酶標(biāo)記抗體的制備技術(shù)

1、 酶標(biāo)記抗體的制備技術(shù)（一）酶標(biāo)抗體的條件1純度高、含雜蛋白少,用IgG優(yōu)于血清抗體，用Fab優(yōu)于IgG。2特異性強(qiáng) 即抗IgG與IgG在免疫電泳上只有一條沉淀線,與IgG的全血清也只有一條沉淀線,這才算是特異性的單價(jià)抗體。3效價(jià)高 一般瓊脂擴(kuò)散鑒定為164以上才算合格?？贵w的可供標(biāo)記的位點(diǎn)結(jié)構(gòu)圖（二）酶標(biāo)記方法1交聯(lián)法 交聯(lián)法通常用的交聯(lián)劑是戊二醛，戊二醛商品大多為25%的水溶液，利用戊二醛分子上對(duì)稱(chēng)的兩個(gè)醛基，分別與酶和蛋白質(zhì)分子中游離的氨基、酚基等以共價(jià)鍵結(jié)合而進(jìn)行標(biāo)記。標(biāo)記時(shí)應(yīng)盡量采用新鮮純品，當(dāng)戌二醛的OD235nm/OD280nm3時(shí)，即為好的交聯(lián)劑。戊二醛交聯(lián)法又分為一步法和二步

2、法。 一步法：即把酶、戊二醛和抗體一起加入進(jìn)行交聯(lián)。然后透析出過(guò)量的戊二醛而制備出具有高分子量的酶結(jié)合物。由于抗體分子量大(16萬(wàn))，酶分子量小(4萬(wàn)),抗體分子的氨基數(shù)比酶蛋白分子氨基數(shù)多得多，結(jié)果生成的抗體戊二醛或抗體戊二醛抗體多而造成酶標(biāo)物的活性小。一步法操作： 抗IgGAKP的制備：將10mgAKP溶于含有5mg抗IgG的1mlPBS(0.01Mol/L pH7.0)中，在冰浴中緩緩攪拌，盡量避免氣泡產(chǎn)生，完全溶解后，緩緩滴加1%戊二醛溶液4ml，使戊二醛的最終濃度為0.2%，移至室溫中靜置2h3h后，以0.01Mol/L pH7.0 PBS液4充分透析或以SephadexG25柱除去

3、過(guò)量的戊二醛，4保存?zhèn)溆?也可保存于50%甘油中置低溫冰箱)； 抗IgGHRP的制備：將12mgHRP溶于含5mg抗IgG的1mlPBS(0.1Mol/L pH6.8)中,緩慢攪拌下加入1%戊二醛溶液4mL，置室溫2h3h，充分透析或以SephadexG25除戊二醛，小量分裝后保存于低溫冰箱，避免反復(fù)凍融?；蚶鋬龈稍锉４妗?二步法：是先使酶與戊二醛反應(yīng),除去未反應(yīng)的戊二醛，再使已“活化”的酶分子與抗體分子的氨基結(jié)合，最后加入少量的賴(lài)氨酸封閉被戊二醛激活的酶的殘基。二步法操作：a) 將10mg的酶溶于0.2ml含1.25%戊二醛的0.1mol/L pH6.8 PBS中室溫放置18h，充分透析或以

4、SephadexG25柱除去未反應(yīng)的戊二醛。b) 加生理鹽水至1ml然后加入1ml(含5mg)的抗體溶液和1ml 1Mol/L pH9.6碳酸鹽緩沖液，混合后4冰箱放置24h，加入0.1ml 0.2mol/L賴(lài)氨酸，置室溫2h，以0.15Mol/L pH7.2 PBS液充分透析，離心去沉淀，上清液即為酶結(jié)合物，再進(jìn)一步以硫酸銨沉淀純化后應(yīng)用。c) AKP一般不采用二步法,而只用一步法。改良HRP二步標(biāo)記法：a) 取HRP10mg溶于0.4ml,0.25Mol/L pH6.8PBS液中或0.05Mol/L pH9.6碳酸鹽緩沖液中，加入25%戊二醛0.1ml，37溫育2h后加入冰冷的分析純的無(wú)水

5、乙醇2ml，2500r/min離心沉淀10min15min，傾去溶液。b) 沉淀以80%乙醇4ml5ml混懸，同上離心，傾去乙醇，將管倒置，使乙醇充分流出。c) 沉淀用1ml 0.05Mol/L pH9.6碳酸鹽緩沖液溶解，加入0.5ml1ml 抗IgG抗體溶液(含抗體15mg左右)，放在冰箱內(nèi)過(guò)夜后，加KH2 PO4，使近中性即可應(yīng)用。2氧化法 采用過(guò)碘酸鈉，過(guò)碘酸鈉是強(qiáng)氧化劑，能將HRP的甘露糖部分(與酶活性無(wú)關(guān)的部分)的羥基氧化成醛基，然后與抗體的氨基結(jié)合,形成酶標(biāo)抗體（1）氧化法操作過(guò)程如下： 將5mgHRP溶于新配制的1ml 0.30Mol/LpH8.1重碳酸鈉中，加0.1 ml 1

6、%氟二硝基苯(FDNB)無(wú)水乙醇溶液,在室溫中混合后，再加入1ml 0.04Mol/L0.08Mol/L過(guò)碘酸鈉(NaIO4)，置室溫中輕攪30min，在溶液呈黃綠色時(shí)，加1ml 0.16Mol/L乙二醇溶液，在室溫中放置1h，使氧化反應(yīng)中止，然后在4中對(duì)0.10Mol/L pH 9.5重碳酸鈉緩沖液透析，換液3次。 在3ml HRP醛基溶液中，加入5mg抗體(溶于1ml的碳酸鹽緩沖液中)，室溫置2h3h，加入5mg氫化硼鈉(NaBH4)，于4冰箱放置3h或過(guò)夜，然后用PBS液充分透析，離心去沉淀物。上清液即為酶結(jié)合物，純化后使用。（2）改良過(guò)碘酸鈉法： 取5mg HRP溶于0.5ml雙餾水中

7、，加入新配制的0.06Mol/L NaIO4水溶液(10ml雙餾水128mg NaIO4) 0.5ml，混勻，置430min； 取出后加入0.16Mol/L乙二醇水溶液(10mlH2O+0.09ml乙二醇)0.5ml，室溫放置30min； 加入含5mg純化抗體的水溶液1ml，混勻，并裝入透析袋，對(duì)0.05Mol/L pH 9.5碳酸鹽緩沖液緩緩攪拌透析6h(或過(guò)夜)，使之結(jié)合； 加入NaBH4溶液(5mg/ml)0.2ml，混勻，置42h； 在以上溶液中緩慢加入等體積的飽和硫酸銨溶液，混勻，430min，離心，去上清，沉淀以少許0.02Mol/L pH7.4 PBS液溶解，裝入透析袋，以同樣液

8、體在4透析除鹽過(guò)夜； 次日取出離心，以除去不溶物，即得酶抗體(HRPIgG)結(jié)合物，以0.02Mol/L pH 7.4 PBS液加至5ml；效價(jià)測(cè)定合格后，加入等量?jī)?yōu)質(zhì)甘油，分裝小瓶，低溫保存。戊二醛交聯(lián)法與過(guò)碘酸鈉氧化法比較，見(jiàn)表123。表123 戊二醛法與過(guò)碘酸鈉法比較比較項(xiàng)目戊二醛法過(guò)碘酸鈉法一步法二步法標(biāo)記方法簡(jiǎn)單較復(fù)雜較復(fù)雜酶利用率24%24%70%酶偶聯(lián)到99%抗體上產(chǎn)率5%5%50%標(biāo)記抗體分子量750萬(wàn)25萬(wàn)40萬(wàn)穿入組織能力差好一般抗體活性丟失多少較多酶活性丟失多少較多染色效應(yīng)差較好較好3二馬來(lái)酰亞胺法 二馬來(lái)酰亞胺(Dimaleimide)能與蛋白質(zhì)半胱氨酸的硫基反應(yīng)。首先

9、用巰基乙胺還原蛋白質(zhì)(IgG),并用N、N苯二馬來(lái)酰亞胺活化，然后除去多余的試劑，最后使含二馬來(lái)酰IgG與含硫基的半乳糖苷酶連接。具體操作如下： 將Ag/Ab溶于0.1mol/L pH5.0醋酸鈉緩沖液并對(duì)同一緩沖液透析平衡過(guò)夜,離心除去不溶性物質(zhì), Ag/Ab (14mg/2ml)與10ml -巰基乙胺在37溫育90min。 過(guò)Sephadex G25后濃縮使每ml含3.0mg左右的還原Ag/Ab。在0,按11滴加飽和N、N-O-苯二馬來(lái)酰亞胺溶液混合，于30溫育20min，過(guò)SephadexG25柱，除去未反應(yīng)的二馬來(lái)酰亞胺。 收集二馬來(lái)酰亞胺“活化”的Ag/Ab濃縮使?jié)舛葹镺D280nm

10、=1.0(光徑1cm),取1ml溶液加20l(5mg/ml)-半乳糖苷酶，置3020min，用0.10Mol/L NaOH中和后，于4置24h72h，再過(guò)Sepharose-6B柱(1.5×40cm)，以pH7.0PBS洗脫,收集酶結(jié)合物，加疊氮鈉(NaN3)防腐，4保存?zhèn)溆谩?.酶標(biāo)記半胱氨酸方法試劑：馬來(lái)酰亞胺結(jié)合緩沖液: 含10mM磷酸氫鈉, 10mM EDTA的PBS，pH 7.0?？贵w或抗原：溶于PBS濃度達(dá)5mg/ml。步驟：1.用2-MEA還原Ag/Ab產(chǎn)生巰基1) 取100l的馬來(lái)酰亞胺結(jié)合緩沖液加入6mg 2-巰基乙胺(2-MEA)的EP管中；2) 加準(zhǔn)備好的Ag/

11、Ab5mg到2-MEA溶液37溫浴90min；3) 溶液降溫到室溫，用PBS超濾離心透析脫鹽除去2-MEA。Note: Separation of 2-MEA from reduced IgG is critical, as residual 2-MEA will interfere with coupling. To determine if adequate separation has been achieved, perform a BCA Assay to identify location of 2-MEA (See the Additional Information Secti

12、on).4)包含還原態(tài)Ag/Ab的液體濃度約2.5mg/ml，立即進(jìn)行下步反應(yīng)減少二硫鍵形成。Note: To precisely determine protein concentration, use the Coomassie Plus - The Better Bradford Assay Kit (ProductNo. 23236).2. 準(zhǔn)備馬來(lái)酰胺：HRP1) 稱(chēng)取1.067mgHRP對(duì)每毫克的巰基化抗體；2) 加1.1mg巰基-SMCC每毫克HRP；3) 加PBS使HRP終濃度為8mg/ml；4) 磁力攪拌混合2h；5) PBS平衡柱除鹽HRP，收集第一個(gè)峰；3.抗體：HRP連

13、接反應(yīng)1) 按1mgHRP每毫克Ag/Ab立即混合HRP與巰基化Ag/Ab，室溫孵化1h；2) 在2-8混合16-20h；3) 對(duì)PBS透析換3次液，每2h換一次液；4) 加儲(chǔ)存Buffer或等量無(wú)菌甘油稀釋2倍-70保存。馬來(lái)酰亞胺活化的載體蛋白與含SH-的半抗原的交聯(lián)活化的酶與含SH-的抗原/抗體的標(biāo)記過(guò)程（一） 酶標(biāo)抗體結(jié)合物的純化 在酶標(biāo)記的溶液中，出現(xiàn)的是各種交聯(lián)物的混合物,有酶抗體、酶抗體酶、抗體抗體、酶酶，甚至還有游離的酶和抗體。在這中間,除了抗體酶和酶抗體酶外,其它都應(yīng)該給予除去。1 50%飽和硫酸銨沉淀法。 此法只能除去游離的酶及酶酶聚合體。而不能除去其它不需要者。但是此法對(duì)

14、酶標(biāo)抗體的損耗少。2 過(guò)SephadexG200或Sepharose6B柱。此法較繁瑣,而且對(duì)酶標(biāo)抗體的損耗較大,但提純的質(zhì)量好。（三）酶標(biāo)抗體的鑒定1 酶標(biāo)抗體的活性鑒定 一般以瓊脂擴(kuò)散和免疫電泳進(jìn)行鑒定。使酶標(biāo)抗體和相應(yīng)的抗原(抗原濃度為1mg/ml)產(chǎn)生沉淀線,洗滌后于底物溶液中顯色,顯色后用生理鹽水漂洗,沉淀線不褪色,說(shuō)明酶和抗體都具有活性。良好的酶標(biāo)結(jié)合物瓊脂擴(kuò)散滴度一般應(yīng)在1：16以上。2 酶結(jié)合物的定量測(cè)定 包括酶量、IgG含量、酶與IgG克分子比值以及結(jié)合率的測(cè)定。酶量( µg/ml)=OD403nm×0.42 （1）戊二醛法：IgG(mg/ml)=(OD2

15、80nmOD403nm×0.42)×0.94×0.62(OD403×0.42為酶在403nm的光密度，抗體與酶戊二醛結(jié)合后OD280nm約增加6%，所以乘以0.94校正。由于兔IgGOD280nm=1.0時(shí)為0.62mg，所以又乘以0.62)。（2）過(guò)碘酸鈉法：IgG(mg/ml)=(OD280OD403×0.30)×0.62(40 000和160 000分別為辣根過(guò)氧化物酶和IgG的分子量)。 酶結(jié)合率=結(jié)合物中的酶量/標(biāo)記時(shí)加入的酶量×100%。 酶標(biāo)記率：OD403nm/OD280nm即酶中正鐵血紅素輔基的吸光度(40

16、3nm)與抗體酶蛋白中的色氨酸、酪氨酸的吸光度(280nm)之比表示HRP在AbE中所占的比例，它與E/Ab克分子比值呈高度正相關(guān)。3酶結(jié)合物的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn) 純化的酶結(jié)合物的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)包括以下幾個(gè)方面。（1）酶的催化活性。（2）免疫學(xué)活性。（3）未聯(lián)接的游離酶的量。（4）未聯(lián)接的原始免疫反應(yīng)物的量。（5）每個(gè)酶分子所聯(lián)接的免疫反應(yīng)物分子數(shù)目。（6）生化性質(zhì)。（7）酶標(biāo)記免疫試驗(yàn)效果。酶結(jié)合物的質(zhì)量差異,可引起試驗(yàn)敏感度的很大變化。例如用不同的程序制得的HRPIgG結(jié)合物進(jìn)行酶標(biāo)記免疫試驗(yàn)，可得到不同的試驗(yàn)結(jié)果，故應(yīng)予重視。用于ELISA的各項(xiàng)指標(biāo)參數(shù)見(jiàn)表1240表124 用于ELISA酶標(biāo)抗體的各

17、項(xiàng)指標(biāo)參數(shù)評(píng)價(jià)最好好一般酶結(jié)合量(mg/ml)1.00.50.4酶結(jié)合率(%)309107酶IgG克分子比1.51.00.7（五）酶標(biāo)抗體的保存分裝小瓶，凍干低溫保存。也可分裝小瓶,在4或0以下保存。加甘油或牛血清白蛋白(最后濃度為33%)保存更好。避免反復(fù)凍融。保存期：一般12年活性不變?？乖?抗體的ELISA/WESTERN檢測(cè)The pipted conjugated to hoseradsh perxdaseThe following 5 steps of preparation are carried out in labeling an immunoglobulin (IgG) w

18、ith horseradish peroxidase (HRP): (i) oxidation of HRP with NaIO4 ; (ii) crosslinking of HRP (ox.) with 1,13-diamino-4,7,10-troxatridecane (DTT); (iii) coupling of IgG with crosslinked HRP; (iv) stabilization of the azomethine bonds; and (v) S-300 gel permeation chromatography. Steps (ii) and (iii)

19、are carried out in connection with the method of the present invention. They are described in detail by the example of the HRP-labeling of IgG (rabbits) with 1,13-diamino-4,7,10-trioxatridecane. Therefore, steps (i), (iv) and (v) which are only indirectly connected with the present invention and are

20、 generally known, are described here only briefly. (i) Oxidation of HRP with NaIO4 4.0 mg of horseradish peroxidase (HRP, 100 nmole) are weighed in a reaction tube, dissolved in 0.8 ml of water and 0.2 ml of freshly prepared 0.1 M of NaIO4 solution is pipetted into the copper-red HRP solution, the c

21、olor of which changes to black-green. The reaction tube is placed immediately into an enclosure which is closed to avoid exposure to light. The reaction time totals 15 min. at room temperature, with an occasional moving of the tube. 50 l of ethylene glycol are added to avoid an excess of NaIO4. This

22、 quenching is also carried out in the dark and the reaction time totals at least 30 min. Thereupon, the HRP (ox.) solution again becomes copper-red. The separation of HRP (ox.) from low-molecular reactants is effected by gel filtration in the exclusion volume of a Sephadex-G 25 column (approx. 30 cm

23、 long, 12 ml of gel bed volume). It is sufficient to take 20 fractions per 0.5 ml. The red-brown HRP containing fractions are pooled and are evaporated by ultrafiltration (10,000 NMGG) to a volume 0.5 ml. (ii) HRP (ox.) Cross-linking with DTT in the Event of an Equimolar Batch 10 ml of DTT (=1.005)

24、are pipetted into a 50 ml measuring flask, that is filled to the mark with 0.1 M bicarbonate buffer (pH 9.8). This DTT solution can be used for more than 2 months. 0.1 ml (100 nmole) of this solution are pipetted into the HRP (ox.) solution concentrated by evaporation. A microstirrer is inserted to

25、mix the reaction solution rapidly and thoroughly. The reaction time for crosslinking totals 4 hours at room temperature; if needed, the reaction mixture may also be placed into a refrigerator overnight. (iii) IgG Coupling with Crosslinked HRP The stoichiometric ratio between crosslinked HRP and IgG

26、should suitably be about 5:1 to obtain a high degree of substitution. 15 to 16.7 nmole are used for coupling in view of an insignificant loss of HRP in the 1st and 2nd preparation stages 2.25 to 2.50 mg of IgG (rabbits). Immunoglobulin is either directly inserted into the reaction tube which contain

27、s the crosslinked HRP solution in 0.1 M bicarbonate buffer (pH 9.8), and dissolved by stirring, or is earlier dissolved in 0.1 M bicarbonate buffer (pH 9.8), and is then added. During IgG coupling the reaction conditions are the same as during crosslinking reaction at room temperature either for 4 h

28、ours or the coupling mixture is placed into a refrigerator overnight. The reaction volume should not exceed 0.8 ml. (iv) Stabilization of the Azomethine Bonds 50 l 2 M of triethanolamine (pH 8.0) are added to the coupling solution, the reaction mixture is thoroughly mixed and cooled in a refrigerato

29、r. 0.2 M of NaBH4 solution are prepared for hydration of the azomethine bonds, with 8 mg NaBH4 dissolved in 1.0 ml cold water only immediately before being used. Not more than 75 l of this solution are added to the coupling solution. When stirring it the reaction solution foams vehemently. The react

30、ion time totals approx. 30 min. in the refrigerator before 25 l 2 M of triethanolamine (pH 8.0) are added. The reaction mixture is placed into a refrigerator for another 2 hours. Finally, still 10 l 1 M of glycine (pH 7.0) are added for stabilization. (v) S-300 Gel Permeation Chromatography The HRP

31、tracer is separated in a 75 cm long Sephacryl-S 300.RTM. column (approx. 41 ml of gel bed volume) which is eluted with 0.05 M of PBS buffer/0.15 M of NaCl (pH 7.4). 35-40 fractions of 1.0 ml each are taken off. Only the fractions with high extinctions at 402 nm showing the most favorable properties

32、as to their specific and nonspecific bonds in EIA, at most only 3 tubes, are pooled.酶標(biāo)記抗體HRP標(biāo)記抗體原理及方法，戊二醛二步法和過(guò)碘酸鈉法酶標(biāo)記物包括酶標(biāo)記抗原、酶標(biāo)記抗體和酶標(biāo)記SPA等。酶標(biāo)記物質(zhì)量的好壞直接關(guān)系到免疫酶技術(shù)的成功與否，因此被稱(chēng)為關(guān)鍵的試劑。酶標(biāo)記物中最常用的是酶標(biāo)記抗體，它是將酶與特異性抗體經(jīng)適當(dāng)方法連接而成。酶標(biāo)記抗體的質(zhì)量主要取決于純度好、活性強(qiáng)及親和力高的酶和抗體，其次要有良好的制備方法。目前，高質(zhì)量的酶(如辣根過(guò)氧化物酶，簡(jiǎn)稱(chēng)HRP)國(guó)內(nèi)已有商品供應(yīng)。高質(zhì)量的抗體則可通過(guò)提取

33、純化而獲得。在制備方法上，宜選用產(chǎn)率高、不影響結(jié)合物的活性和不混雜干擾性物質(zhì)且操作簡(jiǎn)便易行的方法。(一) 酶制劑及其底物凡無(wú)毒性又能呈現(xiàn)有色化學(xué)反應(yīng)的酶，原則上均可作為標(biāo)記用。但作為標(biāo)記抗體用的酶應(yīng)滿(mǎn)足下列要求：(1)來(lái)源方便，易于純化；(2)比活性高，性質(zhì)穩(wěn)定；(3)酶活性和量能用簡(jiǎn)單方法測(cè)定。目前在免疫酶技術(shù)中常用的酶為辣根過(guò)氧化物酶(HRP)和鹼性磷酸酶(AP)，其次還有葡萄糖氧化酶，-半乳糖苷酶、溶菌酶和蘋(píng)果酸脫氫酶等。由于辣根過(guò)氧化物酶(Horseradish Peroxidase, HRP)比活性高，穩(wěn)定，純酶容易制備，所以最常用。HRP廣泛分布于植物界，辣根中含量高。HRP是一種

34、分子量44 kDa的糖蛋白，它是由無(wú)色的酶蛋白和棕色的鐵卟啉結(jié)合而成的糖蛋白，中性糖和氨基糖約占18，主要有甘露糖、木糖、阿拉伯糖和己糖胺等。HRP由多個(gè)同功酶組成，等電點(diǎn)為PH59,酶催化的最適PH因供氫體不同而稍有差異，但多在PH5左右。酶溶于水和58以下飽和度硫酸銨溶液。HRP的輔基和酶蛋白最大吸收光譜分別為403nm和275nm，一般以O(shè)D403nm OD275nm的比值RZ(德文Reinheit Zahl)表示酶的純度。高純度的酶RZ值應(yīng)在3.0左右(最高可達(dá)3.4)。RZ值越小，非酶蛋白就越多。值得注意的是，純度并不表示酶活性，如當(dāng)酶變性后，RZ值仍可不變。但可以以純酶溶液在10m

35、m光徑403nm波長(zhǎng)下的吸光度來(lái)計(jì)算酶濃度1(W/V)酶溶液吸光度為22.5，濃度為227umol/L。純HRP干燥貯存于20可保持穩(wěn)定，使用1.36 mol/L甘油、10mmol/L磷酸鈉、30umol/L牛血清白蛋白和20umol/L細(xì)胞色素C(pH 7.4)溶液作為基質(zhì)冷凍保存，可使酶結(jié)合物穩(wěn)定數(shù)年。HRP對(duì)熱及有機(jī)溶劑的作用比較穩(wěn)定，用甲苯與石蠟切片處理或用純乙醇或l0甲醛水溶液固定做冷凍切片，均不能使其活性改變。氰化物或硫化物在105106mol/L濃度時(shí)具有可逆性地抑制HRP的作用；氟化物、疊氮化合物或羥胺僅在高于10-3molL濃度時(shí)抑制HRP；HRP還可被羥甲基過(guò)氧化氫不可逆地

36、抑制。強(qiáng)酸也是HRP的強(qiáng)烈的抑制劑。因此，在酶免疫測(cè)定常選用上述的某些化合物如氟化鈉、疊氮鈉和強(qiáng)酸等作為酶反應(yīng)的終止劑。此外，在配制酶免疫測(cè)定的稀釋緩沖液時(shí)，為防止酶失活，應(yīng)避免使用疊氮鈉作防腐劑。HRP的同工酶主要可分為三種類(lèi)型：含糖量高的酸性同工酶。等電點(diǎn)接近于中性(或微堿)的含糖量相對(duì)較低的同工酶。含糖量低的堿性(PI>11)同工酶。酶免疫試驗(yàn)中所使用的HRP，以PI為8.79.0的所謂“C”同工酶為主要組成成分，其他同工酶的活性則很低?！癈”同工酶的共價(jià)結(jié)構(gòu)由2個(gè)密切接近的區(qū)域組成，血紅素基團(tuán)則位于其間而成夾心結(jié)構(gòu)，糖鏈以8個(gè)不同的部位結(jié)合于多肽。天然的酶所帶的純電荷極少；無(wú)游離

37、的氨基，僅有2個(gè)可測(cè)出的組氨酸，6個(gè)賴(lài)氨酸似乎全被糖鏈外殼所遮蓋。因此，HRP一般僅有12個(gè)可用于耦聯(lián)的氨基。HRP的催化反應(yīng)需要底物過(guò)氧化氫(H2O2)和供氫體(DH2)。供氫體多為無(wú)色的還原型染料，通過(guò)反應(yīng)可生成有色的氧化型染料(D)。酶促反應(yīng)的過(guò)程如下:HRPDH2H2O2D2H2O供氫體的種類(lèi)很多，形成的產(chǎn)物特點(diǎn)不一。如DAB(3.3二氨基聯(lián)苯胺)的反應(yīng)產(chǎn)物為不溶性沉淀物，并有電子密度，故適宜于做免疫酶染色或電鏡觀察。5AS(5-氨基水楊酸)早期曾用于ELISA，但其溶解度不夠大，且空白孔不易控制到無(wú)色，現(xiàn)已很少應(yīng)用。OT(鄰聯(lián)甲苯胺)的特點(diǎn)是能產(chǎn)生鮮艷的藍(lán)綠色產(chǎn)物且靈敏度較高，但反應(yīng)

38、中受溫度影響較大，而且由于產(chǎn)物不穩(wěn)定，需要在短時(shí)間內(nèi)進(jìn)行測(cè)定。目前用得較廣泛和較滿(mǎn)意的供氫體是：OPD(鄰苯二胺)和TMB(四甲基聯(lián)苯胺)。前者形成的產(chǎn)物為深桔黃色或棕色，后者產(chǎn)物為藍(lán)綠色，二者的可溶性均好，在避光處顏色穩(wěn)定，空白可近于無(wú)色，靈敏度上據(jù)報(bào)道后者比前者可高4倍以上。另外，還有一種供氫體稱(chēng)ABTS2, 2'-邊氮基-雙(3-乙基苯并噻吡咯啉-6磺酸)，其反應(yīng)產(chǎn)物呈藍(lán)綠色，且靈敏度和穩(wěn)定性均好。尤其是在致癌的潛在可能性方面，ABTS與TMB皆是值得被優(yōu)選的供氫體。由于HRP的底物H2O2本身又是酶的抑制劑，因此酶促反應(yīng)中使用的H2O2不能過(guò)量。應(yīng)控制在經(jīng)較短時(shí)間反應(yīng)后呈色即達(dá)

39、高峰（說(shuō)明H2O2已消耗殆盡）。這樣即使再延長(zhǎng)時(shí)間也不會(huì)增加反應(yīng)產(chǎn)物的顏色。(二)HRP標(biāo)記抗體的方法酶與抗體交聯(lián)的方法有許多種,根據(jù)酶的結(jié)構(gòu)不同可采用不同的方法。對(duì)于制備HRP結(jié)合物，可用戊二醛二步法和過(guò)碘酸鈉法。尤以簡(jiǎn)易過(guò)碘酸鈉法更為常用。戊二醛二步法1.原理：戊二醛為一種雙功能試劑，通過(guò)其醛基分別與酶和免疫球蛋白上的氨基共價(jià)結(jié)合，形成酶-戊二醛-免疫球蛋白結(jié)合物。2.標(biāo)記步驟：(1)稱(chēng)取HRP 25mg溶于1.25戊二醛溶液中，于室溫靜置過(guò)夜。(2)反應(yīng)后的酶溶液經(jīng)Sephadex G-25層析柱，用生理鹽水洗脫。流速控制在1ml1分鐘，收集棕色流出液。如體積大于5ml，則以PEG濃縮至

40、5ml。放置25ml小燒杯中，緩慢攪拌。(3)將待標(biāo)記的抗體12.5mg用生理鹽水稀釋至5ml，攪拌下逐滴加入酶溶液中。(4)用1M PH9.5碳酸緩沖液0.25ml，繼續(xù)攪拌3小時(shí)。(5)加0.2M賴(lài)氨酸0.25ml，混勻后，置室溫2小時(shí)。(6)在攪拌下逐滴加入等體積飽和硫酸銨，置41小時(shí)。(7)3000rpm離心半小時(shí)，棄上清。沉淀物用半飽和硫酸銨洗二次，最后沉淀物溶于少量0.15M PH7.4的PBS中。(8)將上述溶液裝入透析袋中，對(duì)0.15M PH7.4的PB緩沖鹽水透析，去除銨離子后(用萘氏試劑檢測(cè))，10,000rpm離心30分鐘去除沉淀，上清液即為酶結(jié)合物，分裝后，冰凍保存。3

41、.結(jié)果判定：(1)定性及效價(jià)滴定：用特異性抗原(或抗體)同酶標(biāo)記抗體(或抗免疫球蛋白抗體)作雙向瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)或免疫電泳試驗(yàn)。然后用酶的底物使沉淀弧顯色，可初步鑒定其活性。最后以直接ELISA法(或在正式實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)里)對(duì)酶結(jié)合物進(jìn)行滴定( 見(jiàn)本節(jié) (三)工作濃度的選擇)。(2)定量和克分子比值測(cè)定：可用分光光度計(jì)測(cè)定(光程1cm)。酶量(mgml)OD403nm×0.4IgG量(mgml)OD280nm-OD403nm×0.42)×0.94×0.62酶量(mgml) IgG量(mgml) 酶量克分子比值 ÷ × 440,000 160,0

42、00IgG量(3)本法標(biāo)記步驟比較簡(jiǎn)單，重復(fù)性好。缺點(diǎn)是酶的利用率低，一般只有24的酶與蛋白質(zhì)結(jié)合。4.試劑及器材：(1)0.1M PH6.8磷酸緩沖鹽水(PBS)：取0.2M Na2HPO4 49ml, 0.2M NaH2PO4 51ml，NaCl1.8克，加蒸餾水至200ml。(2)1.25戊二醛液：取25戊二醛50ml與PH6.8的PBS1ml混合。(3)1M PH9.5碳酸鹽緩沖液：取1M碳酸鈉3ml與1M碳酸氫鈉7ml混合。(4)0.2M賴(lài)氨酸溶液：稱(chēng)賴(lài)氨酸29.2mg溶于0.01M PH9.5碳酸緩沖液1ml中。(5)0.15M PH7.4 PBS及生理鹽水。(6)PH7.8飽和硫

43、酸銨溶液及半飽和硫酸銨溶液。(7)萘氏試劑及聚乙二醇(PEG，MW2000)。(8)純化的特異性抗體或抗Ig抗體。(9)HRP(RZ>3.0)。(10) Sephadex G-25層析柱(2cm×50cm)。(11) 攪拌器，分光光度計(jì)，離心機(jī)。(12) 透析袋，大、小燒杯，試管，吸管等。簡(jiǎn)易過(guò)碘酸鈉法本法是以NaIO4先將HRP表面的糖分子氧化成醛基，然后再與Ig上的氨基相結(jié)合，所獲酶標(biāo)記抗體的產(chǎn)率高，將近70的HRP和Ig結(jié)合，99的Ig與酶結(jié)合，酶與Ig的活性無(wú)重大損失，是目前最常用的方法。1.原理：經(jīng)典的過(guò)碘酸鈉法中需采用二硝基氟苯封閉HRP上殘留的-和-氨基以避免酶分

44、子之間的交聯(lián)。后來(lái)Wilson等改用在低PH下使NaIO4氧化HRP，從而省去了二硝基氟苯封閉HRP步驟。HRP經(jīng)NaIO4氧化后形成的醛化酶可與抗體分子的氨基相連，形成斯夫氏鹼，后者可進(jìn)一步用NaBH4(或乙醇胺)還原生成穩(wěn)定的酶標(biāo)記抗體。2.標(biāo)記步驟:(1)稱(chēng)取5mgHRP溶解于1ml蒸餾水中。(2)于上液中加入0.2ml新配的0.1M NaIO4溶液，室溫下避光攪拌20分鐘。(3)將上述溶液裝入透析袋中，對(duì)1mM pH4.4的醋酸鈉緩沖液透析，4過(guò)夜。(4)加20l 0.2M PH9.5碳酸鹽緩沖液，使以上醛化HRP的pH升高到9.09.5，然后立即加入10mg IgG(抗體，或SPA5

45、mg)在1ml 0.01M碳酸鹽緩沖液中，室溫避光輕輕攪拌2小時(shí)。(5)加0.1ml新配的4mgml NaBH4液，混勻，再置42小時(shí)。(6)將上述液裝入透析袋中，對(duì)0.15M PH7.4 PBS透析，4過(guò)夜。其余步驟(純化)同戊二醛標(biāo)記步驟的(6)、(7)、(8)。3.結(jié)果判定：除標(biāo)記物IgG量的計(jì)算，略有不同以外，其余均同戊二醛法。IgG量(mgml)(OD280nm-OD403nm×0.3)×0.624.試劑及器材:(1)0.1M NaIO4：稱(chēng)取241mg高碘酸鈉溶于蒸餾水10ml中。(2)1mM PH4.4醋酸鈉緩沖液: 0.2M NaAc (1.361g/50m

46、l) 3.7ml，0.2M HAc (0.601ml/50ml) 6.3ml，加蒸餾水至2,000ml。(3)0.2M PH9.5碳酸鹽緩沖液: Na2CO3 0.32克，NaHCO3 0.586克，加蒸餾水至50ml，再用蒸餾水作20倍稀釋?zhuān)闯?.01M pH9.5的碳酸鹽緩沖液。(4)NaBH4溶液(4mgml):臨用時(shí)稱(chēng)取NaBH4 4mg溶于1ml蒸餾水中。(5)其它的試劑及器材可參見(jiàn)戊二醛標(biāo)記法。(三)工作濃度的選擇在免疫酶技術(shù)中，首先要確定的變異因素就是酶標(biāo)記物的工作濃度。因?yàn)槊笜?biāo)記物濃度的很小變化，便可導(dǎo)致試驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生很大的波動(dòng)。另外，由于濃度過(guò)高，可使非特異性反應(yīng)增加，而濃度

47、過(guò)低又可影響測(cè)定的敏感性。因此，正式試驗(yàn)前必須準(zhǔn)確滴定其工作濃度。酶標(biāo)記抗體的滴定方法是：將抗原(或抗體)物理吸附于固相載體上，然后將經(jīng)過(guò)一系列稀釋的酶標(biāo)抗體(或抗Ig抗體)與吸附在載體上的抗原(或抗體)起反應(yīng)，以酶與底物的顯色反應(yīng)程度來(lái)確定酶標(biāo)記抗體的效價(jià)，或稱(chēng)工作濃度。其步驟為：先將抗原(或抗體)用0.05M PH9.6包被緩沖液稀釋為10gml左右，于聚苯乙烯板孔內(nèi)加0.1ml，4過(guò)夜，次日以洗滌緩沖液洗滌3次。酶標(biāo)記抗體用1BSA-PBS液依次稀釋成1100，1200，1400，1800，11600(根據(jù)據(jù)抗體的滴度而定)，分別加入反應(yīng)孔中，每個(gè)稀釋度二孔，每孔0.1ml，37孵育1小

48、時(shí)后洗滌。然后加底物液，每孔0.1ml，371030分鐘。以2M H2SO4 0.05ml終止反應(yīng)。結(jié)果判定主要以ELISA比色儀讀取各孔OD值。并以O(shè)D為縱座標(biāo)，結(jié)合物濃度為橫座標(biāo)，繪制滴定曲線。由曲線上查得OD值為1.0左右，且曲線斜率最大時(shí)的酶標(biāo)抗體稀釋度，即為該標(biāo)記物的工作濃度。有關(guān)試驗(yàn)的試劑及器材均見(jiàn)ELISA部分。要說(shuō)明的是，本法為ELISA直接法，所測(cè)的工作濃度與在實(shí)際應(yīng)用中的最適濃度可相差幾個(gè)滴度。這就要求在建立ELISA實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)中，因此基礎(chǔ)上還應(yīng)進(jìn)一步確定實(shí)際工作濃度(可采用方陣法)，以達(dá)到最適的實(shí)驗(yàn)條件。(四)注意事項(xiàng)1.在具備高質(zhì)量HRP的條件下，所要標(biāo)記的抗體也要活性高

49、,效價(jià)高(最低116),純度高，親和力好，這是保證標(biāo)記物效價(jià)高，免疫活性好的首要條件。2.所使用試劑的PH和濃度及用量必須嚴(yán)格掌握。所用試劑，最好(或必需)新鮮配制。如在戊二醛標(biāo)記法中所用戊二醛應(yīng)為新鮮純品，因戊二醛儲(chǔ)存過(guò)久可形成縮和體(雜質(zhì))。否則，影響標(biāo)記效果。3.室溫?cái)嚢钑r(shí)須避光，室內(nèi)溫度一般在25為宜。標(biāo)記物每次透析前，須認(rèn)真檢查，防止漏液。4.濃的標(biāo)記物相當(dāng)穩(wěn)定，常加入3040甘油于-10下保存。4可保存12年，但稀釋成110，只能保存數(shù)周。已配制的使用液應(yīng)在12小時(shí)內(nèi)用完。切忌反復(fù)凍融。氧化法采用過(guò)碘酸鈉，過(guò)碘酸鈉是強(qiáng)氧化劑，能將HRP的甘露糖部分(與酶活性無(wú)關(guān)的部分)的羥基氧化成

50、醛基，然后與抗體的氨基結(jié)合,形成酶標(biāo)抗體。氧化法操作過(guò)程如下：將5mgHRP溶于新配制的1ml 0.30mol/L pH8.1重碳酸鈉中，加0.1 ml 1%氟二硝基苯(FDNB)無(wú)水乙醇溶液,在室溫中混合后，再加入1ml 0.04Mol/L 0.08 Mol/L過(guò)碘酸鈉(NaIO4)，置室溫中輕攪30min，在溶液呈黃綠色時(shí)，加1ml 0.16Mol/L乙二醇溶液，在室溫中放置1h，使氧化反應(yīng)中止，然后在4中對(duì)0.10Mol/L pH 9.5重碳酸鈉緩沖液透析，換液3次。在3ml HRP醛基溶液中，加入5mg(溶于1ml的碳酸鹽緩沖液中)待標(biāo)記蛋白，室溫置2h3h，加入5mg NaBH4，于

51、4冰箱放3h或過(guò)夜，然后用PBS液透析，離心去沉淀物。上清液即為酶結(jié)合物，純化后使用。改良過(guò)碘酸鈉法：取5mg HRP溶于0.5ml雙餾水中，加入新配制的0.06mol/L NaIO4水溶液(10ml雙餾水128mg NaIO4) 0.5ml，混勻，置4 30min； 取出后加入0.16mol/L乙二醇水溶液(10mlH2O 0.09ml乙二醇)0.5ml，室溫放置30min；加入含5mg純化抗體的水溶液1ml，混勻，并裝入透析袋，對(duì)0.05mol/L pH 9.5碳酸鹽緩沖液緩緩攪拌透析6h(或過(guò)夜)，使之結(jié)合；加入NaBH4溶液(5mg/ml)0.2ml，混勻，置42h；在以上溶液中緩慢加

52、入等體積的飽和硫酸銨溶液，混勻，4 30min，離心，去上清，沉淀以少許0.02Mol/L pH7.4 PBS液溶解，裝入透析袋，以同樣液體在4透析除鹽過(guò)夜；次日取出離心，以除去不溶物，即得酶抗體(HRPIgG)結(jié)合物，以0.02Mol/L pH 7.4 PBS液加至5ml；效價(jià)測(cè)定合格后，加入等量?jī)?yōu)質(zhì)甘油，分裝小瓶，低溫保存。標(biāo)記注意事項(xiàng)：1. 抗體或酶標(biāo)蛋白樣品與結(jié)合反應(yīng)用的Buffer的pH值不同：酶HRP的結(jié)合反應(yīng)在基礎(chǔ)pH Buffer中最有效，溶解樣品Buffer可用0.1M碳酸鹽緩沖液(pH9.3)或0.04M硼酸鈉鹽緩沖液(pH9.3-9.5)，其他緩沖液如0.1M磷酸鈉鹽緩沖

53、液(pH7.4)也可以制備少量分子的結(jié)合。2. 抗體或蛋白樣品中含有帶氨基的化合物如Tris、甘氨酸、NH4OH、尿素等影響有效的結(jié)合反應(yīng)：標(biāo)記前通過(guò)對(duì)酶標(biāo)緩沖液透析除去這些雜質(zhì)。3. 酶標(biāo)記物分子特別大：減少標(biāo)記反應(yīng)時(shí)間；標(biāo)記反應(yīng)在低溫下進(jìn)行同時(shí)改變標(biāo)記時(shí)間；調(diào)整標(biāo)記蛋白與HRP的分子比例到最佳；在中性pH值如含0.1MNaCl的0.1M磷酸鈉鹽緩沖液(pH7.4)中進(jìn)行連接反應(yīng)。NaIO4法HRP標(biāo)記抗原方法標(biāo)記步驟:(1)稱(chēng)取5mgHRP溶解于1ml蒸餾水中。(2)于上液中加入0.2ml新配的0.1M NaIO4溶液，室溫下避光攪拌30分鐘。(3) 加入0.4ml新配的0.2mol/l乙

54、二醇室溫避光繼續(xù)攪拌半小時(shí)(可省略)。(3)將上述溶液裝入透析袋中，對(duì)1mM pH4.4的醋酸鈉緩沖液透析4過(guò)夜。(4)加10l 0.2M PH9.5碳酸鹽緩沖液，使以上醛化HRP的pH升高到9.09.5，立即加入5mg溶于0.01M碳酸鹽緩沖液的抗原，室溫避光輕輕攪拌3小時(shí)，然后置4冰箱4h。(5)加0.1ml新配的4mg/ml NaBH4終止反應(yīng)磁力攪拌1h，再置42小時(shí)。(6)將上述液裝入透析袋中，對(duì)0.15M pH7.4 PBS透析，4過(guò)夜。(7) 取出透析過(guò)夜的酶標(biāo)抗原測(cè)定體積加入BSA至終濃度1-2mg/ml，混勻再加入1/2體積甘油混勻-20度凍存，并測(cè)定活性。注：保證抗原與HR

55、P摩爾比為1:1.HRP分子量約40kDa，等電點(diǎn)為PH7.2，在PH3.5-12均較穩(wěn)定，6315分鐘，室溫?cái)?shù)周、甲苯和苯類(lèi)溶劑處理都不影響它的活性。堿性磷酸酶是一種磷酸酯的水解酶，分子量為82 kDa。標(biāo)記HS-巰基的酶聯(lián)反應(yīng)方法試劑：1PBS，2. PBS: 0.05M EDTA，3. PBS: 0.01% thimerosal，4. Conjugate Storage Buffer，5.SATA，6. DMF，7. Hydroxylamine hydrochloride，8. NaOH Pellets，9. PD10 Column or Sephadex G25，10. Sulfo-S

56、MCC準(zhǔn)備巰基化抗體：1. 濃縮抗體到5-7mg/ml;2. 取10mgSATA溶于1ml DMF；3. 按3.0ml SATA:DMF每毫克抗體混合；4. 室溫輕輕攪動(dòng)溶解混合2h；5. 取0.5氯化羥胺ghydroxylamine hydrochloride溶于10ml的PBS:EDTA；6. 加0.25g NaOH調(diào)節(jié)以上溶液pH=7.0；7. 加入抗體溶液6.49ml/mlSATA；8. 輕輕室溫?cái)嚢枞芙?0min；9. 用PBS:EDTA平衡柱；10. 在柱上過(guò)濾除去巰基化抗體中的鹽。收集盡可能少體積不含SATA，將SATA流穿出柱；11. 保存巰基化抗體于2-8度超過(guò)1h；12. 用PBS重新平衡柱。準(zhǔn)備馬來(lái)酰胺：HRP6) 稱(chēng)取1.067mgHRP對(duì)每毫克的巰基化抗體；7) 加1.1mg巰基-SMCC每毫克HRP；8) 加PBS使HRP終濃度為8mg/ml；9) 磁力攪拌混合2h；10) PBS平衡柱除鹽HRP，收集第一個(gè)峰；準(zhǔn)備抗體：HRP連接5) 按1mgHRP每毫克抗體立即混合HRP與巰基化抗體；6) 在2-8度混合16-20h；7) 對(duì)PBS透析換3次液，每2h換一次；8) 加儲(chǔ)存Buffer稀釋2倍保存。酶標(biāo)記半胱氨酸方法二試劑：PBS: Dissolve the dry-blend