基因芯片的操作流程及步驟教學提綱

1、基因芯片的操作流程及步驟1 CELL =23 PAIRS OF CHROMOSOMES1 CELL =23 PAIRS OF CHROMOSOMES生物芯片的制作步驟生物芯片的制作步驟 細胞細胞對對mRNA進行標記進行標記雜交雜交基因表達資料基因表達資料基因芯片研制的總體藍圖基因芯片研制的總體藍圖 研制方向的確定研制方向的確定基因組序列分析與待檢基基因組序列分析與待檢基因探針序列的確定因探針序列的確定檢測樣品檢測樣品 的制備的制備探針陣列的探針陣列的準備準備檢測設備的檢測設備的研制研制雜交檢測與數(shù)據(jù)分析雜交檢測與數(shù)據(jù)分析簡介 基因芯片 探針固相原位合成技術(shù)與照相平板印刷技術(shù)探針固相原位合成技術(shù)

2、與照相平板印刷技術(shù) 激光共聚焦顯微技術(shù)激光共聚焦顯微技術(shù)大量探針分子（通常每平方厘米點陣密度高于500）于固定支持物上檢測每個探針分子的雜交信號強度與被標記的樣品分子進行雜交獲取樣品分子的數(shù)量和序列信息基因芯片是信息時代的產(chǎn)物基因芯片是信息時代的產(chǎn)物橫跨橫跨：生命科學、物理學、生命科學、物理學、計算機科學、微電子技術(shù)計算機科學、微電子技術(shù)光電技術(shù)、材料科學光電技術(shù)、材料科學 等現(xiàn)代高等現(xiàn)代高科技。科技。 中科院遺傳所人類基因組中心 北京大學 聯(lián)合基因集團有限公司我國第一家批量生產(chǎn)基因 芯片擁有近2千條基因藥物發(fā)明專利 東南大學吳健雄實驗室 中科院計算所生物信息學實驗室 上海生科院4.我國主要研

3、究單位我國主要研究單位我國基因芯片的研究現(xiàn)狀 目前，我國尚未有較成型的基因芯片問世，但據(jù)目前，我國尚未有較成型的基因芯片問世，但據(jù)悉已有幾家單位組織人力物力從事該技術(shù)的研制悉已有幾家單位組織人力物力從事該技術(shù)的研制工作，并取得了一些可喜的進展。標志著我國相工作，并取得了一些可喜的進展。標志著我國相關學科與技術(shù)正在走向成熟。關學科與技術(shù)正在走向成熟。 涉及領域：生命科學、計算機科學、精密機械科涉及領域：生命科學、計算機科學、精密機械科學學生物芯片分類生物芯片分類 根據(jù)用途還可以把生物芯片分為兩類：信息生物芯片根據(jù)用途還可以把生物芯片分為兩類：信息生物芯片（information-biochipi

4、nformation-biochip）和功能生物芯片（）和功能生物芯片（function-function-biochipbiochip）。）。6400點的基因芯片點的基因芯片 （面積（面積 12X14 mm)基因芯片（gene chip）的原理基因芯片的測序原理是雜交測序法，即通過與一組已知序列的核酸探基因芯片的測序原理是雜交測序法，即通過與一組已知序列的核酸探針雜交進行核酸序列測定的方法。在一塊基片表面固定了序列已知的針雜交進行核酸序列測定的方法。在一塊基片表面固定了序列已知的八核苷酸的探針。當溶液中帶有熒光標記的核酸序列八核苷酸的探針。當溶液中帶有熒光標記的核酸序列TATGCAATCTA

5、GTATGCAATCTAG，與基因芯片上對應位置的核酸探針產(chǎn)生互補匹配時，通過確定熒光強與基因芯片上對應位置的核酸探針產(chǎn)生互補匹配時，通過確定熒光強度最強的探針位置度最強的探針位置 ，獲得一組序列完全互補的探針序列。據(jù)此可重，獲得一組序列完全互補的探針序列。據(jù)此可重組出靶序列的核酸組出靶序列的核酸?；蛐酒址Q基因芯片又稱DNADNA微陣列微陣列（DNAmicroarrayDNAmicroarray） 三種主要類型：三種主要類型：1 1）固定在聚合物基片（尼龍膜、硝酸纖維膜等）表面上的核酸探針）固定在聚合物基片（尼龍膜、硝酸纖維膜等）表面上的核酸探針或或cDNAcDNA片段片段通過同位素標記的

6、靶基因與其雜交，通過放射顯影技通過同位素標記的靶基因與其雜交，通過放射顯影技術(shù)進行檢測術(shù)進行檢測2 2）用點樣法固定在玻璃板上的）用點樣法固定在玻璃板上的DNADNA探針陣列探針陣列通過與熒光標記的靶通過與熒光標記的靶基因雜交進行檢測基因雜交進行檢測3 3）在玻璃等硬質(zhì)表面上直接合成的寡核苷酸探針陣列）在玻璃等硬質(zhì)表面上直接合成的寡核苷酸探針陣列與熒光標與熒光標記的靶基因雜交進行檢測記的靶基因雜交進行檢測把大量分子檢測單元集成在一個微把大量分子檢測單元集成在一個微小的固體基片表面，可同時對大量小的固體基片表面，可同時對大量的核酸和蛋白質(zhì)等生物分子實現(xiàn)高的核酸和蛋白質(zhì)等生物分子實現(xiàn)高效、快速、低

7、成本的檢測和分析效、快速、低成本的檢測和分析?；蛐酒椭饕愋?多種方法將寡核苷酸或短肽多種方法將寡核苷酸或短肽 固定到固相支持物上固定到固相支持物上 原位合成（原位合成（in situ synthesisin situ synthesis） 合成點樣合成點樣 支持物：支持物：玻璃片、硅片、聚丙烯膜、硝酸纖維素膜、尼龍玻璃片、硅片、聚丙烯膜、硝酸纖維素膜、尼龍膜等膜等薄膜型、玻片型微板型集成電路型 基因芯片基因芯片 /DNA 微陣列微陣列Gene Chip /DNA Microarray核酸雜交技術(shù)核酸雜交技術(shù)是基因芯片應用的基礎。是基因芯片應用的基礎。第二節(jié)、基因芯片技術(shù)第二節(jié)、基因芯片

8、技術(shù)核酸體外雜交技術(shù)核酸體外雜交技術(shù) 表達型基因芯片的設計表達型基因芯片的設計一、基因芯片（一、基因芯片（DNA微陣列）微陣列）u 寡核苷酸芯片、寡核苷酸芯片、cDNAcDNA芯片、芯片、GenomicGenomic芯片芯片 u 模式一：是將靶模式一：是將靶DNADNA固定于支持物上，適固定于支持物上，適 合于大量不同靶合于大量不同靶DNADNA的分析，的分析，u 模式二：將大量探針分子固定于支持物上，模式二：將大量探針分子固定于支持物上， 適合對同一靶適合對同一靶DNADNA進行不同探針序列的分進行不同探針序列的分 析。析。 1.基因芯片原理 基因芯片基因芯片是在基因探針的基礎上研制出的。它

9、是在基因探針的基礎上研制出的。它將大量探針分子固定于支持物上，然后與標記的樣品將大量探針分子固定于支持物上，然后與標記的樣品進行雜交，通過檢測雜交信號的強度及分布來進行分進行雜交，通過檢測雜交信號的強度及分布來進行分析。基因芯片把大量分子檢測單元集成在一個微小的析。基因芯片把大量分子檢測單元集成在一個微小的固體基片表面，可同時對大量的核酸和蛋白質(zhì)等生物固體基片表面，可同時對大量的核酸和蛋白質(zhì)等生物分子實現(xiàn)高效、快速、低成本的檢測和分析。分子實現(xiàn)高效、快速、低成本的檢測和分析。 基因芯片技術(shù)基因芯片技術(shù)是建立在是建立在Southern blotSouthern blot基礎之上的，基礎之上的，可

10、以說它是可以說它是Southern blotSouthern blot的改進和發(fā)展，它的原理是：的改進和發(fā)展，它的原理是：變性變性DNA DNA 加入探針后在一定溫度下退火，同源片段之加入探針后在一定溫度下退火，同源片段之間通過堿基互補形成雙鏈雜交分子。間通過堿基互補形成雙鏈雜交分子。2.基因芯片的基本原理分析基因芯片的基本原理分析 任何線狀的單鏈任何線狀的單鏈DNA或或RNA序列均可被分解為一個序列序列均可被分解為一個序列固定、錯落而重疊的寡核苷酸，又稱亞序列固定、錯落而重疊的寡核苷酸，又稱亞序列（subsequence）。例如可把寡核苷酸序列）。例如可把寡核苷酸序列TTAGCTCATATG

11、分解成分解成5個個8 nt亞序列：亞序列： 這這5個亞序列依次錯開一個堿基而重疊個亞序列依次錯開一個堿基而重疊7個堿基。個堿基。 亞序列中亞序列中A、T、C、G 4個堿基自由組合而形成的所有可個堿基自由組合而形成的所有可能的序列共有能的序列共有65536種。種。 假如只考慮完全互補的雜交，那么假如只考慮完全互補的雜交，那么48個個8 nt亞序列探針中，亞序列探針中，僅有上述僅有上述5個能同靶個能同靶DNA雜交。雜交。 可以用人工合成的已知序列的所有可能的可以用人工合成的已知序列的所有可能的n體寡核苷酸探體寡核苷酸探針與一個未知的熒光標記針與一個未知的熒光標記DNA/RNA序列雜交，通過對雜序列

12、雜交，通過對雜交熒光信號檢測，檢出所有能與靶交熒光信號檢測，檢出所有能與靶DNA雜交的寡核苷酸，雜交的寡核苷酸，從而推出靶從而推出靶DNA中的所有中的所有8 nt亞序列，最后由計算機對大亞序列，最后由計算機對大量熒光信號的譜型（量熒光信號的譜型（pattern）數(shù)據(jù)進行分析，重構(gòu)靶）數(shù)據(jù)進行分析，重構(gòu)靶DNA 的互補寡核苷酸序列。的互補寡核苷酸序列。 原理原理 - 通過雜交檢測信息通過雜交檢測信息一組寡核苷酸探針一組寡核苷酸探針TATGCAATCTAGCGTTAGATACGTTAGAATACGTTAGATCTACGTTAG由雜交位置確定的一組由雜交位置確定的一組核酸探針序列核酸探針序列GTTA

13、GATC雜交探針組雜交探針組TATGCAATCTAG重組的互補序列重組的互補序列靶序列靶序列TACGTTAGACGTTAGAATACGTTACGTTAGATGTTAGATC ATACGTTA基因芯片熒光標記的樣品熒光標記的樣品 共聚焦顯微鏡共聚焦顯微鏡獲取熒光圖象獲取熒光圖象雜交結(jié)果分析雜交結(jié)果分析探探 針針 設設 計計雜交提出問題提出問題芯片設計芯片設計芯片制作芯片制作點樣方法點樣方法 在片合成在片合成試樣處理試樣處理芯片雜交芯片雜交雜交檢測雜交檢測數(shù)據(jù)分析數(shù)據(jù)分析實際應用實際應用PCR擴增擴增靶基因標記靶基因標記表達差異分析表達差異分析多態(tài)性分析多態(tài)性分析再測序再測序生物信息學生物信息學數(shù)

14、學優(yōu)化數(shù)學優(yōu)化數(shù)據(jù)庫數(shù)據(jù)庫基因芯片的相關技術(shù)示意基因芯片的相關技術(shù)示意圖圖二、二、 基因芯片基本操作流程基因芯片基本操作流程 制備總制備總RNA mRNARNA mRNA經(jīng)經(jīng)RT-PCRRT-PCR用用Cy3Cy3（正常對照（正常對照組）和組）和Cy5Cy5（實驗組）熒光標記目的基因，得（實驗組）熒光標記目的基因，得到到cDNA cDNA 探針探針 混合標記探針混合標記探針與表達譜芯片與表達譜芯片上核苷酸片段（或基因）雜交上核苷酸片段（或基因）雜交掃描掃描分析雜分析雜交結(jié)果交結(jié)果結(jié)論結(jié)論 載體載體+ +寡核苷酸寡核苷酸- -探針分子探針分子+ +熒光染料熒光染料- -點樣儀點樣儀- -掃描儀掃

15、描儀- -計算機計算機+ +專業(yè)軟件專業(yè)軟件基基 因因 芯芯 片片 流流 程程樣品制備樣品制備芯片制備芯片制備雜交雜交雜交信號檢測雜交信號檢測數(shù)據(jù)分析數(shù)據(jù)分析基因芯片的操作流程基因芯片流程（一）基因芯片流程（一）1. 實驗設計實驗設計2. 樣品制備樣品制備（指mRNA或總RNA樣品，包括對照組和實驗組。將mRNA或總RNA分別進行逆轉(zhuǎn)錄生成cDNA，然后將對照組和實驗組cDNA分別標記Cy3和Cy5熒光信號）3. 芯片制備芯片制備（寡核苷酸探針或 cDNA探針，包括PCR，純化，點樣等步驟）例例 基于芯片的基因測序基于芯片的基因測序基因芯片流程（二）基因芯片流程（二）4. 芯片雜交芯片雜交（將

16、用Cy3和Cy5熒光標記的對照組和實驗組的cDNA 等量混合，與芯片進行雜交）5. 芯片掃描芯片掃描（采用激光掃描儀，分別用532nm和635nm波長激光掃描芯片，對于每張芯片，得到Cy3和Cy5通道兩幅圖象）cDNA spotted microarrays基因芯片流程（三）基因芯片流程（三）6. 圖象處理圖象處理（采用專門軟件，對圖象（采用專門軟件，對圖象進行分析，提取每個點上的數(shù)字信號，進行分析，提取每個點上的數(shù)字信號，得到原始數(shù)據(jù)表）得到原始數(shù)據(jù)表）7. 數(shù)據(jù)校正和篩選數(shù)據(jù)校正和篩選（對（對Cy5或或Cy3信號信號進行校正，消除實驗或掃描等各環(huán)節(jié)進行校正，消除實驗或掃描等各環(huán)節(jié)因素對數(shù)據(jù)

17、的影響，同時利用篩選規(guī)因素對數(shù)據(jù)的影響，同時利用篩選規(guī)則對數(shù)據(jù)中的則對數(shù)據(jù)中的“壞點壞點”，“小點小點”，“低信號點低信號點”進行篩選，并作標記）進行篩選，并作標記）基因芯片流程（四）基因芯片流程（四）8. 目的基因或序列的確定目的基因或序列的確定（采用ratio值對差異基因進行判斷，或采用統(tǒng)計方法如線性回歸、主成分分析、調(diào)整P值算法等對差異基因進行統(tǒng)計推斷）9. 生物信息學分析生物信息學分析（如cluster 算法、差異基因的同源性比對，差異基因的相關文獻檢索等）微流控芯片檢測儀基因芯片的閱讀分析系統(tǒng)芯片掃描儀芯片雜交盒三、三、 基因芯片設計步驟基因芯片設計步驟1. 基因芯片設計的一般性原則

18、基因芯片設計主要包括兩個方面: 探針的設計指如何選擇芯片上的探針l 探針在芯片上的布局1. 指如何將探針排布在芯片上。 確定芯片所要檢測的目標對象確定芯片所要檢測的目標對象查詢生物分子數(shù)據(jù)庫查詢生物分子數(shù)據(jù)庫取得相應的取得相應的DNA序列數(shù)據(jù)序列數(shù)據(jù) 序列對比分析序列對比分析找出特征序列，作為芯片設計的參照序列。找出特征序列，作為芯片設計的參照序列。 數(shù)據(jù)庫搜索數(shù)據(jù)庫搜索 得到關于序列突變的信息及其它信息。得到關于序列突變的信息及其它信息。 在進行探針設計和布局時必須考慮以下在進行探針設計和布局時必須考慮以下幾個方面：幾個方面： (1)互補性 (2)敏感性和特異性 (3)容錯性 (4)可靠性

19、(5)可控性 (6)可讀性 基因芯片使用步驟基因芯片使用步驟芯片制作芯片制作把探針固定于載體表面把探針固定于載體表面樣品處理樣品處理目標分子富集目標分子富集分子間的雜交分子間的雜交結(jié)果檢測與數(shù)據(jù)分析結(jié)果檢測與數(shù)據(jù)分析基因芯片的制基因芯片的制作方式作方式原位合成原位合成直接點樣直接點樣原位光蝕刻合成原位光蝕刻合成原位噴印合成原位噴印合成 分子印章法分子印章法針式點樣針式點樣噴墨點樣噴墨點樣光導原位合成法光導原位合成法 原位合成法主要為光引導聚合技術(shù)（Light-directed synthesis），不僅可用于寡核苷酸的合成，也可用于合成寡肽分子。主要步驟為：首先使支持物羥基化，并用光敏保護基團

20、將其保護起來。每次選取適當?shù)谋喂饽ぃ╩ask）使需要聚合的部位透光，其他部位不透光。每次通過控制蔽光膜的圖案（透光與不透光）決定哪些區(qū)域應被活化，以及所用單體的種類和反應次序就可以實現(xiàn)在待定位點合成大量預定序列寡聚體的目的。優(yōu)點是可以用很少的步驟合成及其大量的探針陣列1、原位光蝕刻合成、原位光蝕刻合成 寡聚核苷酸原位光蝕刻合成技術(shù)是由寡聚核苷酸原位光蝕刻合成技術(shù)是由Affymetrix公司開發(fā)的，采用的技術(shù)原理是在合成堿基單體的公司開發(fā)的，采用的技術(shù)原理是在合成堿基單體的5羥基末端連上一個光敏保護基。合成的第一步是利用羥基末端連上一個光敏保護基。合成的第一步是利用光照射使羥基端脫保護，然后一個

21、光照射使羥基端脫保護，然后一個5端保護的核苷酸端保護的核苷酸單體連接上去，這個過程反復進行直至合成完畢。使單體連接上去，這個過程反復進行直至合成完畢。使用多種掩蓋物能以更少的合成步驟生產(chǎn)出高密度的陣用多種掩蓋物能以更少的合成步驟生產(chǎn)出高密度的陣列，在合成循環(huán)中探針數(shù)目呈指數(shù)增長。某一含列，在合成循環(huán)中探針數(shù)目呈指數(shù)增長。某一含n個個核苷酸的寡聚核苷酸，通過核苷酸的寡聚核苷酸，通過4n個化學步驟能合成出個化學步驟能合成出4n個可能結(jié)構(gòu)。例如：一個完整的十核苷酸通過個可能結(jié)構(gòu)。例如：一個完整的十核苷酸通過32個個化學步驟，化學步驟，8個小時可能合成個小時可能合成65,536個探針。個探針。 目前美

22、國目前美國Affymetrix公司已有同時檢測公司已有同時檢測6,500個已知人類基個已知人類基因的因的DNA芯片，并且正在制備含芯片，并且正在制備含500,000-1,000,000個寡核苷酸個寡核苷酸探針的人類基因檢測芯片。該公司每月投入基因芯片研究的經(jīng)探針的人類基因檢測芯片。該公司每月投入基因芯片研究的經(jīng)費約費約100萬美元。該產(chǎn)品不僅可用于基因表達分析和基因診斷萬美元。該產(chǎn)品不僅可用于基因表達分析和基因診斷等，而且在大規(guī)模藥物開發(fā)方面也具有誘人的前景。等，而且在大規(guī)模藥物開發(fā)方面也具有誘人的前景。 目前，用于分子診斷的目前，用于分子診斷的DNA芯片不僅已可用于檢測愛滋病芯片不僅已可用于

23、檢測愛滋病病毒基因還可用于囊性纖維化（病毒基因還可用于囊性纖維化（CF）、乳腺癌、卵巢癌等疾）、乳腺癌、卵巢癌等疾病相關基因的基因診斷。病相關基因的基因診斷。 鑒于光刻設備技術(shù)復雜，只能有專業(yè)化公司生產(chǎn)，加之成鑒于光刻設備技術(shù)復雜，只能有專業(yè)化公司生產(chǎn)，加之成本高及合成效率不高的問題，因此有待進行以下研究：本高及合成效率不高的問題，因此有待進行以下研究：對光對光刻技術(shù)進行改進，提高合成效率；刻技術(shù)進行改進，提高合成效率；開發(fā)新的原位合成技術(shù)，開發(fā)新的原位合成技術(shù)，如噴印合成技術(shù)，該技術(shù)既能進行原位合成又能進行非原位合如噴印合成技術(shù)，該技術(shù)既能進行原位合成又能進行非原位合成。成。2、光導原位合成

24、法、光導原位合成法 是在經(jīng)過處理的載玻片表面鋪上一層連接分子（是在經(jīng)過處理的載玻片表面鋪上一層連接分子（linker），），其羥基上加有光敏保護基團，可用光照除去，用特制的光其羥基上加有光敏保護基團，可用光照除去，用特制的光刻掩膜（刻掩膜（photolithographic mask）保護不需要合成的）保護不需要合成的部位，而暴露合成部位，在光作用下去除羥基上的保護基部位，而暴露合成部位，在光作用下去除羥基上的保護基團，游離羥基，利用化學反應加上第一個核苷酸，所加核團，游離羥基，利用化學反應加上第一個核苷酸，所加核苷酸種類及在芯片上的部位預先設定，所引入的核苷酸帶苷酸種類及在芯片上的部位預先設

25、定，所引入的核苷酸帶有光敏保護基團，以便下一步合成。然后按上述方法在其有光敏保護基團，以便下一步合成。然后按上述方法在其它位點加上另外三種核苷酸完成第一位核苷酸的合成，因它位點加上另外三種核苷酸完成第一位核苷酸的合成，因而而N個核苷酸長的芯片需要個核苷酸長的芯片需要4N個步驟。每一個獨特序列的個步驟。每一個獨特序列的探針稱為一個探針稱為一個“feature”，這樣的芯片便具有，這樣的芯片便具有4N個個“feature”，包含了全部長度為，包含了全部長度為N的核苷酸序列。的核苷酸序列。 這種原位直接合成的方法無須制備處理克隆和這種原位直接合成的方法無須制備處理克隆和PCR產(chǎn)物，產(chǎn)物，但是每輪反應

26、所需設計的光柵則是主要的經(jīng)費消耗。運用但是每輪反應所需設計的光柵則是主要的經(jīng)費消耗。運用這種方法制作的芯片密度可高達這種方法制作的芯片密度可高達106探針探針/平方厘米，即探平方厘米，即探針間隔為針間隔為 510m，但只能制作，但只能制作II型型 DNA芯片。芯片。 3、原位噴印合成、原位噴印合成 芯片原位噴印合成原理與噴墨打印類似，芯片原位噴印合成原理與噴墨打印類似，不過芯片噴印頭和墨盒有多個，墨盒中裝的是不過芯片噴印頭和墨盒有多個，墨盒中裝的是四種堿基等液體而不是碳粉。噴印頭可在整個四種堿基等液體而不是碳粉。噴印頭可在整個芯片上移動并根據(jù)芯片上不同位點探針的序列芯片上移動并根據(jù)芯片上不同位

27、點探針的序列需要將特定的堿基噴印在芯片上特定位置。該需要將特定的堿基噴印在芯片上特定位置。該技術(shù)采用的化學原理與傳統(tǒng)的技術(shù)采用的化學原理與傳統(tǒng)的DNA固相合成一固相合成一致，因此不特殊制備的化學試劑。致，因此不特殊制備的化學試劑。 4、點樣法、點樣法 點樣法是將合成好的探針、點樣法是將合成好的探針、cDNA或基因組或基因組DNA通過特定通過特定的高速點樣機器人直接點在芯片上。點樣分子可以是核酸也可的高速點樣機器人直接點在芯片上。點樣分子可以是核酸也可以是寡核酸。以是寡核酸。 采用人工點樣的方法將寡核苷酸分子點樣于化學處理后的采用人工點樣的方法將寡核苷酸分子點樣于化學處理后的載玻片上，經(jīng)一定的化

28、學方法處理非干燥后，寡核苷酸分子即載玻片上，經(jīng)一定的化學方法處理非干燥后，寡核苷酸分子即固定于載玻片上，制備好的固定于載玻片上，制備好的DNA芯片可置于緩沖液中保存。芯片可置于緩沖液中保存。 用多聚賴氨酸包被固相支待物玻片，經(jīng)過分區(qū)后用計算機控用多聚賴氨酸包被固相支待物玻片，經(jīng)過分區(qū)后用計算機控制的微陣列點樣機按照預先設計順序點上核酸分子，點樣量很制的微陣列點樣機按照預先設計順序點上核酸分子，點樣量很小，約為小，約為5nl。大規(guī)模。大規(guī)模CDNA芯片多采用這種方法，與其寡核苷芯片多采用這種方法，與其寡核苷酸微芯片相比。酸微芯片相比。DNA芯片的潛在優(yōu)越性是具有更強的親和勢和芯片的潛在優(yōu)越性是具

29、有更強的親和勢和特異性雜交，但是需要大量制備，純化，量化，分類特異性雜交，但是需要大量制備，純化，量化，分類PCR產(chǎn)物。產(chǎn)物。 玻璃片基的處理：使玻璃表面獲得羥基、醛基、氨基等活玻璃片基的處理：使玻璃表面獲得羥基、醛基、氨基等活性基團。性基團。點樣針沾取探針溶液。點樣針沾取探針溶液。點樣針把探針點到玻片表面，讓探針末端的化學集團與玻點樣針把探針點到玻片表面，讓探針末端的化學集團與玻片表面的集團形成共價鍵。片表面的集團形成共價鍵。針式點樣針式點樣的優(yōu)缺點的優(yōu)缺點優(yōu)點：成本低，操作簡單，密度高（幾千優(yōu)點：成本低，操作簡單，密度高（幾千-幾十萬點幾十萬點/cm2)， 轉(zhuǎn)移過程中探針溶液損失小。轉(zhuǎn)移過

30、程中探針溶液損失小。缺點：定量準確性、重現(xiàn)性不好缺點：定量準確性、重現(xiàn)性不好5.針式點樣針式點樣 生產(chǎn)商生產(chǎn)商 Bio-Rad 性能介紹性能介紹 分辨率：分辨率：1.25um(x，y軸軸)和和0.25um(Z軸軸) ， 重復性：重復性：3um 球面精確性：球面精確性：l0um。一次制成芯片數(shù)：一次制成芯片數(shù)：126塊芯片塊芯片 每塊玻片點樣量每塊玻片點樣量82,000個點個點2202芯片點樣儀芯片點樣儀 噴墨點樣噴墨點樣的方式類似于噴墨打印機的方式類似于噴墨打印機。將合成用將合成用探針溶探針溶液液放入打印墨盒內(nèi)，由電腦依據(jù)預定的程序在放入打印墨盒內(nèi)，由電腦依據(jù)預定的程序在xyz方向方向自動控制

31、打印噴頭在芯片支持物上移動，并根據(jù)芯片自動控制打印噴頭在芯片支持物上移動，并根據(jù)芯片不同位點探針序列需要將特定的不同位點探針序列需要將特定的探針探針試劑（不足納升）試劑（不足納升）噴印到特定位點。噴印上去的試劑即以固相合成原理噴印到特定位點。噴印上去的試劑即以固相合成原理與該處支持物發(fā)生偶聯(lián)反應。與該處支持物發(fā)生偶聯(lián)反應。6.噴墨點樣噴墨點樣7.分子印章法分子印章法 根據(jù)陣列合成的要求設計并制作表面凹凸不平的分子印章，根據(jù)陣列合成的要求設計并制作表面凹凸不平的分子印章，再按照合成的順序，將寡核苷酸合成試劑涂布在不同的印再按照合成的順序，將寡核苷酸合成試劑涂布在不同的印章上，逐個依次壓印到芯片特

32、定位點進行合成反應。合成章上，逐個依次壓印到芯片特定位點進行合成反應。合成的后續(xù)反應與壓電打印類似。的后續(xù)反應與壓電打印類似。 分子印章法不僅可用于制備原位合成芯片，還可用于分子印章法不僅可用于制備原位合成芯片，還可用于DNA微集陣列的制作。微集陣列的制作。 2.2.基因芯片樣品制備基因芯片樣品制備 1樣品制備。樣品制備。 一般所需一般所需mRNA的量是以一張表達譜芯片需要的量是以一張表達譜芯片需要3g mRNA計算的計算的2 樣本采集過程關鍵點樣本采集過程關鍵點 氰代磷酸二乙酯氰代磷酸二乙酯(DEPC) 離體新鮮組織，切成多個離體新鮮組織，切成多個1cm3小塊，剔除結(jié)締組織和脂肪組織。胃、腸

33、小塊，剔除結(jié)締組織和脂肪組織。胃、腸組織應剪除外膜；肝、腎、脾應剪除門部血管神經(jīng)，腫瘤組織應將周圍組織應剪除外膜；肝、腎、脾應剪除門部血管神經(jīng)，腫瘤組織應將周圍的正常組織切除干凈（正常組織也應將周圍的腫瘤組織切除干凈）。的正常組織切除干凈（正常組織也應將周圍的腫瘤組織切除干凈）。在在RNase-Free 0.9生理鹽水中漂洗樣品，以去除血漬和污物。生理鹽水中漂洗樣品，以去除血漬和污物。 用鋁箔包裹組織，或用用鋁箔包裹組織，或用5ml凍存管裝載組織凍存管裝載組織(但最好統(tǒng)一采用鋁箔但最好統(tǒng)一采用鋁箔)。用。用記號筆在鋁箔或凍存管外表寫明樣品編號，并貼上標簽，迅速投入液氮記號筆在鋁箔或凍存管外表寫

34、明樣品編號，并貼上標簽，迅速投入液氮冷卻。冷卻。填寫樣品登記表，寫明樣品名稱、種類、編號、取樣日期、樣品處理情填寫樣品登記表，寫明樣品名稱、種類、編號、取樣日期、樣品處理情況等將液氮冷卻的組織放入樣品袋（每個樣品袋只保存同樣的組織），況等將液氮冷卻的組織放入樣品袋（每個樣品袋只保存同樣的組織），袋口留一根編號繩，繩上粘一張標簽紙（標簽上注明：樣品名稱、編號、袋口留一根編號繩，繩上粘一張標簽紙（標簽上注明：樣品名稱、編號、日期），迅速轉(zhuǎn)入便攜式液氮罐日期），迅速轉(zhuǎn)入便攜式液氮罐保留保留1-2張取材部位的病理切片。張取材部位的病理切片。v 以上步驟應在冰上進行且不超過以上步驟應在冰上進行且不超過1

35、5分鐘，超過時分鐘，超過時間會導致樣品的間會導致樣品的RNA降解。降解。 v 對腫瘤組織的取材，要求盡可能準確地判定腫瘤對腫瘤組織的取材，要求盡可能準確地判定腫瘤和正常組織，例如對于手術(shù)切除的整個或部分前列和正常組織，例如對于手術(shù)切除的整個或部分前列腺，可能要根據(jù)冰凍切片報告的結(jié)果來判定要進行腺，可能要根據(jù)冰凍切片報告的結(jié)果來判定要進行研究的取材部位。研究的取材部位。 3.3.基因芯片雜交基因芯片雜交 v 待分析基因在與芯片結(jié)合探針雜交之前必需進行分離、擴待分析基因在與芯片結(jié)合探針雜交之前必需進行分離、擴增及標記。根據(jù)樣品來源、基因含量及檢測方法和分析目增及標記。根據(jù)樣品來源、基因含量及檢測方

36、法和分析目的不同，采用的基因分離、擴增及標記方法各異。當然，的不同，采用的基因分離、擴增及標記方法各異。當然，常規(guī)的基因分離、擴增及標記技術(shù)完全可以采用，但操作常規(guī)的基因分離、擴增及標記技術(shù)完全可以采用，但操作繁瑣且費時。繁瑣且費時。v 高度集成的微型樣品處理系統(tǒng)如細胞分離芯片及基因擴增高度集成的微型樣品處理系統(tǒng)如細胞分離芯片及基因擴增芯片等是實現(xiàn)上述目的的有效手段和發(fā)展方向。芯片等是實現(xiàn)上述目的的有效手段和發(fā)展方向。v 為了獲得基因的雜交信號必須對目的基因進行標記，目前為了獲得基因的雜交信號必須對目的基因進行標記，目前采用的最普遍的熒光標記方法與傳統(tǒng)方法如體外轉(zhuǎn)錄、采用的最普遍的熒光標記方法

37、與傳統(tǒng)方法如體外轉(zhuǎn)錄、PCR、逆轉(zhuǎn)錄等原理上并無多大差異，只是采用的熒光素、逆轉(zhuǎn)錄等原理上并無多大差異，只是采用的熒光素種類更多，這可以滿足不同來源樣品的平行分析。種類更多，這可以滿足不同來源樣品的平行分析。v 用計算機控制的高分辨熒光掃描儀可獲得結(jié)合于芯片上目用計算機控制的高分辨熒光掃描儀可獲得結(jié)合于芯片上目的基因的熒光信號，通過計算機處理即可給出目的基因的的基因的熒光信號，通過計算機處理即可給出目的基因的結(jié)構(gòu)或表達信息。結(jié)構(gòu)或表達信息。 v 雜交條件的選擇與研究目的有關，多態(tài)性分析或者基因測雜交條件的選擇與研究目的有關，多態(tài)性分析或者基因測序時，每個核苷酸或突變位點都必須檢測出來。序時，每

38、個核苷酸或突變位點都必須檢測出來。v 通常設計出一套四種寡聚核苷酸，在靶序列上跨越每個位通常設計出一套四種寡聚核苷酸，在靶序列上跨越每個位點，只在中央位點堿基有所不同，根據(jù)每套探針在某一特點，只在中央位點堿基有所不同，根據(jù)每套探針在某一特點位點的雜交嚴謹程度，即可測定出該堿基的種類。點位點的雜交嚴謹程度，即可測定出該堿基的種類。v 如果芯片僅用于檢測基因表達，只需設計出針對基因中的如果芯片僅用于檢測基因表達，只需設計出針對基因中的特定區(qū)域的幾套寡聚核苷酸即可。特定區(qū)域的幾套寡聚核苷酸即可。v 表達檢測需要長的雜交時間，更高的嚴謹性，更高的樣品表達檢測需要長的雜交時間，更高的嚴謹性，更高的樣品濃

39、度和低溫度，這有利于增加檢測的特異性和低拷貝基因濃度和低溫度，這有利于增加檢測的特異性和低拷貝基因檢測的靈敏度。突變檢測，要鑒別出單堿基錯配，需要更檢測的靈敏度。突變檢測，要鑒別出單堿基錯配，需要更高的雜交嚴謹性和更短的時間。高的雜交嚴謹性和更短的時間。4.4.基因芯片檢測原理基因芯片檢測原理 雜交信號的檢測是雜交信號的檢測是DNA芯片技術(shù)中的重要組成部分。芯片技術(shù)中的重要組成部分。由于由于DNA芯片本身的結(jié)構(gòu)及性質(zhì)，需要確定雜交信號芯片本身的結(jié)構(gòu)及性質(zhì)，需要確定雜交信號在芯片上的位置，尤其是大規(guī)模在芯片上的位置，尤其是大規(guī)模DNA芯片由于其面積芯片由于其面積小，密度大，點樣量很少，所以小，密

40、度大，點樣量很少，所以雜交信號較弱，需要雜交信號較弱，需要使用光電倍增管或冷卻的電荷偶連照相機使用光電倍增管或冷卻的電荷偶連照相機(charged-coupled device camera，CCD)攝像機攝像機等弱光信號探測等弱光信號探測裝置。裝置。此外，大多數(shù)此外，大多數(shù)DNA芯片雜交信號譜型除了分布位點以芯片雜交信號譜型除了分布位點以外還需要確定每一點上的信號強度，以確定是完全雜外還需要確定每一點上的信號強度，以確定是完全雜交還是不完全雜交，因而探測方法的靈敏度及線性響交還是不完全雜交，因而探測方法的靈敏度及線性響應也是非常重要的。應也是非常重要的。雜交信號探測系統(tǒng)主要包括雜交信號探測系

41、統(tǒng)主要包括雜交信號產(chǎn)生、信號收集雜交信號產(chǎn)生、信號收集及傳輸和信號處理及成像及傳輸和信號處理及成像三個部分組成。三個部分組成。1熒光標記雜交信號的檢測方法熒光標記雜交信號的檢測方法2生物素標記方法中的雜交信號探測生物素標記方法中的雜交信號探測1熒光標記雜交信號的檢測方法熒光標記雜交信號的檢測方法（1）激光掃描熒光顯微鏡）激光掃描熒光顯微鏡 探測裝置比較典型。方法是將雜交后的芯片經(jīng)處理后固定探測裝置比較典型。方法是將雜交后的芯片經(jīng)處理后固定在計算機控制的二維傳動平臺上，并將一物鏡置于其上方，在計算機控制的二維傳動平臺上，并將一物鏡置于其上方，由氬離子激光器產(chǎn)生激發(fā)光經(jīng)濾波后通過物鏡聚焦到芯片表由

42、氬離子激光器產(chǎn)生激發(fā)光經(jīng)濾波后通過物鏡聚焦到芯片表面，激發(fā)熒光標記物產(chǎn)生熒光，光斑半徑約為面，激發(fā)熒光標記物產(chǎn)生熒光，光斑半徑約為510m。同。同時通過同一物鏡收集熒光信號經(jīng)另一濾波片濾波后，由冷卻時通過同一物鏡收集熒光信號經(jīng)另一濾波片濾波后，由冷卻的光電倍增管探測，經(jīng)模數(shù)轉(zhuǎn)換板轉(zhuǎn)換為數(shù)字信號。通過計的光電倍增管探測，經(jīng)模數(shù)轉(zhuǎn)換板轉(zhuǎn)換為數(shù)字信號。通過計算機控制傳動平臺算機控制傳動平臺XY方向上步進平移，方向上步進平移，DNA芯片被逐點芯片被逐點照射，所采集熒光信號構(gòu)成雜交信號譜型，送計算機分析處照射，所采集熒光信號構(gòu)成雜交信號譜型，送計算機分析處理，最后形成理，最后形成20m象素的圖像。這種方

43、法分辨率高、圖像質(zhì)象素的圖像。這種方法分辨率高、圖像質(zhì)量較好，適用于各種主要類型的量較好，適用于各種主要類型的DNA芯片及大規(guī)模芯片及大規(guī)模DNA芯片芯片雜交信號檢測，廣泛應用于基因表達、基因診斷等方面研究。雜交信號檢測，廣泛應用于基因表達、基因診斷等方面研究。 (2)激光掃描共焦顯微鏡激光掃描共焦顯微鏡 激光掃描共焦顯微鏡與激光掃描熒光顯微鏡結(jié)構(gòu)非常相似，激光掃描共焦顯微鏡與激光掃描熒光顯微鏡結(jié)構(gòu)非常相似，但是由于采用了共焦技術(shù)因而更具優(yōu)越性。這種方法可以但是由于采用了共焦技術(shù)因而更具優(yōu)越性。這種方法可以在熒光標記分子與在熒光標記分子與DNA芯片雜交的同時進行雜交信號的探芯片雜交的同時進行雜

44、交信號的探測，而無須清洗掉未雜交分子，從而簡化了操作步驟大大測，而無須清洗掉未雜交分子，從而簡化了操作步驟大大提高了工作效率。通過計算機控制激光束或樣品池的移動，提高了工作效率。通過計算機控制激光束或樣品池的移動，便可實現(xiàn)對芯片的二維掃描，移動步長與芯片上寡核苷酸便可實現(xiàn)對芯片的二維掃描，移動步長與芯片上寡核苷酸的間距匹配，在幾分鐘至幾十分鐘內(nèi)即可獲得熒光標記雜的間距匹配，在幾分鐘至幾十分鐘內(nèi)即可獲得熒光標記雜交信號圖譜。其特點是靈敏度和分辨率較高，掃描時間長，交信號圖譜。其特點是靈敏度和分辨率較高，掃描時間長，比較適合研究用?，F(xiàn)在比較適合研究用?，F(xiàn)在 Affymetrix公司已推出商業(yè)化樣公

45、司已推出商業(yè)化樣機，整套系統(tǒng)約機，整套系統(tǒng)約 12萬美元。萬美元。（3）采用了）采用了CCD相機的熒光顯微鏡相機的熒光顯微鏡 這種探測裝置與以上的掃描方法都是基于熒光顯微這種探測裝置與以上的掃描方法都是基于熒光顯微鏡，但是以鏡，但是以CCD相機作為信號接收器而不是光電倍相機作為信號接收器而不是光電倍增管，因而無須掃描傳動平臺。由于采用了增管，因而無須掃描傳動平臺。由于采用了CCD相相機，因而大大提高了獲取熒光圖像的速度，曝光時機，因而大大提高了獲取熒光圖像的速度，曝光時間可縮短至零點幾秒至十幾秒。其特點是掃描時間間可縮短至零點幾秒至十幾秒。其特點是掃描時間短，靈敏度和分辨率較低，比較適合臨床診

46、斷用短，靈敏度和分辨率較低，比較適合臨床診斷用 （4）光纖傳感器）光纖傳感器 將將 DNA芯片直接做在光纖維束的切面上（遠端），光纖芯片直接做在光纖維束的切面上（遠端），光纖維束的另一端（近端）經(jīng)特制的耦合裝置耦合到熒光顯微鏡維束的另一端（近端）經(jīng)特制的耦合裝置耦合到熒光顯微鏡中。光纖維束由中。光纖維束由7根單模光纖組成。每根光纖的直徑為根單模光纖組成。每根光纖的直徑為200m，兩端均經(jīng)化學方法拋光清潔?；瘜W方法合成的寡核苷酸探針兩端均經(jīng)化學方法拋光清潔?；瘜W方法合成的寡核苷酸探針共價結(jié)合于每根光纖的遠端組成寡核苷酸陣列。將光纖遠端共價結(jié)合于每根光纖的遠端組成寡核苷酸陣列。將光纖遠端浸入到熒光

47、標記的靶分子溶液中與靶分子雜交，通過光纖維浸入到熒光標記的靶分子溶液中與靶分子雜交，通過光纖維束傳導來自熒光顯微鏡的激光（束傳導來自熒光顯微鏡的激光（490urn），激發(fā)熒光標記物），激發(fā)熒光標記物產(chǎn)生熒光，仍用光纖維束傳導熒光信號返回到熒光顯微鏡，產(chǎn)生熒光，仍用光纖維束傳導熒光信號返回到熒光顯微鏡，由由CCD相機接收。相機接收。 這種方法快速、便捷，可實時檢測這種方法快速、便捷，可實時檢測DNA微陣列雜交情況微陣列雜交情況而且具有較高的靈敏度，但由于光纖維束所含光纖數(shù)目有限，而且具有較高的靈敏度，但由于光纖維束所含光纖數(shù)目有限，因而不便于制備大規(guī)模因而不便于制備大規(guī)模DNA芯片，有一定的應用

48、局限性。芯片，有一定的應用局限性。 2生物素標記方法中的雜交信號探測生物素標記方法中的雜交信號探測 以生物素（以生物素（biotin）標記樣品的方法由來已久，通常都）標記樣品的方法由來已久，通常都要聯(lián)合使用其它大分子與抗生物素的結(jié)合物（如結(jié)合化學發(fā)要聯(lián)合使用其它大分子與抗生物素的結(jié)合物（如結(jié)合化學發(fā)光底物酶、熒光素等），再利用所結(jié)合大分子的特殊性質(zhì)得光底物酶、熒光素等），再利用所結(jié)合大分子的特殊性質(zhì)得到最初的雜交信號，由于所選用的與抗生物素結(jié)合的分子種到最初的雜交信號，由于所選用的與抗生物素結(jié)合的分子種類繁多，因而檢測方法也更趨多樣化。特別是如果采用尼龍類繁多，因而檢測方法也更趨多樣化。特別是

49、如果采用尼龍膜作為固相支持物，直接以熒光標記的探針用于膜作為固相支持物，直接以熒光標記的探針用于DNA芯片雜芯片雜交將受到很大的限制，因為在尼龍膜上熒光標記信號信噪比交將受到很大的限制，因為在尼龍膜上熒光標記信號信噪比較低。因而使用尼龍膜作為固相支持物的這些研究者大多是較低。因而使用尼龍膜作為固相支持物的這些研究者大多是采用生物素標記的。采用生物素標記的。 目前應用較多的是美國目前應用較多的是美國General Scanning公司開發(fā)的基公司開發(fā)的基因芯片專用檢測系統(tǒng)因芯片專用檢測系統(tǒng)(ScanArray 3000)，采用激光共聚焦掃，采用激光共聚焦掃描原理進行熒光信號采集，由計算機處理熒光

50、信號，并對每描原理進行熒光信號采集，由計算機處理熒光信號，并對每個點的熒光強度數(shù)字化后進行分析。近期又開發(fā)出了個點的熒光強度數(shù)字化后進行分析。近期又開發(fā)出了ScanArray 5000，其掃描精度和功能有較大的提高。，其掃描精度和功能有較大的提高。5.5.結(jié)果的分析結(jié)果的分析 樣品在被測定前，首先要經(jīng)過消化，使待測組織細胞中的樣品在被測定前，首先要經(jīng)過消化，使待測組織細胞中的DNA或或RNA釋放出來，在經(jīng)過適當?shù)臄U增后，以熒光標釋放出來，在經(jīng)過適當?shù)臄U增后，以熒光標記物標記，放入基因芯片自動孵育裝置中，由其自動控制記物標記，放入基因芯片自動孵育裝置中，由其自動控制反應的時間、溫度以及緩沖液的配

51、比等反應條件，進行雜反應的時間、溫度以及緩沖液的配比等反應條件，進行雜交。交。 雜交完成后，要對基因芯片進行雜交完成后，要對基因芯片進行“讀片讀片”，即應用激光共，即應用激光共聚焦熒光掃描顯微鏡，對基因芯片表面的每個位點進行檢聚焦熒光掃描顯微鏡，對基因芯片表面的每個位點進行檢測。測。 檢測結(jié)合到芯片表面位點的樣品片斷的熒光標記，而待測檢測結(jié)合到芯片表面位點的樣品片斷的熒光標記，而待測樣品中未與芯片上探針結(jié)合的熒光標記物，則懸浮于溶液樣品中未與芯片上探針結(jié)合的熒光標記物，則懸浮于溶液中，由于不在聚焦平面上，因而不被檢測。中，由于不在聚焦平面上，因而不被檢測。 樣品與探針的錯配是影響雜交反應結(jié)果的重要因素，但由樣品與探針的錯配是影響雜交反應結(jié)果的重要因素，但由于樣品與芯片上的探針正確配對時產(chǎn)生的熒光信號要比錯于樣品與芯片上的探針正確配對時產(chǎn)生的熒光信號要比錯配時強的多，因此，通過對信號強度的分析，就可以區(qū)分配時強的多，因此，通過對信號強度的分析，就可以區(qū)分正確與錯誤的配對。正確與錯誤的配對。 為了使結(jié)果的檢驗更加簡便和快速，為了使結(jié)果的檢驗更加簡便和快速，Affymet