第七章 細胞培養(yǎng)技術(shù)

1、第七章細胞培養(yǎng)技術(shù) 細胞培養(yǎng)(cellculture)是指從生物體內(nèi)取出組織或細胞，在體外模擬體內(nèi)生理環(huán)境，在無菌、適當溫度和一定營養(yǎng)條件下，使之生存、生長和繁殖，并維持其結(jié)構(gòu)和功能的方法。由于體外培養(yǎng)的細胞其結(jié)構(gòu)和功能接近體內(nèi)情況，便于使用各種技術(shù)和方法進行研究，并能在較長時間內(nèi)直接觀察細胞生長、發(fā)育、分化過程中的形態(tài)和功能變化，而且可同時提供大量生物學(xué)性狀相似的細胞作為研究對象，因此，細胞培養(yǎng)已經(jīng)成為現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究中一項非常重要的技術(shù)。但是，細胞培養(yǎng)作為一種研究技術(shù)也有其局限性，主要是細胞離體以后失去與其周圍環(huán)境的密切關(guān)系，其生物學(xué)性質(zhì)必然會發(fā)生某些改變，該因素也不可忽略。 近年來，細胞培養(yǎng)

2、技術(shù)已廣泛地應(yīng)用于生物學(xué)的各個領(lǐng)域，如細胞生物學(xué)、分子生物學(xué)、遺傳學(xué)、藥理學(xué)、免疫學(xué)、細胞工程、老年學(xué)、腫瘤學(xué)和病毒學(xué)以及臨床學(xué)科基礎(chǔ)研究，并取得了豐碩成果。 細胞培養(yǎng)不但是一門技術(shù)，而且是一門科學(xué)，它有基本理論、基本知識和基本方法。為了使學(xué)生更好地掌握這門技術(shù)，我們在本章中主要介紹以下內(nèi)容：細胞培養(yǎng)的基本原理與技術(shù)；細胞的原代培養(yǎng)和傳代培養(yǎng)；培養(yǎng)細胞的一般觀察方法；培養(yǎng)細胞增殖動力學(xué)方法和培養(yǎng)細胞的凍存技術(shù)等內(nèi)容。第一節(jié) 細胞培露的基本原理與技術(shù) 細胞培養(yǎng)不但是一門技術(shù)也是一門科拿，有專門的理論、技術(shù)和方法。要想更好地學(xué)習和掌握細胞培養(yǎng)技術(shù)，應(yīng)該首先學(xué)習細胞培養(yǎng)的基本原理與基本技術(shù)。細胞培養(yǎng)

3、的基本技術(shù)目的要求 (1)掌握體外培養(yǎng)細胞的生存條件。 (2)熟悉培養(yǎng)用品的清洗與消毒原則。 (3)初步了解無菌操作的基本要領(lǐng)和要求。實驗原理 細胞培養(yǎng)是一種程序復(fù)雜、要求嚴謹?shù)膶嶒灱夹g(shù)。要使細胞在體外長期生存，必須模擬體內(nèi)環(huán)境，供給細胞存活所必須的條件，如水、無機鹽、氨基酸、維生素、葡萄糖、生長因子(8rowth 5actor)等，還要受到溫度、滲透壓、pH等多種因素的影響。細胞培養(yǎng)用品的清洗、培養(yǎng)用液的配制、除菌等均有嚴格的要求，持別是無菌操作，是細胞培養(yǎng)成敗的關(guān)鍵。為此本次實驗分兩部分進行，理論部分重點介紹體外培養(yǎng)細胞的生存條件、培養(yǎng)用品的清洗與消毒、無菌操作基本要領(lǐng)和要求及細胞培養(yǎng)用液

4、；實踐部分分別在細胞培養(yǎng)室、細胞培養(yǎng)準備室進行。試驗用品 co 2培養(yǎng)箱、超凈工作臺、電冰箱、離心機、倒置相差顯微鏡、普通顯微鏡、水純化裝置、拍濾裝置、電子天平、液氯題、洗刷裝置、各類培養(yǎng)用品等。t內(nèi)容與方法(一)培養(yǎng)細胞的生存條件 體外培養(yǎng)細胞所需要的生存條件和物質(zhì)代謝生存環(huán)境的改變也會出現(xiàn)一定的差異。 1.水的質(zhì)量 水對維持培養(yǎng)細胞的生命活動是十分重要的。體外培養(yǎng)的細胞對水的質(zhì)量非常敏感，在培養(yǎng)用液中任何對細胞有害的物質(zhì)都會影響培養(yǎng)細胞的生存。因此，要求培養(yǎng)細胞用液必須使用新鮮三蒸水或去離子水配制。 2天蓖環(huán)境 防止污染是保證細胞在體外存的基本條件之一。在培養(yǎng)環(huán)境中不得有細菌、病毒、支原體

5、、真菌或其他微生物的存在，因此，在細胞培養(yǎng)過程中要努力做到最大限度的無菌。要保持無菌環(huán)境，必須嚴格做到：細胞培養(yǎng)用品要經(jīng)高壓滅菌處理后才能使用，培養(yǎng)用液要經(jīng)過除菌處理，實驗過程要嚴格按照無菌操作規(guī)程進行。 3溫度 適宜的溫度是保證細胞在體外生存的重要條件，人和哺乳動物的細胞員適宜的培養(yǎng)溫度為365土o5，偏離這一溫度范圍，細胞的正常代謝會受到影響，甚至死亡。一般來說，培養(yǎng)細胞對低溫的耐受性比對高溫要強。溫度不超過39時，細胞代謝的強度與溫度呈正比。培養(yǎng)溫度高至4142時，細胞只能生存很短的一段時間，10一24h后即行退變或死亡。培養(yǎng)溫度低至2535時，細胞仍能生存和生長，但速度緩慢。細胞在4能

6、存活數(shù)天，若溫度降至冰點以下，則細胞可因胞質(zhì)結(jié)冰而死亡。 4滲透壓 人血漿滲透壓約290 mm01L(290 mOsmk8)，可視為培養(yǎng)細胞的理想滲透壓。對大多數(shù)細胞來說，滲透壓在260一320mm01兒(260一320 mOsm兒8)范圍都適宜。 多數(shù)培養(yǎng)細胞的適宜pH為7o一74，偏離此范圍會對細胞產(chǎn)生有害影響。但各種細胞對pH的要求也不完全相同，一般情況下原代培養(yǎng)的細胞對pH的變動耐受差，連續(xù)性細胞系(株)耐受性強?？偟膩碚f，細胞耐酸性比耐堿性大一些。 細胞培養(yǎng)中02和cO s是細胞生存所需要的重要條件。02參與三羧酸循環(huán)可為細胞提供能量。c02既是細胞代謝產(chǎn)物，也是細胞所需成分，并與維持培養(yǎng)液的pH有直接關(guān)系。 體外培養(yǎng)的細胞所需營養(yǎng)必須從培養(yǎng)液中獲取。當前在細胞培養(yǎng)中，廣泛使用合成培養(yǎng)基，其主要成分由氨基酸、維生意、碳水化臺物、無機鹽和其他一些輔助物質(zhì)組成。根據(jù)培養(yǎng)對象和目的不同，已設(shè)計出多種培養(yǎng)基，常用的有：Tcl99、RPMI1640、Ea日1es MEM、DMEM、HamsFl0與F12等*對于動物細胞來說，合成培養(yǎng)基只能維持細胞的生存，要想使細胞更好地生長和繁殖，