)基成分n無(wú)機(jī)鹽和細(xì)胞分裂素濃度過(guò)高。培養(yǎng)條件不當(dāng)n如果光照過(guò)強(qiáng)、溫度過(guò)高、培養(yǎng)時(shí)間過(guò)長(zhǎng)。n（二）褐變的防止措施1.選擇合適的外植體n一般來(lái)說(shuō)，最好選擇生長(zhǎng)處于旺盛的外植體，這樣可以使褐變現(xiàn)象明顯減輕。2.合適的培養(yǎng)條件n無(wú)機(jī)鹽成分、植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)水平、適宜溫度、及時(shí)繼代培養(yǎng)均可以減輕材料的褐變現(xiàn)象。 3.使用抗氧化劑n半胱氨酸、抗壞血酸；4.連續(xù)轉(zhuǎn)移n對(duì)容易褐變的材料可間隔1224h的培養(yǎng)后，再轉(zhuǎn)移到新的培養(yǎng)基上，連續(xù)處理7l0d。5.加活性炭n0.1%0.5%的活性炭對(duì)吸附酚類氧化物的效果很明顯。七、培養(yǎng)物的玻璃化現(xiàn)象及其預(yù)防措施n（一）玻璃化現(xiàn)象及其產(chǎn)生原因