第七章 旋光色散和圓二色光譜 課件

1、7旋光色散和圓二色光譜旋光色散和圓二色光譜OVERVIEW 1. A molecule is optically active if it interacts differently with left and rightcircularly polarized light. This interaction can be detected either as a differential change in velocity of the two beams through the sampleoptical rotatory dispersion (ORD) or as a differe

2、ntial absorption of each beamcircular dichroism (CD).2. ORD spectra are characterized by ， which is the specific rotation at a given wavelength， or the molar rotation . Both have units of degreecm2dmol1. CD spectra are characterized by A (the differential absorption of the two beams) or the molar el

3、lipticity m， which at a given wavelength is related to A. CD or ORD bands are often referred to as Cotton effects. These can be positive or negative.3. CD is more frequently used than ORD because of superior instrumentation and the shapes of the CD curves. 4. Very few chromophores are intrinsically

4、optically active; those that are active include the amides and disulfide cystine in proteins. Most optical activity of chromophores arises from optical activity induced by interactions with asymmetrically placed neighboring groups.5. One of the main applications of CD spectra is based on their sensi

5、tivity to the secondary structure of proteins. Other uses include detection of conformational changes and measurement of ligand binding. 6. Optical activity can also be induced by the application of a magnetic field， which perturbs the energy levels of the system. This is the basis of magnetic circu

6、lar dichroism (MCD). Unlike CD， MCD is largely insensitive to molecular conformation， but it is sensitive to the total concentration of MCDactive chromophores and their local environment.7.1 引言引言早在十七世紀，Huggens就發(fā)現(xiàn)了光的偏振到了十九世紀，偏振光開始用于分子的旋光現(xiàn)象的研究Biot 1881 年發(fā)現(xiàn)石英能使偏振光的偏振面旋轉(zhuǎn)，在松節(jié)油等液體和某些氣體中也發(fā)現(xiàn)了這種效應。Biot 在發(fā)現(xiàn)旋光

7、現(xiàn)象的同時，還觀察到了電氣石的園二色性。后來將旋光色散與園二色性這兩種現(xiàn)象稱為科頓效應。 十九世紀中期，許多旋光性的定律開始公式化，并對十九世紀末有機立體化學和有機結(jié)構(gòu)理論的發(fā)展起到了直接的推動作用。1934年，Lowry出版了第一本完整的有關旋光色散的書”O(jiān)ptical Rotatory Power”。1953年Djerasi實驗室建立了第一臺偏振光檢測儀，從此ORD開始廣泛地用于研究有機分子和生物大分子。六十年代，園二色譜逐漸取代旋光色散方法，成為研究生物大分子溶液構(gòu)象的有力工具。7.2 原理原理7.2.1 平面偏振光、圓偏振光和橢圓偏振光當一束平面偏振光 (Plane Polarized

8、 Light) 通過某種物質(zhì)傳播時， 若出射光的偏振面相對于入射光的偏振面旋轉(zhuǎn)一定的角度， 這種物質(zhì)稱之為光光學活性物質(zhì)學活性物質(zhì) (Optically active substance)或手性物手性物質(zhì)質(zhì)(chiral substance)。 這種性質(zhì)則稱為光學活性光學活性(optical activity) 或手征性手征性 (chirality)。 光學活性物質(zhì)除使入射到它上面并通過它傳播的平面偏振光的偏振面旋轉(zhuǎn)一定的角度之外 (稱為“旋光旋光”)， 還會存在光吸收各向異性， 稱為“圓二圓二色性色性 (circular dichroism)?；畹纳矬w所含有的分子差不多都具有光學活性。 小

9、分子的光學活性來源于其結(jié)構(gòu)的不對稱性， 特別是分子中存在的不對稱的碳原子以及這些原子對附近生色團 (chromophore) 的影響。 生物大分子的構(gòu)象與其所表現(xiàn)出來的生物活性有著密切的關系， 因此旋光性和園二色性測量技術是研究生物大分子構(gòu)象及其功能間關系的重要手段。 光是橫波， 其電場矢量E和磁場矢量H與光傳播方向均垂直。 若光波電矢量E (以及磁矢量H) 取所有可能的方向， 而沒有一個方向較其他方向占優(yōu)勢， 這種光稱為自然光(圖1 (a) )。 由于光波產(chǎn)生感光作用主要是電場E引起的， 因而一般就把電場矢量E為光波的振動矢量。 該振動矢量與光波傳播方向所決定的平面叫做振動面。當自然光入射到

10、某些材料后， 出射光就變?yōu)槠湔駝用娲_定的光， 叫做平面偏振光平面偏振光或線偏振光線偏振光(圖 1(b)。平面偏振光的電矢量E的方向和電傳播方向所決定的平面， 叫偏振面偏振面 (Polarized plane)。 圖 1. Directions of the electric vector in polarized and unpolarized light. In unpolarized light (a)， or partly polarized light (c)， the oscillations take place at all angles perpendicular to the

11、 direction of travel; in polarized light (b) they are restricted to one angle.如下圖所示兩個頻率和振幅相同，偏振面互相垂直的平面偏振光，如果其相位差90，則它們合成為一個圓偏振光圓偏振光。 圖2 左旋園偏振光 圖3 右旋園偏振光 圖4 橢園偏振光 E0ji 一束平面偏振光可以分解為兩束振幅、頻率相同， 旋轉(zhuǎn)方向相反的圓偏振光(Circular polarized light)， 如圖 所示E=E0cost = j E0 cost = Er +ElEr 1/2(+iE sint+jEcost) (5)El 1/2(iE

12、sint+jEcost) (6)其中 E為平面偏振光電場矢量的振幅，為其角頻率，i和j為軸和軸上的單位矢量。 右旋園偏振光的電場矢量Er 之端點在空間的軌跡是以光的傳播方向為軸的左手螺旋， 而左旋園偏振光El之端點在空間的軌跡是以光的傳播方向為軸的右手螺旋， 它們的振動面隨時間而旋轉(zhuǎn)。 一個平面偏振光可以用下面的方程表示:E= E0 cos t = j E0 cos t i， j分別為X，Y座標軸方向上的單位矢量。7.2.2 旋光(Optical Rotation)、旋光色散(Optical Rotatory Dispersion， ORD)和圓雙折射 (Circular Birefrigen

13、ce)。 光在通過不同物質(zhì)時，其傳播速度會發(fā)生改變，定義光在真空中的速度C0與在某種物質(zhì)中的速度v之比為折射率n，即n= C0/v。如果某種物質(zhì)對于左旋偏振光和右旋偏振光的折射率nlnr，則左旋光和右旋光的旋轉(zhuǎn)速度會有所不同，它們的和與原來沒有樣品時相比旋轉(zhuǎn)了一個角度(見圖)，這種現(xiàn)象稱為旋光旋光。面對入射光，使入射光的偏振方向順時針旋轉(zhuǎn)的物質(zhì)叫右旋物質(zhì)右旋物質(zhì)，使入射光的偏振方向逆時針旋轉(zhuǎn)的物質(zhì)叫左旋物質(zhì)左旋物質(zhì)，習慣上用+號表示右旋物質(zhì)，用號表示左旋物質(zhì)。 對于光學各向異性物質(zhì)， 它對左旋園偏振光和右旋園偏振光的折射率nl和nr是不同的， 二者之差 = nl nr 稱為圓雙折射圓雙折射。

14、由于 c: 為真空中的光速， v: 為光在介質(zhì)中的速度， 因此某種物質(zhì)存在圓雙折射，入射的平面偏振光之左旋分量和右旋分量將以不同的傳播速度通過介質(zhì)， 通過該物質(zhì)后， 兩者之間存在一定的相位差， 若該介質(zhì)對左旋分量和右旋分量的吸收相同，出射的兩束圓偏振光分量將重新合成平面偏振光(而不是圓偏振光或橢圓偏振光），如圖6（b）所示， 其偏振面與入射平面偏振光之偏振面間的夾角為 。vcn 圖 6 (a) 園二色的產(chǎn)生：樣品對左旋L和右旋R兩個園偏振分量吸收不同，合成為橢圓偏振光；（b）園雙折射和旋光現(xiàn)象：樣品對左旋和右旋偏振光的折射率不同即L和R在樣品中的速度不同。合成的平面偏振光之偏振面旋轉(zhuǎn)了角。經(jīng)過

15、推導可得到: (弧度) (度) 式中為樣品厚度， 為光波波長。 由此我們看出， 旋光現(xiàn)象就是一種圓雙折射，旋光性的本質(zhì)就是旋光物質(zhì)具有兩個不同的折射率。 )(180)(rlrlnnlnnl平面偏振光通過樣品后其偏振面旋轉(zhuǎn)的角度obs。與光穿透的樣品厚度l、溶液樣品中旋光性物質(zhì)的濃度c成正比 (在一定的濃度范圍內(nèi))， 且與該光波長、樣品溫度T有 比例系數(shù)T稱為比旋比旋 (The specific rotation)或旋光率旋光率。 clTobsclobsT旋光可用比旋T表示，也可用摩爾比旋摩爾比旋(the Molar Rotation) T 或克分子旋光度克分子旋光度表示， 二者間的關系為: 其

16、中 MW是溶質(zhì)的分子量， 單位為克/摩爾，摩爾比旋的量綱為度厘米2分摩爾1。l為光徑，單位為分米(dm)，C為濃度，單位為克/毫升。 100100clMWMWobsTT 在生物大分子的研究中，還常用平均殘基旋光度平均殘基旋光度 (average residue rotation) ， 其定義為 MRW 100 其中 MRW 為平均殘基分子量平均殘基分子量(mean residue weight)，即蛋白分子量與殘基數(shù)之比 MW MRW 殘基數(shù) 對一般的蛋白質(zhì)分子，該值約為110-115。對于同一物質(zhì)， 比旋 或摩爾比旋 與入射偏振光的波長有關， 比旋 或摩爾比旋 與波長間的函數(shù)關系稱為旋光色散

17、旋光色散。 7.2.3 圓二色性(Circular Dichroism)和橢圓率(ellipticity)當一束光穿過樣品時，光的強度呈指數(shù)規(guī)律下降，服從Beer-Lambert定律。 log10(I0/It)= C l 其中I0是入射光的強度， It是穿過樣品后的光強度，C是樣品濃度，l是光徑，是消光系數(shù)(extinction coefficient)。 令A=log10(I0/It)= C l A稱為吸收度(absorbance)或光密度(optical density)。 當一束平面偏振光通過光學活性介質(zhì)傳播時， 由于介質(zhì)對二分量的消光系數(shù)l和r不等，即對左旋光和右旋光的吸收不同，一束平

18、面偏振光通過該樣品后，其左旋分量和右旋分量強度不再相同，它們的和就不再是平面偏振光而是橢圓偏振光。這種現(xiàn)象就叫做“圓二色圓二色(circular dichroism)“（圖6a）。由于存在圓二色性， 平面偏振光通過光學活性介質(zhì)后， 兩圓偏振分量電場矢量的大小不同了(實際上，由于同時存在圓雙折射， 因此二者位相也不同)，這樣兩個大小不同的圓偏振光合成的不再是平面偏振光， 而是橢圓偏振光(elliptically Polarized light)，其電場矢量端點在空間的軌跡是以光傳播方向為軸的橢形螺旋(elliptical helix)， 其振動面隨時間也是連續(xù)旋轉(zhuǎn)的 (圖 4)。我們可以通過進一

19、步的分析來理解園二色現(xiàn)象。如果 lr ， 則通過光學活性物質(zhì)的樣品后，左旋分量的振幅不再等于右旋分量的振幅。 假定左旋分量右旋分量，即El El Er 1/2(+i Er sin+j Er cos)El 1/2(i El sin+j El cos)Er + Eli(Er El )sin+j( Er + El )cos 這個光的電場矢量的端點軌跡是一個橢圓，即通過光學活性物質(zhì)的樣品后，左旋和右旋偏振光的和不再是平面偏振光，而是橢圓偏振光，橢圓的長軸在j方向上，長軸為Er + El，短軸在i方向上，短軸為Er El 。 圓二色可用吸收度差A或消光系數(shù)差來表示:A=Al Ar稱為圓二色性圓二色性 (

20、)。 有的文獻用摩爾消光系數(shù)表示圓二色性 = l r (Al Ar)Cl 上式中l(wèi)和r分別為左右旋分量的摩爾消光值 (molar absorbance)。園二色性的大小也可用橢圓率橢圓率來表示。橢圓偏振光電場矢量端點在空間的軌跡投影到垂直于光傳播方向的平面上為一橢圓，此橢圓的短軸 (the minor axis) a 與長軸 (the major axis) b 之比的反正切稱為橢圓率: a tg-1 （弧度） b 由理論分析可推出橢圓率和圓二色性間的關系為 180 2.303 (Al Ar) (度) 4與旋光度對應，在實際工作中，還常用比橢圓率（specific ellipticity）、摩

21、爾橢圓率 (molar ellipticity)和平均殘基橢圓率MRW（the mean resicue ellipticity）:= 其中為測得的橢圓率，單位為度，MW為分子量，單位為克/摩爾，MRW為平均殘基分子量，l為光徑，單位為分米，C為濃度，單位為克/毫升，的單位是度厘米2分摩爾-1。C CMW100 CMRWMRW100當不存在圓二色性時， 即l = r 時， 橢圓的短軸為零， 變?yōu)樵陂L軸方向的直線， 這正是前面討論過的平面偏振光， 不過偏振面相對于入射光偏振面旋轉(zhuǎn)了角度。 724 科頓效應 (Cotton effect) 在光學活性物質(zhì)的整個吸收帶內(nèi)， 其旋光色散曲線 (ORD)

22、呈 S形， 而相應的圓二色性曲線 (CD)呈鐘形， 這種ORD在吸收帶附近的異常效應和圓二色性在吸收峰處具有極值的現(xiàn)象稱為科頓效應 (圖7)。 ORD 曲線在較長波長一側(cè)有一峰的科頓效應稱為正的科頓效應 ，而此側(cè)有一谷的稱為負的科頓效應 圖7。正的科頓效應具有正的 CD 曲線， 其峰位在 S形 ORD曲線的凸到凹的轉(zhuǎn)折點。 圖 7(a) 正的科頓效應 (b) 負的科頓效應（參考書圖104） 從圖中可以看出：CD譜帶比ORD有更好的分辨率，但ORD譜帶的兩翼看到的信息可能是CD無法直接看到的。 此外， ORD譜是一種色散曲線（反映了折射率隨波長的變化）， 因此它與折射系數(shù)的符號在吸收峰附近的變化

23、有關。 從圖中還可以看出：CD譜帶比ORD有以下三個優(yōu)點：（A）CD譜帶比較容易辨認，因為一個有光學活性的電子躍遷，其ORD是一個色散曲線，而CD譜只有一個單相的譜峰。（B）ORD色散曲線分布的波長范圍比CD譜寬，即其分辨率不如CD譜高。（C）CD譜在檢測技術上比ORD更方便。這一點將在儀器部分介紹。 7.2.5 旋光色散與園二色譜的關系：旋光色散與園二色譜的關系：Kronig-Kramer變換式變換式CD譜與ORD譜是相互關聯(lián)的，實際中，這兩種現(xiàn)象總是同時發(fā)生的，它們之間的關系可以用Kronig-Kramer變換式表示: ( )20() d 2 ( )2 2 ( )2 0( ) d 2 (

24、)2 7.2.6 THE PHYSICAL BASIS OF OPTICAL ACTIVITY As we discussed in Chapter 2, transitions from the ground state to the excited state involve a displacement of charge. A linear displacement with an electric transition dipole moment is denoted by . The transition can also have a circular component; th

25、is (rotating current) then generates a magnetic dipole moment m perpendicular to the plane of the circular motion (see Figure 8(a). Optical activity requires a finite and a finite m. This corresponds to a helical displacement of charge. The result is that left or rightcircularly polarized beams then

26、 interact differently with the molecules in solution. These interactions do not average to zero even in molecules randomly oriented in solution (compare Linear Dichroism). (The magnitude of the transition is proportional to the vector product of and m). The required helical displacement of charge ma

27、y arise from the intrinsic nature of the chemical bonds, for example, in an n * transition (see Figure 8(b). Chromophores that have intrinsic optical activity are often termed asymmetric. The required helical displacement of charge may also arise from an induced effect because of the environment of

28、the molecule undergoing the transition. The resulting optical activity is then often referred to as an extrinsic Cotton effect. Figure 10.6 (a) A helical displacement of charge can be considered to comprise a linear displacement plus a circular displacement. (b) Rotation and translation of charge in

29、 an orbital. OPTICALLY ACTIVE CHROMOPHORES Optical activity is observed only when the environment in which a transition occurs is asymmetric. An inherently asymmetric chromophore, such as the peptide bond, is always optically active irrespective of the surrounding groupswhich can, however, modify it

30、s optical properties. In contrast, any optical activity from inherently symmetric chromophores is induced and results from interactions with asymmetrically placed neighboring groups. The sign and magnitude of the induced optical activity (Cotton effects) of a particular chromophore depend on the loc

31、al environment. Very few chromophores are inherently optically active. In proteins, apart from the amide chromophores ( 240 nm), only the disulfide cystine is intrinsically optically active. The positions of the CD bands from the disulfide are found in the range 240-360 nm. Their CD spectra are comp

32、lex to interpret and depend on the SS dihedral angle and the interactions with neighboring groups. They are not usually resolvable from the induced CD bands of the normally optically inactive aromatic side chains, which occur in the range 250-310 nm. Induced optical activity is also observed in the

33、heme absorption transitions of most hemeproteins and for the metal absorption bands in most metalloproteins. In nucleic acids, the individual bases of DNA and RNA are not optically active, but their incorporation into nucleosides or nucleotides results in induced optical activity. These effects depe

34、nd on the nature of the base and the glycosidic linkage. Carbohydrates generally absorb only in the far ultraviolet, but as instrumentation is improved, there will be more applications in this field. In polysaccharides, both the nature of the individual sugars and the linkages between them are impor

35、tant in determining the optical activity. 三、三、 儀器原理儀器原理 物質(zhì)光學活性研究， 既可以通過旋光色散 (ORD)譜的測量進行， 也可以通過園二色性 (CD) 的測量進行。 但是， CD 譜較 ORD 譜有明顯的優(yōu)點， 其譜帶與吸收帶重迭， 分子中不同生色團對于譜的貢獻比起在ORD 中可以更容易分辨， 而在ORD 中任意波長處的旋光性是分子中所有生色團色散貢獻之和。 其科頓效應又與吸收峰不一致， 解釋起來有較大困難。由于科頓效應曲線總是發(fā)生在光學活性物質(zhì)的吸收帶附近， 這時光學活性物質(zhì)也總是表現(xiàn)出園二色性， 因此近年來園二色性研究已基本取代了旋光

36、色散研究， 這里也僅介紹園二色性測量的儀器原理。園二色性測量，實際上是測量樣品對左旋偏振光和右旋偏振光吸收率的差值A=ALAR由公式2.303(ALAR)可以計算出橢圓率，進而由公式可以得到摩爾橢圓率。 4180lcMW100只要將頻率、強度完全相同的左、右旋偏振光交替地通過樣品，分別記錄樣品對它們的吸收值，由式A=ALAR即可得到該頻率下的圓二色性和橢圓率的值，逐漸改變左右旋偏振光的波長，即對波長進行掃描，即可得到圓二色譜(隨的變化曲線)。 圓二色測量譜儀的結(jié)構(gòu)框圖 光源（S）一般為氙燈，功率在500 W左右，在可見波段具有足夠的光強，且稱連續(xù)譜。紫外波段雖強度下降，但直至185 nm，仍有

37、相當?shù)膹姸龋禽^理想的光源。單色儀（MC）的用途是使光源發(fā)出的各種波長的光按要求成為單一波長的光波。起偏器（P）的作用是使單色光成為平面偏振光。 調(diào)制器（M）受程序控制系統(tǒng)的控制，使透過的光以一定的頻率交替地變?yōu)樽笮陀倚龍@偏振光。一般來說，這種調(diào)制器是由某種壓電晶體制成的晶片制成的，晶片兩面鍍上電極，兩電極之間加上一交變電壓，交變電壓的電壓值按照一定的頻率周期性地變化時，晶片的厚度也隨之變化。儀器的設計使交流電壓的峰值處獲得園偏振光。當電壓通過其正、負峰值時，可以交替地得到左、右旋園偏振光。 從調(diào)制器出來的左旋和右旋園偏振光通過樣品后，由檢測器（PD）進行檢測，然后輸入放大器（Amp.）和相

38、敏檢測器（PSD） ，由放大器出來的信號的直流分量和由相敏檢測器出來的信號的交流分量在運算單元中進行計算，得到A，最后輸入數(shù)據(jù)記錄系統(tǒng)。 A的測量和計算方法前面已經(jīng)介紹：A=ALAR由于吸收率A式中I0為入射光強度，I為出射光強度)ln(10ln1)(log0010IIII)ln(ln10ln100RRLLRLIIIIAAA由于入射的左、右旋園偏振光的強度是相等的，因此I0LI0R由于IR與IL相差很小，A很難測定。實際儀器中是將平面偏振光引入調(diào)制器，調(diào)制器是加一高頻交變電壓。選擇適當?shù)慕蛔冸妷汉驼{(diào)制器，使得在交變電壓的峰值處獲得園偏振光，當電壓通過其正、負峰值時，可以交替地得到左、右旋園偏振

39、光。當光學活性的物質(zhì)插入這園偏振光的光路中時，通過樣品后的光強度隨時間的變化如下圖，強度變化的頻率與外加電壓的頻率相同。 如果AL AR，則IR IL，即通過樣品后的右旋園偏振光的強度大于左旋園偏振光。當強度這樣變化的光照射到光電倍增管上時，輸出信號中含有AC分量IAC和DC分量IDC。IACIRILIDC )(21LRII如果AL AR，則IR IL，即通過樣品后的右旋園偏振光的強度大于左旋園偏振光。當強度這樣變化的光照射到光電倍增管上時，輸出信號中含有AC分量IAC (圖中S) 和DC分量IDC (圖中IA) 。IACIRILIDC )(21LRIIDCACDCACACDCACDCLRLR

40、LRLRLRIIIIIIIIIIIIIIIIII212122)()( 當x1，xxxxxxxxxxx2.)()()(.)1ln()1ln(11ln3232 這樣， 12DCACIIDCACDCACDCACLRIIIIIIIIA2210ln12121ln10ln1)ln(10ln1這樣，求出 就得到了A，也就得到了。 現(xiàn)代化的 CD 譜儀， 只要將儀器調(diào)整到正常工作狀態(tài)， 置樣品于光路中， 啟動儀器， 即可自動進行波長掃描 (在設定的頻率區(qū)間)，得到 CD譜。 DCACII7.4 園二色譜的生物學應用舉例園二色譜的生物學應用舉例7.4.1 氨基酸和多肽的園二色性氨基酸和多肽的園二色性氨基酸分子內(nèi)

41、的紫外生色基團有吲哚基、酚羥基、苯基、二硫鍵，咪唑基和羧基。當這些生色基團受到不對稱碳原子或其它不對稱結(jié)構(gòu)的影響時，在它們各自的吸收區(qū)域里表現(xiàn)出圓二色性。研究氨基酸（主要是芳香族氨基酸和胱氨酸）以及它們的衍生物的CD性質(zhì)，為研究蛋白質(zhì)的CD 譜提供基本的材料。同時，活性肽有重要的生理功能，因此肽的構(gòu)象與功能的關系是重要的分子生物學課題。肽的構(gòu)象也是蛋白質(zhì)構(gòu)象的一種模型。肽的圓二色性為研究肽在溶液中的構(gòu)象提供了許多重要的信息。7.4.1.1氨基酸的圓二色譜氨基酸的圓二色譜 7.4.1.1.1 酪氨酸及其衍生物的近紫外酪氨酸及其衍生物的近紫外CD譜譜酪氨酸及其衍生物在中性水溶液中的CD譜都在275

42、 nm左右顯示CD峰。下圖表示 N-乙酸酪氨酸酰胺在水溶液中的CD譜。 275 nm左右的峰可正可負，視模型化合物以及所用溶劑而定。在水溶液中，CD峰處的橢圓值在660到660間，比一般蛋白質(zhì)中每個酪氨酸殘基的CD貢獻要小得多。在有機溶劑中或在低溫下，酪氨酸及其衍生物的CD峰值顯著增大。Strickland等得到在低溫下酪氨酸衍生物在有機溶劑中的CD譜，它們能清楚地顯示酪氨酸 CD譜的振動結(jié)構(gòu)。但即便在室溫下的水溶液中，一般酪氨酸衍生物的CD譜仍能顯示一峰一肩（見下圖），肩在峰的長波長一側(cè)。溶劑組成的改變能影響譜帶的位置。酪氨酸酚羥基如和其他質(zhì)子受體組成氫鍵，則其CD譜會產(chǎn)生較大的紅移。 有些

43、酪氨酸衍生物如N-乙酰-O-甲-酪氨酸乙酯在甲基環(huán)己烷中顯示的CD譜形和其吸收譜形幾乎完全一樣，這說明這個化合物在此溶劑中以單一的構(gòu)象子（Conformer）存在，但有許多模型化合物在溶液中以處于平衡狀態(tài)的多個構(gòu)象子存在。每個構(gòu)象子的CD譜各不相同，有正有負。這些CD譜疊加起來，使得觀察到的CD譜和吸收譜不一致的情形出現(xiàn)。酚羥基在堿性溶液中解離時，給出290 nm以上的CD峰，峰形和峰位與其吸收諧相似。 7.4.1.1.2色氨酸及其衍生物的近紫色氨酸及其衍生物的近紫外外CD譜譜色氨酸的近紫外CD譜波長位置不大受溶劑條件的影響，一般在288-292 nm間。溶劑對波長位置的影響，氫鍵的形成，使色

44、氨酸及其衍生物的C D譜出現(xiàn)多種多樣的情況。 7.4.1.1.3苯丙氨酸及其衍生物的苯丙氨酸及其衍生物的近紫外近紫外CD譜譜由于苯環(huán)的高度對稱性，苯丙氨酸側(cè)鏈的CD值和上述兩個芳香族氨基酸相比要小得多（見上圖）。典型的苯丙氨酸模型化合物的CD譜在250268 nm間顯示多個振動能級峰，尤其是268 nm譜段，在室溫下也能顯示陡直的峰形。 7.4.1.1.4 芳香族氨基酸以及它們芳香族氨基酸以及它們衍生物的遠紫外衍生物的遠紫外CD譜譜芳香族氨基酸以及它們的衍生物在250 nm以下都有較強的CD貢獻（下圖），在這個區(qū)域內(nèi)，苯丙氨酸的CD值和酪氨酸或色氨酸的相差不多，這和近紫外區(qū)域的情況形成對照。在

45、酪氨酸的各種模型化合物中，226 nm左右的CD峰總是正的。 ，N-乙酰酪氨酰胺；-，N-乙酰苯丙氨酸胺；，N-乙酰色氨酰胺 7.4.1.1.5 胱氨酸及其衍生物的胱氨酸及其衍生物的紫外紫外CD譜譜胱氨酸在水溶液中的CD譜中，近紫外區(qū)的負峰歸屬于二硫鍵，遠紫外區(qū)的正峰歸屬于羧基貢獻。和其他氨基酸的羧基貢獻比，此正峰出現(xiàn)在較長的波長位置上，這可能是由于羧基和二硫鍵兩個基團電子的相互作用，因而降低了羧基躍遷的能量；也可能由短波長區(qū)域的二硫鍵的強負CD峰的存在造成。胱氨酸的各種衍生物在水溶液中也顯示相近的CD譜。 二硫鍵是個具有不對稱的生色基團，其正常的雙面角接近90，有右手(P)和左手(M）兩種旋

46、轉(zhuǎn)構(gòu)象，在胱氨酸及其簡單衍生物的溶液中，二硫鍵以幾乎等量的P和M構(gòu)象存在，因而它們的CD貢獻互相抵消，即二硫鍵的固有不對稱性并不對CD譜作出貢獻。胱氨酸及其簡單衍生物的 CD譜只來源于不對稱碳原子對二硫鍵的擾動。胱氨酸以晶體形式存在時，其二硫鍵只能采取某一種構(gòu)象。對它的晶體所作的CD研究顯示，波長最長的CD 譜段可能與二硫鍵的手征性有關，即 P構(gòu)象顯示正 CD峰， M構(gòu)象顯示負 CD峰。 7.4.1.1.6 脯氨酸衍生物的脯氨酸衍生物的CD譜譜核磁共振研究說明，X-Pro酰胺鍵存在反式一順式異構(gòu)現(xiàn)象。Madison和Schelman在對N-乙酸脯氨酸一N，N-二甲基酸胺（AcProDMA）的研

47、究中，計算得到了反式與順式的不同 CD譜（見下圖）。在水溶液中，AcProDMA主要以反式異構(gòu)體存在，在非極性溶劑中主要以順式異構(gòu)體存在。上述結(jié)果對研究含有較多脯氨酸殘基的肽的CD行為和多聚脯氨酸螺旋構(gòu)象是很有幫助的。 7.4.1.1.7 其它氨基酸的紫外其它氨基酸的紫外CD譜譜在近紫外區(qū)，其它氨基酸均無 CD貢獻。在遠紫外區(qū)，組氨酸側(cè)鏈在213 nm顯示正峰；其余的氨基酸一般在200210 nm間顯示正峰（下圖），此為羧基所貢獻，pH值升高使此峰藍移。 7.4.2 用園二色譜研究多肽和蛋白質(zhì)的用園二色譜研究多肽和蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)二級結(jié)構(gòu)7.4.2.1 多聚氨基酸的遠紫外園二色譜多聚氨基酸的遠

48、紫外園二色譜 利用旋光色散研究蛋白質(zhì)的構(gòu)象雖然有過較大的進展，但是存在兩個困難。首先是在旋光色散譜中，科頓效應的極值都在吸收帶極值的旁邊，而不在吸收帶的頂端，這對分析科頓效應的歸屬帶來了困難。其次是殘基本身有旋光值。要討論ORD與構(gòu)象關系時，有必要將殘基的旋光扣除。但是我們只能測出氨基酸的旋光值而無法測出殘基的旋光值，因此這種扣除是很困難的。這兩個缺點是ORD自身的性質(zhì)所決定的。Holzwarth與Doty發(fā)表了他們利用圓二色譜來測定多聚氨基酸和肌紅蛋白的構(gòu)象的工作以后，就逐漸有一些工作者從旋光色散轉(zhuǎn)向用圓二色性來研究蛋白質(zhì)。六十年代初，一般儀器只能測出波長大于250 nm的CD譜，因此進展不

49、大。后來儀器的改進能夠測出波長范圍在190250 nm的CD譜。由于這一區(qū)域的譜線與蛋白質(zhì)分子主鏈構(gòu)象有密切的聯(lián)系，于是吸引了許多科學家應用CD來研究蛋白質(zhì)。相應于ORD的缺點，CD譜有許多有利的方面。首先它的峰或放樣的位置與吸收峰的位置基本重疊，因此每一個譜峰的貢獻者是誰可以利用吸收光譜的知識來尋找。其次是肽鍵上與碳原子有關的共價鍵的吸收光譜帶在紅外區(qū)，或在低于180 nm的超遠紫外區(qū)。在可見波長或紫外區(qū)它與碳原子相關的價電子不表現(xiàn)出任何吸收帶，因此也沒有它的CD帶。這樣，殘基除非有生色團的側(cè)鏈，不然就不提供CD譜?？梢钥闯?ORD的缺點在CD譜中就可以避免。 多聚氨基酸從化學上講比蛋白質(zhì)簡

50、單，只含一種或幾種氨基酸，因此研究它們的構(gòu)象比較容易。許多人曾詳細地用其它方法（如紅外等）研究過它們的構(gòu)象，了解到在何種條件下，它們以哪一種構(gòu)象存在，因此，蛋白質(zhì)的CD譜可以以多聚氨基酸為模型化合物來著手研究。 用許多其它方法證明，多聚-L-賴氨酸（PLL）在 pH不同時有不同的構(gòu)象。在水溶液中。pH 11，室溫時，它是螺旋；pH 11，52C加熱 15分鐘后即轉(zhuǎn)變成 折疊；而在pH 5.7時，它是無規(guī)卷曲。Greenfield與Fasman利用這一特點測定了PLL在不同構(gòu)象狀態(tài)下的CD譜，其結(jié)果如下圖 。 對于 螺旋講，它的曲線與 PMLG、 PLA等相同，也是雙負峰。Holzwarth等人

51、證明，谷氨酸、賴氨酸與丙氨酸的共聚物在螺旋時也是呈相同曲線。此后Beychok測定的多聚氨基酸的CD曲線也相同。因此認為，遠紫外雙負峰是螺旋的典型譜形。 Gratzer與Cowburn總結(jié)了 1969年前的工作指出，222-223 nm間的負峰是肽鏈處于螺旋時肽鍵n-*躍遷所貢獻。但是極值處的數(shù)值在不同的實驗室利用不同的多聚氨基酸，大約有10的差別。 208-209 nm的負峰也是螺旋肽鍵的*躍遷所貢獻，各家的數(shù)據(jù)可以有25的波動。對于191 nm講，它也是螺旋的肽鍵*躍遷的貢獻，比橢圓值間可以有30的波動。事實上，數(shù)值間的這種差別是不算大的，結(jié)果相當滿意。 PLL于折疊時給出的曲線是在215

52、 nm處的負峰。在中性pH時的SDS溶液中，PLL也呈現(xiàn)折疊。此時它的CD譜在218 nm有負峰，但218相應變小。許多工作者也發(fā)現(xiàn)，結(jié)構(gòu)的CD譜與溶劑有較密切的關系，因此相應地看，折疊的橢圓值不如螺旋者那樣恒定。但是從譜線形狀看，圖63曲線2是典型的?；谶@種種實驗基礎，一般都認為，該曲線反映了多聚氨基酸的折疊結(jié)構(gòu)。 無規(guī)卷曲時PLL給出的曲線是198 nm的負峰,在 220 nm附近一個小而平寬的正峰。這種峰形是否能典型地代表無規(guī)卷曲，看法有些混亂。Tiffany及 Krimm（1969）發(fā)現(xiàn) Na-PLGA（多聚-L-谷氨酸鈉）在水溶液中給出正峰，但在3摩爾升胍中該峰消失，變成了218-

53、220 nm處的負肩，見下圖。 Dearborn與 Wetlaufer測定摩爾升胍（ PH 6.0）中PLL的CD譜，發(fā)現(xiàn)它的譜形與在0.01摩爾升NaCl中的一樣，也是無規(guī)卷曲狀。Fasman等人研究了Na-PLGA和PLL做成干膜時的圓二色譜。他們（1970）發(fā)現(xiàn)，在200-205 nm有一負峰，同時在215-310 nm間有一負的肩。此外，Wetlaufer等及 Fasman等都發(fā)現(xiàn)，一些變性蛋白質(zhì)的譜形與PLL在溶液中的譜形不完全一樣?？偟膩砜?，這些變性蛋白質(zhì)的結(jié)果與PLL的曲線有兩點區(qū)別：一是負峰位置不正在198 nm，而經(jīng)常有紅移，峰值也小得多。二是220 nm附近正的小而平寬的峰

54、消失，代之以負的峰，這些結(jié)果如下圖所示。綜觀這些曲線，可以認為：200 nm附近的負峰是無規(guī)卷曲的特征曲線。 6.4.2.2 用蛋白質(zhì)遠紫外圓二色譜用蛋白質(zhì)遠紫外圓二色譜單值法計算單值法計算 螺旋含量螺旋含量 從多聚氨基酸的研究得出了肽鏈在三種構(gòu)象時的典型曲線。從蛋白質(zhì)的CD譜看也有類似曲線。例如，肌紅蛋白，胰島素，溶菌酶等都給出類似于螺旋的曲線。免疫球蛋白的CD譜類似于多聚氨基酸折疊的譜形。因此可以設想不僅可以用多聚氨基酸為模型定性地研究蛋白質(zhì)分子主要包含了什么構(gòu)象，還可能定量地研究蛋白質(zhì)分子中各種構(gòu)象的含量。 螺旋給出208 nm與222 nm兩個負峰?？墒钱敵鮾x器水平要測準208 nm處

55、的是比較困難的，因此Fasman等人提出用222來計算蛋白質(zhì)螺旋度的方法。他們假設PLL的參考值可以應用于蛋白質(zhì)，并且認為折疊可以忽略不計，于是列出下列公式 38000222222RHX隨著儀器的發(fā)展，紫外CD譜可以測準到185nm。此時Greenfield和Fasman發(fā)現(xiàn)，對于 PLL講，折疊與無規(guī)卷曲兩種構(gòu)象狀態(tài)的CD譜相交在208 nm。在交點上其平均橢圓值2084000 度厘米2分摩爾1。在 螺旋態(tài)時， =-32.600+4000度厘米2分摩爾1。因此建議改用下列公式來計算螺旋的含量: H2084000330004000208HX練習題某蛋白質(zhì)濃度為0.05 mg/ml,光徑為10

56、mm,測得208 nm處的橢圓度值208的測量值為102 m(毫度)，試計算208 nm處的平均殘基橢圓度值和該蛋白質(zhì)中螺旋的含量。 Fasman等人還提出了折疊含量的計算方法。其原則是根據(jù)208計算出螺旋，然后假設不同的折疊的含量X，并令XH X XR=1其中XR是無規(guī)卷曲的含量。于是認為各不同波長時的 是各構(gòu)象組分的貢獻的加和。利用計算機算出各波長的，得出計算曲線。假設一些不同的X值，分別求出它們相應的計算曲線，找出與實驗曲線最接近的曲線。相應于該最接近曲線的X及XR即認為是該蛋白質(zhì)的相應結(jié)構(gòu)的含量。此法被Fasman稱為方法I。為了改進計算精度，他們還利用計算機將公式及從方法I得到的X及

57、XR的數(shù)值反復修正，使最后的擬合曲線與實驗曲線之差變得最小，于是得到更為可靠的XH、X，及XR值。這種修正的方法被Fasman等稱為方法II，其結(jié)果與X射線晶體結(jié)構(gòu)的結(jié)果比較，螺旋含量高的蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)比較好；對于螺旋含量低，結(jié)構(gòu)含量較高的蛋白質(zhì)，數(shù)據(jù)不夠理想。 6.4.2.3用遠紫外圓二色譜計算蛋白用遠紫外圓二色譜計算蛋白質(zhì)的構(gòu)象含量質(zhì)的構(gòu)象含量 Fasman等人的計算方法雖然結(jié)果比較滿意，但是他所用的單一構(gòu)象的參考數(shù)值及曲線來自多聚氨基酸。蛋白質(zhì)是包括了多種氨基酸的、有特定順序（即一級結(jié)構(gòu)）的大分子，二者結(jié)構(gòu)不同，因此Fasman所使用的參考數(shù)值能否用于蛋白質(zhì)是一個疑問。如前述，以變性蛋白質(zhì)的

58、 CD譜與PLL無規(guī)卷曲的 CD譜比，兩者有相當?shù)牟煌虼颂岢隽私獬龅鞍踪|(zhì)的參考曲線問題。Saxena與Wetlaufer提出可以利用已解出晶體結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)，算出它們的含量，然后測定這些蛋白質(zhì)的遠紫外CD譜，在這一基礎上解出蛋白質(zhì)在三種構(gòu)象狀態(tài)下的參考曲線。首先他們假設，每一波長的橢圓值是三種構(gòu)象在該波長的貢獻的加和，即 同時服從方程XH X XR=1，H,、,及R,各是蛋白質(zhì)的殘基全部處于相應的構(gòu)象時在該波長的橢圓值。XH、X，及XR值可以由晶體結(jié)構(gòu)解出。由于該方程式有三組未知數(shù)，即H,、,及R,。因此只要有三個蛋白質(zhì)，即可解出這三根參考曲線。 ,RRHHXXXWedlaufer等用肌紅蛋

59、白，溶菌酶及核糖核酸酶三個蛋白質(zhì)的實驗結(jié)果，算出了三根參考曲線，如下圖中所示。圖中同時列出了Fasman從PLL來的相應曲線。兩組曲線相比，頗為相似。在蛋白質(zhì)中，a螺旋的雙負峰的位置也是222 nm及208 nm，但蛋白質(zhì)的222 比 PLL的222 更負；從 折疊看，蛋白質(zhì)的CD與PLL比較有顯著不同，即負峰移到 220 nm，但 195 nm的正峰與螺旋相似；對于無規(guī)卷曲講，差異更顯著,蛋白質(zhì)的負峰移至192193 nm處，其只有PLL的三分之二，在222 nm處出現(xiàn)正峰，222 相當于PLL的四倍。 和Wetlaufer等人差不多同時，Chen與 Yang提出了相類似的方法。他們假設，一

60、個蛋白質(zhì)分子內(nèi)由三種構(gòu)象成分組成，即螺旋，折疊和無規(guī)卷曲，并服從式XH X XR=1假設。然后進一步假設，各個波長的值由上述三種構(gòu)象所共同組成，并且是它們的代數(shù)和，即有下列關系： 其中，H,、,及R,各是蛋白質(zhì)在全部殘基都是螺旋，折疊及無規(guī)卷曲時波長是時的值。 ,RRHHXXX根據(jù)一些多聚氨基酸的遠紫外CD譜，他們假設，各種蛋白質(zhì)當殘基全部處于螺旋，或折疊，或無規(guī)卷曲時，相應的譜線都是相同的，即），H,、,及R, 三根譜線能夠適用于所有的蛋白質(zhì)。這樣，可以設法找到蛋白質(zhì)的三種構(gòu)象的標準參考曲線。 有了這些前提，他們就采用了與Wetlaufer相同的方法，即找到一些蛋白質(zhì)，它們的晶體結(jié)構(gòu)已經(jīng)解出