調(diào)節(jié)性T細(xì)胞在肝再生增強(qiáng)因子免疫抑制機(jī)制中的作用研究

1、 英漢縮略語名詞對照英文縮寫英文全稱中文全稱ALRAugmenter of liver regeneration肝再生增強(qiáng)因子ALTAlanine transarninase丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶ASTGlutamic-oxal(o)acetic transaminase谷草轉(zhuǎn)氨酶AIHAuimmune Hepatitis自身免疫性肝炎BSABovine serum albumin牛血清白蛋白cDNAComplementary deoxynucleic acid互補(bǔ)脫氧核糖核酸ConAConcanavalin A刀豆蛋白ACTLCytotoxic T lymphocyte細(xì)胞毒性T細(xì)胞cAMPCycli

2、c adenosine monophosphate環(huán)腺苷酸CTLA4Cytotoxic T lymphocyte associated antigen-4細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞相關(guān)抗原4DC Dendritic cell樹突狀細(xì)胞DNADeoxynucleic acid脫氧核糖核酸EdU5-ethyl-2，-deoxyuridine,aedurid5-乙基-2，-脫氧尿苷EGFEpidermal growth factor表皮生長因子ELISAEnzyme-linked immunoabsorbent Assay酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)FCMFlow cytometer流式細(xì)胞術(shù)FITCFluorescei

3、n Isothiocyannate異硫氰酸熒光素FBSFetal bovine serum胎牛血清Foxp3Forkhead box protein P3 叉頭翼螺旋轉(zhuǎn)錄因子 P3GITRGlucocorticoid-induced tumor necrosis factorreceptor糖皮質(zhì)激素誘發(fā)型腫瘤壞死因子會受體HBsAgHepatitis B virus surface antigen乙肝病毒表面抗原h(huán)ALRHuman augmenter of liver regeneration人肝再生增強(qiáng)因子HBVHepatitis B virus乙肝病毒HSSHepatic stimula

4、tor substance肝臟刺激物HCCHepatocellular carcinoma肝細(xì)胞肝癌IL-2RInterleukin-2 receptoer白介素-2受體IFN-Interferon-干擾素-IL-10Interleukin-10白介素-10iTregInduced Treg誘導(dǎo)性調(diào)節(jié)性T細(xì)胞IL-2Interleukin-2白介素-2MHV-3Mouse hepatitis virus-33型鼠肝炎病毒mRNAMessage ribonucleic acid信使核糖核酸mDCMyeloid dendritic cells髓系樹突狀細(xì)胞NKNatrual killer自然殺傷細(xì)

5、胞nTregNatural Treg天然調(diào)節(jié)性T細(xì)胞ODOptical density光密度PBSPhospate buffered saline磷酸鹽緩沖溶液PSPhysiological saline生理鹽水pDCPlasmacytoicytoid dentritic cells漿細(xì)胞樣樹突狀細(xì)胞PBCPrimary bliary cirrhosis膽汁性肝硬化rALRRat augmenter of liver regeneration鼠肝再生增強(qiáng)因子rpmRevolution per minute每分鐘轉(zhuǎn)速TregRegulatory T cell調(diào)節(jié)性T細(xì)胞TGF-Transform

6、ing growth factor-轉(zhuǎn)化生長因子-調(diào)節(jié)性T細(xì)胞在肝再生增強(qiáng)因子免疫抑制機(jī)制中的作用研究 摘 要目的： 肝再生增強(qiáng)因子（Augmenter of liver regeneration，ALR）是一種非器官特異性的細(xì)胞因子，除能促進(jìn)肝細(xì)胞DNA合成外，還具有免疫調(diào)節(jié)功能，然而其發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用的機(jī)制還不清楚。樹突狀細(xì)胞（ Dendritic cell，DC）是專職抗原提呈細(xì)胞，有研究稱不成熟DC細(xì)胞可以誘導(dǎo)Treg細(xì)胞的比例增加或促使效應(yīng)T細(xì)胞無能引起免疫耐受。調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Regulatory T cell，Treg）是一群具有免疫調(diào)控作用的淋巴細(xì)胞亞群。有研究發(fā)現(xiàn)肝癌細(xì)胞可以分

7、泌ALR,其上清液可以促進(jìn)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的分化發(fā)育。因此，本研究通過觀察hALR(Human augmenter of liver regeneration，hALR)對ConA刺激的純化T淋巴細(xì)胞的增殖及其中調(diào)節(jié)性T細(xì)胞比例以及上清中TGF-1、IL-10水平的影響；hALR對ConA刺激的人外周血單個核細(xì)胞（Peripheral blood mononuclear cells，PBMC）的增殖及其中調(diào)節(jié)性T細(xì)胞比例和樹突狀細(xì)胞表型以及上清中TGF-1、IL-10水平的影響；TGF-1抗體對hALR影響Treg細(xì)胞的逆轉(zhuǎn)作用，探討hALR發(fā)揮免疫抑制作用的機(jī)制。方法：1 用免疫磁珠法分離純化C

8、D3+T細(xì)胞，分別設(shè)空白組(Normal組）、ConA組、ConA+hALR組、hALR組。體外孵育60h后采用EdU檢測純化T細(xì)胞增殖情況，流式細(xì)胞術(shù)檢測CD4+CD25+FoxP3+Treg細(xì)胞的比例，ELISA檢測上清中TGF-1和IL-10的水平。2 分離外周血單個核（PBMC）細(xì)胞，分別設(shè)空白組（Normal組）、ConA組、ConA+hALR組、hALR組。體外孵育24h、48h、60h后用EdU檢測PBMC增殖情況，流式檢測CD4+CD25+FoxP3+Treg細(xì)胞比例和樹突狀細(xì)胞表型（CD86）分子表達(dá)，ELISA檢測上清中TGF-1和IL-10的水平。3 分離外周血單個核細(xì)胞

9、，分別設(shè)空白組（Normal組）、ConA組、ConA+hALR組、ConA+hALR+anti-TGF-1組、hALR組。體外孵育60h后用EdU檢測PBMC增殖情況，流式細(xì)胞術(shù)檢測CD4+CD25+FoxP3+Treg細(xì)胞的比例。結(jié)果：1 60h時，與Normal組相比，ConA組對T細(xì)胞無明顯促增殖作用，對Treg細(xì)胞也無促進(jìn)比例增加的作用，且不能促進(jìn)TGF-1和IL-10分泌（P>0.05）；與ConA組、hALR組相比，ConA+hALR組對T細(xì)胞無明顯抑制作用，對Treg細(xì)胞無促進(jìn)比例增加作用，也不能促進(jìn)TGF-1和IL-10分泌（P>0.05）。2 與Normal組相

10、比，ConA組能促進(jìn)PMBC增殖，促進(jìn)Treg細(xì)胞比例增加以及上清中TGF-1分泌增加（P<0.01），且均隨時間（24h、48h、60h）增加而逐漸增強(qiáng)；與ConA組、hALR組相比，ConA+hALR組能抑制PMBC增殖，更進(jìn)一步促進(jìn)Treg細(xì)胞比例增加以及上清中TGF-1分泌增加（P<0.01），且均隨時間（24h、48h、60h）增加而逐漸增強(qiáng)。3：24h和48h時，hALR均不能下調(diào)ConA刺激的PBMC中DC細(xì)胞CD86分子的表達(dá)。60h時，與Normal組相比，ConA組能下調(diào)DC細(xì)胞CD86分子的表達(dá)（P<0.01）；與ConA組、hALR組相比，ConA+h

11、ALR組能更進(jìn)一步下調(diào)CD86分子的表達(dá)（P<0.01）。4：60h時，hALR能促進(jìn)ConA刺激和ConA未刺激的PMBC中IL-10分泌增加，與ConA組、hALR組相比（P<0.01）。 5：60h時，TGF-1抗體能有效逆轉(zhuǎn)ConA+hALR組對Treg細(xì)胞促進(jìn)比例增加的作用，與ConA+hALR組相比（P<0.01)，但卻不能逆轉(zhuǎn)ConA+hALR組對PBMC的抑制作用，與ConA+hALR組相比（P>0.05）。結(jié)論：1：ConA對純化的T淋巴細(xì)胞無明顯促增殖作用，也不改變Treg細(xì)胞的比例和影響TGF-1和IL-10分泌。2：hALR單獨(dú)或與ConA一起對

12、純化的T淋巴細(xì)胞增殖、Treg細(xì)胞的比例以及TGF-1和IL-10的分泌均無明顯影響。3：ConA可以促進(jìn)PBMC增殖，促進(jìn)Treg細(xì)胞比例增加和TGF-1分泌增加；hALR能抑制ConA刺激的PBMC增殖，促進(jìn)Treg細(xì)胞比例增加和TGF-1分泌增加；hALR還能促進(jìn)60h時ConA刺激的PBMC中IL-10的分泌增加，說明hALR對ConA刺激的PBMC的抑制作用可能是通過Treg細(xì)胞、TGF-1、IL-10共同或/和部分起作用。4: hALR可以抑制ConA刺激的PBMC中DC細(xì)胞表面CD86的表達(dá)，使DC細(xì)胞表面分子表達(dá)降低，可能誘導(dǎo)效應(yīng)T細(xì)胞增殖減少從而抑制免疫反應(yīng)。5：TGF-1抗

13、體能有效逆轉(zhuǎn)hALR對Treg細(xì)胞促進(jìn)比例增加的作用，但卻不能逆轉(zhuǎn)hALR對PBMC增殖的抑制作用，說明hALR的免疫抑制作用并非完全依賴Treg細(xì)胞。 關(guān)鍵詞：肝再生增強(qiáng)因子，人外周血單個核細(xì)胞，樹突狀細(xì)胞，細(xì)胞因子，調(diào)節(jié)性T細(xì)胞，THE EFFECT OF IMMUNOSUUPPRESSIVE MECHANISMS OF REGULATORY T CELLS IN AUGMENTER OF LIVER REGENERATION ABSTRACT Objective: Augmenter of liver regeneration(ALR) is a organ non-specific f

14、actors that promote regeneration and has proven immunoloregulation, but its mechanism is not yet clear. Dendritic cells are the professional antigen presenting cells, studies have found immature DC cells induced immune tolerance incompetence Mainly through increased Treg cells proportion or induced

15、effetor T cells. Regulatory T cells is a group of nover immunomodulatory effects found with lymphocyte subsets.Studies have found that liver cancer cells can secrete ALR, the supernatant can promote the differentiation and development of regulatory T cells.This study is to observe the effects of pur

16、ified hALR proliferation of T lymphocytes stimulated by ConA and the proportion of regulatory T cells and supernatant TGF-1, IL-10 levels; the effect of human Augmenter of liver regeneration (hALR) on proliferation of regulatory T cell and dendritic cell phenotype and expression levels of the inhibi

17、tory cytokines TGF-1、IL-10 in ConA-stimulated human peripheral blood mononuclear cells (PBMC) , to evaluate the immunosuppressive mechanism of hALR. Methods: 1: T cells was separated and located Control group(Normal group)、ConA group 、ConA + hALR group and hALR group in vitro for 60h, EdU was used t

18、o detect the proliferation,flow cytometry was used to detect the CD4 + CD25 + FoxP3 + Treg cells. 2: PBMC was isolated and located Control group(Normal group)、ConA group、ConA + hALR group and hALR group in vitro for 24h、48h and 60h, EdU was used to detect the proliferation, flow cytometry was used t

19、o detect the CD4 + CD25 + FoxP3 + Treg cells and the CD86 phenotype of DC in 60h, ELISA was used to detect the level of TGF-1 and IL-10 in the supernatant. 3: PBMC was isolated and located Control group(Normal group)、ConA group、ConA + hALR group、ConA + hALR + anti-human TGF-1 group (ConA+ hALR + ant

20、i-TGF-1 group) and hALR group in vitro for 60h, EdU was used to detect the proliferation,flow cytometry was used to detect the CD4 + CD25 + FoxP3 + Treg cells. Results: 1: 60h, Compared with the Normal group, ConA group could not promote the T cells, Treg cells and TGF-1 and IL-10 secretion(P> 0.

21、05); compared with ConA group, hALR group, ConA + hALR group could not inhibit T cells and could not promote Treg cell proliferation and the supernatant of TGF-1 and IL-10 secretion (P> 0.05). 2: Compared with the Normal group, ConA group can promote PMBC proliferation and increase the proportion

22、 of Treg cells and the secretion of TGF-1 in the supernatant increased (P <0.01), and both increase with time gradually increased; compared with ConA group, hALR group , ConA + hALR PMBC group can inhibit proliferation and promote Treg cell ratio and increased secretion of TGF-1 in the supernatan

23、t (P <0.01), and were increased gradually increased over time. 3: 24h and 48h , hALR can not be reduced ConA-stimulated PBMC in DC cells expressing CD86 molecule; 60h, compared with the Normal group, ConA group can decrease the expression of CD86 molecules DC cells (P <0.01); compared with Con

24、A group, hALR group, ConA + hALR could significantly decrease the expression of CD86 (P <0.01) 4: 60h, hALR could promote the secretion of IL-10 in ConA-stimulated PMBC, compared with ConA group, hALR group (P <0.01). 5: 60h, The Treg proliferation in activated-PBMC could effectively reverse b

25、y TGF-1 neutralizing antibody, compared with the ConA+hALR group(P <0.01), but the inhibition of activated PBMC by hALR could not reversed, compared with the ConA+hALR group(P> 0.05).Conclusions:1: ConA could not stimulate the proliferation of puried T cells, nor alter the proportion of Treg c

26、ells and effects of TGF-1 and IL-10 secretion.2: hALR alone or together with ConA had no significant effect to the proliferation of purified T lymphocytes with ConA, the proportion of Treg cells and the secretion of TGF-1 and IL-10.3: ConA can promote PBMC proliferation and increase the proportion o

27、f Treg cells and increased secretion of TGF-1; hALR raised the levels of TGF-1 in ConA-stimulated PBMC supernatants, and increased the proportion of CD4 + CD25 + Foxp3 + Treg cells , hALR also promote increased secretion 60h ConA-stimulated PBMC of IL-10, indicating hALR on ConA-stimulated PBMC may

28、be through inhibition of Treg cells, TGF-1, IL-10 jointly or / and some work.4: hALR could inhibit the expression of DC cell surface CD86, and inhibit the immune response of the DC activation function, to suppress effector T cell immune response. 5: The Treg proliferation in activated-PBMC could eff

29、ectively reverse by TGF-1 neutralizing antibody, but the inhibition of activated PBMC by hALR could not reversed, hALR immunosuppression is not completely dependent on Treg cells Key words: Augmenter of liver regeneration, regulatory T cell, Cytokine, human peripheral blood mononuclear cells, Dendri

30、tic cell調(diào)節(jié)性T細(xì)胞在肝再生增強(qiáng)因子免疫抑制機(jī)制中的作用研究 前 言慢性乙型肝炎在我國發(fā)病率高、危害嚴(yán)重，由于病情反復(fù)，一部分患者最后發(fā)展為末期肝臟疾病，對健康造成了嚴(yán)重影響。因此，深入研究各種肝臟相關(guān)疾病，對于治療和控制疾病的病程具有重要意義1。LaBrecque2等于1975年在肝部分切除術(shù)大鼠再生肝胞質(zhì)中發(fā)現(xiàn)一種促肝細(xì)胞DNA合成的因子，稱為肝臟刺激物（Hepatic stimulator substance，HSS）。Hagiya3等于1994年在新生大鼠肝組織中克隆出一種不同于肝細(xì)胞生長因子(Hepatic growth factor，HGF)、表皮生長因子（Epiderma

31、l growth factor，EGF）并且可以促進(jìn)肝細(xì)胞DNA合成的細(xì)胞因子，稱為肝再生增強(qiáng)因子（Augmenter of liver regeneration，ALR）。其與啤酒酵母ERV1基因產(chǎn)物有很高的同源性（C末端有50%同源性），因此，屬于ALR/ERV家族4。研究發(fā)現(xiàn)，ALR在肝癌細(xì)胞、肝硬化等中呈高表達(dá)，在正常肝細(xì)胞中幾乎不表達(dá)5-6。在CCl4大鼠肝纖維化模型中，ALR能促進(jìn)肝細(xì)胞DNA合成，抑制血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）的分泌7-8。此外，ALR還具有免疫調(diào)控作用：在肝部分切除術(shù)后ALR表達(dá)增加，抑制NK細(xì)胞活性和減少IFN-產(chǎn)生，降低肝臟的免疫損害9-

32、11；ALR能從體外抑制經(jīng)體內(nèi)致敏的脾淋巴細(xì)胞增殖12；大鼠肝再生增強(qiáng)因子（Rat augmenter of liver regeneration，rALR）能抑制刀豆蛋白（Concanavalin A，ConA）活化的大鼠脾單個核細(xì)胞（Peripheral blood mononuclear cell，PBMC）的增殖；用肝干細(xì)胞與ALR聯(lián)合治療急性肝衰竭患者，其效果明顯優(yōu)于單純的肝干細(xì)胞治療13；HBV感染的早期慢加急性肝衰竭患者，血清中ALR的水平較正常人明顯增加，且存活組血清ALR的水平較死亡組增加更明顯14-15。由此可見，不論是ALR的促進(jìn)肝細(xì)胞DNA合成作用還是ALR的免疫調(diào)控作

33、用，都參與許多肝臟疾病。調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞（Regulatory T cell，Treg）是一類重要的淋巴細(xì)胞亞群，它們除了具有調(diào)控機(jī)體的免疫反應(yīng)強(qiáng)度，維持自身免疫耐受的作用外，還具有參與腫瘤免疫逃逸、誘導(dǎo)移植耐受等作用。Sakaguchi16等于1995年在小鼠外周血中分離出一類T細(xì)胞，此類T細(xì)胞即調(diào)節(jié)性細(xì)胞。其可分為天然來源的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Naturally occurring regulatory T cell, nTreg)和外周誘導(dǎo)的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Induced regulatory T cell, iTreg)，前者由胸腺T細(xì)胞發(fā)育而來，約占CD4+T細(xì)胞的5%-10%17-19；后

34、者又可以繼續(xù)分為以分泌IL-10為主的Tr1細(xì)胞，分泌TGF-、IL-4為主的Th3細(xì)胞20。Treg細(xì)胞除了表達(dá)CD25(IL-2R)外、還表達(dá)CD45R、CD103、人細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞相關(guān)抗原（CTLA4）、Foxp3等。其中Foxp3屬于叉頭/翼狀2螺旋轉(zhuǎn)錄因子家族，在Treg細(xì)胞核內(nèi)高表達(dá)，是Treg細(xì)胞分化增殖、發(fā)揮作用的關(guān)鍵因子20-22。TGF-、IL-10等抑制性細(xì)胞因子可以由Treg細(xì)胞分泌23、24，同時研究表明在體外特定環(huán)境下TGF-可以促進(jìn)初始T細(xì)胞向Treg細(xì)胞轉(zhuǎn)化25；當(dāng)有TCR/MHC-抗原刺激的情況下，外源加入TGF-能誘導(dǎo)naïve CD4+T細(xì)胞

35、向Treg細(xì)胞轉(zhuǎn)化26；當(dāng)腫瘤細(xì)胞和PBMC共培養(yǎng)時，TGF-也可以誘導(dǎo)T細(xì)胞向Treg細(xì)胞的分化27,說明TGF-對iTreg分化增殖有重要作用。Treg細(xì)胞也與許多肝臟疾病相關(guān)：如當(dāng)感染HBV后，Treg細(xì)胞數(shù)量增加，從而保護(hù)肝細(xì)胞不受細(xì)胞毒性T細(xì)胞（Cytotoxic t lymphocyte, CTL）損傷，但同時也導(dǎo)致機(jī)體不能徹底清除病毒，引起機(jī)體免疫耐受，導(dǎo)致肝炎慢性化28-30；肝癌組織中Treg細(xì)胞數(shù)量增多，CD4+T細(xì)胞數(shù)量下降，提示在肝癌中，Treg細(xì)胞通過抑制CD4+T細(xì)胞增殖，從而促進(jìn)肝癌的生長31；自身免疫性肝炎中，Treg細(xì)胞數(shù)量減少，并且擴(kuò)增能力也明顯減弱，從而促

36、進(jìn)自身免疫性肝炎進(jìn)程32；在3型鼠肝炎病毒（MHV-3)引起的鼠爆發(fā)型肝炎中，Treg細(xì)胞比例增加，從而減輕免疫反應(yīng)，降低免疫反應(yīng)強(qiáng)度，使MHV-3爆發(fā)型肝炎趨于慢性化33。由此可見，Treg細(xì)胞亦參與許多肝臟疾病。既然ALR和Treg細(xì)胞均提示參與許多肝臟疾病的發(fā)生發(fā)展過程，那么兩者之間有什么聯(lián)系呢？雖然關(guān)于ALR和Treg細(xì)胞兩者的相關(guān)性研究還未見報道，但是Cao等34發(fā)現(xiàn)肝癌細(xì)胞上清液可以促進(jìn)Treg細(xì)胞的分化發(fā)育，并且能增強(qiáng)Treg細(xì)胞的免疫功能，而我們前期研究已證實(shí)肝癌細(xì)胞可以分泌ALR35，這就提示ALR和Treg細(xì)胞之間可能存在相互作用關(guān)系，為我們提供很好的思路。因此，本研究通過

37、觀察hALR對ConA刺激的純化T淋巴細(xì)胞的增殖及其中調(diào)節(jié)性T細(xì)胞比例以及上清中TGF-1、IL-10水平的影響；hALR對ConA刺激的人外周血單個核細(xì)胞的增殖及其中調(diào)節(jié)性T細(xì)胞比例和樹突狀細(xì)胞表型以及上清中TGF-1、IL-10水平的影響；TGF-1抗體對hALR影響Treg細(xì)胞的逆轉(zhuǎn)作用，探討hALR發(fā)揮免疫抑制作用的可能機(jī)制。2 方法2.1 T細(xì)胞實(shí)驗(yàn)部分2.1.1 外周血T細(xì)胞分離 取健康志愿者空腹靜脈血，在無菌條件下，用D-Hank，s液1：1（v/v）稀釋靜脈血，將稀釋后的混合液按1：1（v/v）比例小心加入淋巴細(xì)胞分離液之上。 離心，2000rpm×20min

38、5;20，離心后分為三層，我們所需細(xì)胞在上層與中間層之間，用大槍吸取云霧狀細(xì)胞層，用D-Hank，s液按3：1（v/v）洗滌細(xì)胞，1500rpm×8min×20，徹底洗掉淋巴細(xì)胞分離液和死細(xì)胞，再洗滌細(xì)胞兩次收集細(xì)胞沉淀。 用含10%滅火胎牛血清（FBS）的RPMI-1640培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，計數(shù)板計數(shù)。 每1×107個細(xì)胞用80µl MACS buffer溶液重懸，重懸后加入20µl CD3磁珠，4、避光反應(yīng)20min。 加入PE標(biāo)記抗人CD3二抗，充分混合后置于4 ，避光反應(yīng)10min。將磁珠柱安裝在磁場架上，用500µl MACS

39、 buffer溶液濕潤柱子。 在孵育好的細(xì)胞懸液中每1×107個細(xì)胞加入2ml MACS buffer溶液，混勻后1500rpm×10min離心。 徹底棄上清，每1×108個細(xì)胞加入500µl MACS buffer溶液，充分混勻。 將細(xì)胞懸液加到磁珠柱底部，在柱子下方用EP管接住流下來的細(xì)胞懸液。 當(dāng)細(xì)胞懸液從免疫磁珠柱全部流出后，取柱子下并置于離心管之上，用500µl MACS buffer 溶液用力沖洗磁珠柱，沖洗三次，收集的細(xì)胞即為目的細(xì)胞。 將目的細(xì)胞1500rpm×8min離心，徹底棄上清，用含10%滅火胎牛血清（FBS）

40、的RPMI-1640培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，計數(shù)板計數(shù)。 將105個細(xì)胞用于檢測T細(xì)胞的純度。 調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106個/ml，然后以每孔200µl種入96孔U型培養(yǎng)板中。2.1.3 EdU檢測細(xì)胞增殖情況采用Cell-Light EdU Apollo®488 In Vitro Flow Cytometry Kit（RIBOBIO, Catalog Number: C10338-2）檢測，按照試劑盒說明書操作（1）EdU標(biāo)記 用細(xì)胞完全培養(yǎng)基按1000：1的比例稀釋EdU溶液； 于結(jié)束培養(yǎng)前12h在各組T細(xì)胞中加入1000：1的EdU試劑0.2l，繼續(xù)培養(yǎng)至60h；（2

41、） 細(xì)胞固定化 收集細(xì)胞，1500rpm×5min離心，棄上清； 用含1%BSA的PBS清洗細(xì)胞后1500rpm×5min離心，棄上清； 于每組細(xì)胞中加入50l細(xì)胞固定液（即含2%多聚甲醛的PBS），室溫孵育30min，1800rpm×5min離心，棄固定液； 每組加入50l 2mg/ml 甘氨酸液，室溫孵育5min后1800rpm×5min離心，棄甘氨酸液； 每組加入1ml 0.1%的皂素液，室溫孵育7min，1800rpm×5min離心2.1.4 流式細(xì)胞儀（FCM）檢測Treg細(xì)胞比例 收集各組細(xì)胞于流式管中，1500rpm×5

42、min離心，用PBS（以下所用PBS均含有1%BSA）洗滌細(xì)胞，徹底棄上清液。 于每組細(xì)胞懸液內(nèi)加入5µl Percp標(biāo)記人CD3抗體、APC標(biāo)記人CD4抗體、PE標(biāo)記人CD25抗體，4、避光孵育30min，每10min彈一次。同時設(shè)同型對照。 1500rpm×5min離心徹底棄上清，加入濃度為2%的細(xì)胞固定液50l，室溫孵育5min，PBS洗滌一次，1800rpm×8min，徹底棄上清。 加入1ml 0.1%皂素液，室溫孵育7min，PBS洗滌一次，1800rpm×8min，徹底棄上清。 加入1mg/ml DNAase 100l，室溫避光孵育1h，PBS洗滌一次，1800rpm×8min，徹底