雙熒光素酶系統(tǒng)實(shí)驗操作步驟及方法

1、報告基因報告基因 (reporter gene):(reporter gene):是一種編碼可被檢測的蛋白質(zhì)或酶的基因，也就是說，是一個其表達(dá)產(chǎn)物非常容易被鑒定的基因。 一般的，把報告基因的編碼序列和基因表達(dá)調(diào)節(jié)序列相融合形成嵌合基因，或與其它目的基因相融合，從而利用它的表達(dá)產(chǎn)物來標(biāo)定目的基因的表達(dá)調(diào)控。u在動物基因表達(dá)調(diào)控的研究中，報告基因被廣泛應(yīng)用。如綠色熒光蛋白(GFP）和熒光素酶。熒光素酶（熒光素酶（LuciferaseLuciferase）：是能夠催化不同底物氧化發(fā)光的一類酶的統(tǒng)稱，哺乳細(xì)胞無內(nèi)源性熒光素酶。熒光素酶報告基因的優(yōu)點(diǎn)熒光素酶報告基因的優(yōu)點(diǎn)u蛋白不需要翻譯后加工，所以一旦

2、翻譯立即產(chǎn)生報告活性。u在所有的化學(xué)發(fā)光反應(yīng)中，它的光產(chǎn)物具有最高的量子效率，因而非常靈敏。另外，在宿主細(xì)胞及檢測試劑中均檢測不到背景發(fā)光。u檢測快速，每個樣品只需幾秒鐘。 構(gòu)建成熒光素酶報告質(zhì)粒。然后轉(zhuǎn)染細(xì)胞，適當(dāng)刺激或處理后裂解細(xì)胞，測定熒光素酶活性。通過熒光素酶活性的高低判斷刺激前后或不同刺激對感興趣的調(diào)控元件的影響。 利用熒光素酶與底物結(jié)合發(fā)生化學(xué)發(fā)光反應(yīng)的特性，把感興趣的基因轉(zhuǎn)錄的調(diào)控元件基因轉(zhuǎn)錄的調(diào)控元件克隆在螢火蟲熒光素酶基因（firefly luciferase）的上游，LUC 啟動子細(xì)胞內(nèi)目的基因的轉(zhuǎn)錄被激活未處理對照刺激物處理啟動子-Luc轉(zhuǎn)染細(xì)胞啟動子-Luc的啟動子被激

3、活Luc的轉(zhuǎn)錄Luc表達(dá)量測得的熒光值 同時，為了減少內(nèi)在的變化因素（如：培養(yǎng)細(xì)胞的數(shù)目和活力的差別，細(xì)胞轉(zhuǎn)染和裂解的效率等）對實(shí)驗準(zhǔn)確性的影響，將帶有海腎熒光素酶基因（Rinilla luciferase）的質(zhì)粒（phRL-TK）作為對照質(zhì)粒與報告基因質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染細(xì)胞，提供轉(zhuǎn)錄活力的內(nèi)對照，使測試結(jié)果不受實(shí)驗條件變化的干擾。 在測量過程中，當(dāng)加入熒光素酶檢測試劑II (LARII)時產(chǎn)生螢火蟲熒光信號，這樣先測量螢火蟲熒光素酶報告基因。定量螢火蟲熒光強(qiáng)度之后，再在同一樣品中加入Stop & Glo 試劑，將上述反應(yīng)淬滅，并同時啟動海腎熒光素酶反應(yīng)，同時進(jìn)行第二次測量。A檢測前相關(guān)試劑配

4、制檢測前相關(guān)試劑配制 1. 1X PLB裂解緩沖液配制：將4體積水或PBS加入1體積5X PLB裂解緩沖液。（使用前在室溫平衡1X 緩沖液，平衡需2-3 min）。 2. Luciferase Assay Reagent II (LAR II) 配制：將Luciferase Assay Buffer II加入Luciferase Assay Substrate充分混合后，分裝，置于-20避光保存。（一次配好，分裝成小管，避免反復(fù)凍融），使用前將配好的LAR II從-20拿出，并平衡至室溫（需20-30min）。 3. Stop & Glo Reagent配制：現(xiàn)用現(xiàn)配，先將Stop &

5、amp; Glo Buffer放在37度溫箱中平衡至室溫（15-30min），再將1倍體積的50X Stop & Glo Substrate加入49倍體積的將Stop & Glo Buffer中。B樣品制備樣品制備1. 仔細(xì)地將生長培養(yǎng)基從待檢細(xì)胞孔中吸出。用1XPBS漂洗細(xì)胞2-3次。此過程必須仔細(xì)，并盡量將漂洗用PBS 吸盡（防止細(xì)胞掉落）防止細(xì)胞掉落）。2. 24 孔板每孔加入100-150l 1X 裂解緩沖液PLB以覆蓋細(xì)胞。然后將24孔板置搖床振搖20-30min以保證裂解緩沖液完全裂解細(xì)胞。C C雙熒光素酶檢測（雙熒光素酶檢測（Promega GLOMAXProme

6、ga GLOMAX） ( (注：系統(tǒng)運(yùn)行時請勿觸摸操作屏注：系統(tǒng)運(yùn)行時請勿觸摸操作屏) )1. 重新設(shè)定系統(tǒng)：Tools Settings Reset2. 雙熒光素酶檢測程序的設(shè)定： Protocols Run Promega Protocol DLR-O-INJ OK3.將50l LAR II加入1.5ml EP管中（專用的進(jìn)口EP管），取10l 細(xì)胞裂解液加入裝有LAR II的1.5ml EP管中，吹打2-3次混勻（盡量不要吹出氣泡），置于檢測儀，點(diǎn)擊“Measure” 開始讀數(shù)（為螢火蟲熒光素酶反應(yīng)強(qiáng)度）。（使用前LAR II要混勻，并平衡到室溫）4. 測量結(jié)束后，取出EP管，再加入50

7、l Stop & Glo Reagent，吹打2-3次混勻（盡量不要吹出氣泡），再次置于檢測儀，點(diǎn)擊“Measure” 開始讀數(shù)（為內(nèi)參海腎熒光素酶反應(yīng)強(qiáng)度）。（Stop & Glo Reagent 現(xiàn)配現(xiàn)用，不能保存）5. 記錄讀數(shù): 每個樣品會有3個數(shù)值：RLU1螢火蟲熒光素酶反應(yīng)強(qiáng)度, RLU2內(nèi)參海腎熒光素酶反應(yīng)強(qiáng)度, RatioRLU1/ RLU2。一般記錄Ratio 值即可，但RLU1 和RLU2為實(shí)際熒光強(qiáng)度值，可以反映細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率，也可根據(jù)實(shí)際熒光強(qiáng)度來調(diào)整報告質(zhì)粒與內(nèi)參的比例。6. 測量完畢后，請將最后檢測的EP管取出后，關(guān)閉儀器。7. 實(shí)驗結(jié)果的處理與分析：采用雙樣本等方差t檢驗進(jìn)行處理，P0.05為差異顯著，P0.01為差異極顯著。四、注意事項四、注意事項 由于溫度對酶反應(yīng)有影響，所以測定時樣品和試劑均需達(dá) 到室溫后再進(jìn)行測定。 Renilla熒光素酶檢測工作液后需配制后立即使用，不可配制成工作液后長期保存。 Luciferase Assay Reagent II (LAR II)不能反復(fù)凍融，保證每次用同一批次的LAR II。配好的LAR II在-20 度可穩(wěn)定一個月，在-70度 可穩(wěn)定一年。 試劑保存和使用時都應(yīng)避