殼聚糖TGF-β1納米質(zhì)粒構(gòu)建及對(duì)卵清蛋白腸道過(guò)敏小鼠免疫調(diào)節(jié)效果

1、殼聚糖tgf-p1納米質(zhì)粒構(gòu)建及對(duì)卵清蛋白腸道過(guò)敏小鼠免疫 調(diào)節(jié)效果李斐.金星明沈曉明（i海交通人學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬新華灰院.上海兒承醫(yī)學(xué)中心發(fā)仔行為兒科.上祥市環(huán)境與兒蛍健康軌點(diǎn)實(shí)驗(yàn)來(lái).i.海200092）m>:探索體內(nèi)給ptgf0質(zhì)粒是否右利誘導(dǎo)過(guò)敏小風(fēng)腸逍tgf卩衣達(dá)；同時(shí).分別采川質(zhì)料常規(guī)肌肉給藥和殼聚糖 納米ii服給藥途輕比較ova a敏小駄腸道過(guò)敏炎癥的緩解狀況.r解tgf卩質(zhì)粒經(jīng)売聚糖微粒ii脈給藥叢否優(yōu)戀規(guī) 肌肉給藥.更利于食物過(guò)敏治療.構(gòu)建pliudced. l/tgf-pl fl核農(nóng)達(dá)敢組質(zhì)粒并制備先聚w-dna納米額粒.balb/ c小wova腸逍過(guò)敏模巾.并馳機(jī)將氏分為

2、口服売聚wi/|）iwt4. i/t（；rpl質(zhì)粒（chii）fll ii服pbud（ l/t（；f-pl裸 質(zhì)粒對(duì)w<nak）m.肌肉注射 pbudcel. i/tgf-卩i 裸質(zhì)粒對(duì)jffi（n«k im>組、ii服 pbud（'e4. i/tgf0 空質(zhì)粒對(duì)照（pia）*1l 激發(fā)（cha）m.生理鹽水對(duì)m（ns）ffi.以實(shí)時(shí)熒光定址rt pcr測(cè)定小腸組織中tgf-pl、ifn 丫、ii" mrna衷達(dá).e1.isa法測(cè)定小以小腸黏液中總ga、ova w畀性】ga、外ml ku w（）va待舁性lge含址細(xì)織熒光法測(cè)定小腸剩余細(xì)織 胺律ht六組

3、小取中.ns組小恥小腸組織tgf卩i和len-y mrna 達(dá)、小腸剩余細(xì)織胺、小腸納液屮& iga. ova舒 并性iga含址最高（pv0.0i）小腸組織ii" mrna、外周血清ova待并性ige含扯嚴(yán)ft（p<o.oi）i mik im、（'hi細(xì)小 鼠小腸紐織tgfpl和ifn y mrn a衣達(dá)、小腸剩余組織胺、小腸黏液中總iga、ovaiga a ht較cha、n賊、pla三組升 m（p<0.01）, ft chi 組較 nak-imfflrt（p<o.ol）j nak im、chi 組小亂小腸組織 iim mrna * 達(dá)、外 w ku

4、 ova 特異性 ige 含ht較 cha、nak, pla 三組降低（p<0.01>, il chi <11 較 n；ik im 組低（p<0.01） pbudced. 1/t（；f-fil 質(zhì)粒經(jīng)卅規(guī)肌肉或殼聚糖納米微料ii服形式給藥.均町促進(jìn)過(guò)敏小佩腸逍tgf-卩i衣達(dá).緩解腸逍炎那il以殼聚糖ii服給的途 徑優(yōu)于肌肉給藥途輕.進(jìn)行殼聚糖為載體的基因轉(zhuǎn)運(yùn)研究町創(chuàng)提高?。蹌?chuàng)治療食物過(guò)敏的效果。關(guān)鍵詞：僅物過(guò)敏；殼聚糖；轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子ph治療；質(zhì)粒中圖分類號(hào)：r392文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：a文章編號(hào)：1001-2478（2007）06 （m70 07近年研究認(rèn)為，抑制性細(xì)胞因子

5、tgf-卩功能 不足是導(dǎo)致腸道出現(xiàn)食物過(guò)敏的重要原因，外源性 提高腸道tgf-p水平可能是緩無(wú)食物過(guò)敏癥狀的 治療策略之一小2。但是.目前對(duì)tgf-p的研究多 財(cái)限于體外細(xì)胞學(xué)水平.缺少其治療食物過(guò)敏的體 內(nèi)研究證據(jù).且常用的單純tgf-卩口服給藥方式 尚存往利用率低.過(guò)敏療效不穩(wěn)定等弊端山7。w 此.本研究中.我們?cè)噲D利用質(zhì)?；蚍€(wěn)定表達(dá)的 特點(diǎn)，探索在體給f tgf-p質(zhì)粒是否有利于誘導(dǎo) 過(guò)敏小鼠腸道tgf-p表達(dá)；同時(shí)，分別采用質(zhì)粒 常規(guī)肌肉給藥途徑和殼聚糖納米口服給藥途徑，比 較ova過(guò)敏小鼠腸道過(guò)敏炎癥的緩解狀況，了解收稿日期：2007 08-10基金項(xiàng)目：i：海幣賈點(diǎn)資助ll（o4

6、dz59o4, o6dz22o24）, |：海市 兒科亞點(diǎn)學(xué)科資助頊11（ to2o4 ）； | ：悔i|j氏話ir點(diǎn)*7-科資助項(xiàng)11 （05ir 002）資助項(xiàng) h作者簡(jiǎn)介：乍吏（1976 ）.女w慶人，博1：拆主嘍從節(jié)兒訛直 物過(guò)壇研立.e-mail： lifei586l_cn通訊作者：金e-mail： zhujing7）t（；f-卩質(zhì)粒經(jīng)殼聚糖微粒ii服給藥址否優(yōu)*常規(guī) 肌肉給藥.更利于食物過(guò)敏治療。1材料與方法1.1 質(zhì)粒和探針 pcdna3. t'vtgf-pi質(zhì)粒 （含小鼠全長(zhǎng) tgf-p 1 cdna） ill美國(guó) case western reserve univer

7、sity 江山博 i：惠贈(zèng)? pbudced. 1 真 核表達(dá)質(zhì)粒購(gòu)自invivogen公訶。jm109和dh5a 大腸桿菌感受態(tài)細(xì)菌為本室保存制備。質(zhì)粒轉(zhuǎn)化和 提取按照常規(guī)進(jìn)行。1.2真核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建和鑒定 ？t先以hind iii、bamh 1限制性內(nèi)切酶分別對(duì)pcdna3. 1< + ,/ tgf-p 1和pbudced. 1質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切，膠冋收 大小目的片斷，從而獲得全氏小鼠tgf-pl cdna 和相應(yīng)的pbudce4. 1載體骨架；將人tgf-pl cdna亞克隆進(jìn) pbudce 4. 1,構(gòu)建 pbudce4. 1/ tgfpi真核表達(dá)重組質(zhì)粒。構(gòu)建的質(zhì)粒均進(jìn)行酶 切鑒

8、定和基因測(cè)序與genbank序列對(duì)，并將重組 pbudce4. 1/tgf-pl質(zhì)粒轉(zhuǎn)染cos-7細(xì)胞，采用擴(kuò)塔mw用列（5'3j210285233常規(guī)rt-pcr法和western blot法檢驗(yàn)tgf-pl在 貞核細(xì)胞內(nèi)的mrna利轉(zhuǎn)染細(xì)胞培養(yǎng)上清中蛋門 質(zhì)表達(dá)0（設(shè)空細(xì)胞、空pbudced. 1質(zhì)粒對(duì)照、 pbudced. 1/tgf-pl 質(zhì)?？祝?，rt-pcr 引物設(shè)計(jì) （表1）, western blot時(shí)采用甲諄氯仿法常規(guī)捕提 上清蛋白.變性后sds-page電泳。轉(zhuǎn)膜、封閉 后加兔抗人tgfl多克隆抗體（500 santa, usa）,室溫 2h,二抗（羊抗兔 hrp-

9、igg, ：500 kplusa）孵育1 h后，dab顯色.攝片。13殼聚糖dna納米顆粒的制備7】將一定量的 殼聚糖用醋酸溶解過(guò)夜.待完全溶解后用na（）h 調(diào)ph至5. 7,加無(wú)菌去離子水定容至終濃度為0. 02%,再以0.122 pm的無(wú)菌微孔濾器過(guò)濾除菌，.4 c保存。用45 mmol/l的na2s（）4配制上述質(zhì)粒 dna溶液，濃度為200 mg/ml,先分別將dna溶 液和殼聚糖溶液55 c水浴20 min,然后迅速取等 體積的兩種溶液混合，使dna終質(zhì)量濃度為100 隅/ml,就漩渦振蕩器上（2 500xg）混懸30 s,室溫 放置30 min,成為殼聚wf/pbudce41/t

10、gf-pl顆粒 復(fù)合物。相差顯微鏡下觀察微粒狀態(tài)。經(jīng)檢測(cè)，該 方法制備的納米微粒的dna包裹率在95%以上， 微粒的平均直徑為200 nm.14動(dòng)物和分組中國(guó)科學(xué)院上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心 提供的balb/c小鼠，傳代后以第三代雌鼠（6周 齡）作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象。取balb/c小鼠60只，隨機(jī) 均分為殼聚糖pbudce 4. l/tgf-pi質(zhì)?？诜?（chit）組、pbudce 4. 1/tgf-pi裸質(zhì)粒肌肉注射 （nak-im）組、pbudce 4. 1/tgf-pl 裸質(zhì)?？诜?duì) 照（nak）組、pbudce 4. 1空質(zhì)?？诜?duì)照（pla） 組、生理鹽水對(duì)照（ns）組，激發(fā)對(duì)照（cha）組，每 組

11、10只。采用課題組常規(guī)使用并已成功驗(yàn)證的食 物過(guò)敏小鼠模型（預(yù)實(shí)驗(yàn)時(shí)，于建模前隨機(jī)選取 同批小鼠10只，對(duì)本研究涉及的各項(xiàng)待測(cè)指標(biāo)均 進(jìn)行基線檢測(cè)，提示數(shù)據(jù)沒(méi)有顯著差異、），致敏和 激發(fā)過(guò)程如下：第1天使用10 mg ova （sigma, usa）及1 mg a1（）h）3的無(wú)菌生理鹽水溶液（ns） 0. 5 ml腹腔注射行基礎(chǔ)致敏；第15天使用含有10 mg ova的無(wú)菌生理鹽水0. 5 ml腹腔注射行強(qiáng)化致 敏；第30、35、40、45天以ova生理鹽水溶液0.5 mkova濃度為1 mg/ml）行灌胃激發(fā)。（ns組小 鼠分別以不含（）va的等量生理鹽水腹腔致繳和灌 胃激發(fā)）。于強(qiáng)化致敏

12、和激發(fā)同時(shí)對(duì)chit組、nak 組、pla組小鼠分別以殼聚糖/pbudce 4.1/tgf-pi 亜組質(zhì)粒微粒、pbudced. 1/tgf-pl裸質(zhì)粒、 pbudce41空質(zhì)?？谀摴辔?0.5 ml /只（質(zhì)粒含 吊50應(yīng)）。對(duì)cha組、n$組小鼠以等鈦工理鹽水 ii服灌胃;nak-im組小61以脛前肌肉注射等f(wàn)t pbudce4. 1/tgf-pl裸質(zhì)粒。末次激發(fā)后1 h斷頸 處死小鼠.留取小腸和外周血標(biāo)本。1.5 小鼠小腸中tgf-pi% ifny、il-4 mrna表達(dá) 測(cè)定 采用實(shí)時(shí)熒光定晟rt-pcr法。用roche lightcycler rna master sybr gree

13、n （ kit for one-step rt-pcr）試劑盒.在 roche lightcycler instrument上擴(kuò)增。方法參考文獻(xiàn)10。內(nèi)參照菇 因?yàn)閜-actin,各引物序列（表1）。擴(kuò)增條件（表 2）；熒光信號(hào)區(qū)域值循環(huán)圈數(shù)（cycle threshed, ct）j|j lightcyler 軟件 3 5 版二次衍生法（second derivative methods, sdm）確定。設(shè)定陰性對(duì)照, 各樣本進(jìn)行2次重復(fù)實(shí)驗(yàn)。先將rna濃度稀釋為 40 ng/ml,按照2倍梯度即】：2、】：4、1：8、1：16 稀釋成 200 ng/pl. 100 ng/pl、50 ng/p

14、l 25 ng/ 門，用上述樣本模板分別擴(kuò)增忖標(biāo)基因，分析產(chǎn)物 溶解曲線提示冃的基因無(wú)引物二聚體出現(xiàn)，各產(chǎn)物 溶解曲線均呈單峰，說(shuō)明為單一片段擴(kuò)增。經(jīng)過(guò) 2%瓊脂糖膠電泳分析，鑒定產(chǎn)物是否符合設(shè)計(jì)的片 段長(zhǎng)度。利用ughtcycler軟件得到斜率（slope）.相 關(guān)系數(shù)（廠）和基因mrna擴(kuò)增的標(biāo)準(zhǔn)曲線：y/,r （：'花從火=從岡x x花+花從貝,y/,r ct內(nèi)筆曲城火=血"內(nèi)*鐘閃xx內(nèi)鈿從閃+%令煞腫。中，y為各 基因擴(kuò)增的ct值，sx為參加擴(kuò)增的該基因mr- na的拷貝值，得公式1和公式2。將得到的耙基因 mrna 值（mrna 花雄內(nèi)）以 p-actin mrn

15、a 值（mr - na內(nèi)鈿網(wǎng)）進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化（公式1、公式2）,以log mrna“岡/mrna內(nèi)參鹽從火比值（/"<）作為參數(shù)，將對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)紐各樣本進(jìn)行比較。衰1熒光定>pcr檢測(cè)時(shí)所需各基因引輸jiw擴(kuò)塔長(zhǎng)皮（bp>3 an inl：游卜游t（；f 3i1游卜游9fifn y卜謝l.»ii.4卜滸5* gtc ccg gcc agc cag gtc ca（； 3'5 * cct a ag（ ；cc a afcgtc； a a a ag a 1（ ； 3'5* （xv cig gat act a ac tat t（；c 3'5

16、9; gca （；a gc（； cm' aat cat （；tt 3'5，ggc tgt ttc tgg c ix； tta ct（； c3*3, |ta r；r r（;t t（;（« t（；a r（x； 3r5* tag 1tg t" icc tgc tct t 3'5* gtc itt ca； tga tgt gga c 3'表2llightcyler實(shí)時(shí)熒光定 pcr擴(kuò)増條件aim變性退火延伸ii i fill汩度變化淋發(fā)淋度變化淚歡汨度變化淚發(fā)沿皮堂化(c)w華（c/s）(c)(s)華（c/h）(c)(s)c/s)(c)（小華（c/s

17、）卩 ad in941202()94302()6()3()2()72i2210t(；epl9112020943()2()613()2072 '202101en y94)202()jm3()2063302072202機(jī)）il 1!m12020943()20593()20722()210公式2：mrnaw熱從w = 10(43226 0005 0004 0003 0002 0001 000圖 1 pcdna3.j< + ,/tgf-pi 和 pbudce4 1/tgf-pi 舊切電泳圖 i. dna marker； 2. pbud('e4. l/tgf pl hind iii

18、 和 lianm h i 雙簡(jiǎn)切；3. pbudced. 1 空質(zhì)粒；4. pcl)na3. i ( + )/t(；e pl hind iii 和 i jam h i 雙酶切公式16 小觸小腸黏液中總iga、ova特異性iga （ova-slga）測(cè)定 采川elisa法.操作步驟參羽 文獻(xiàn)8。總仗人測(cè)定時(shí)，一抗采用大歐抗小wiga 尬克降抗體（bd pharmingen usa）包板.二抗為辣 根過(guò)値化w（hrp）標(biāo)記的大熙抗小訊iga（s（）uthern- biotech associates inc. usa）。（）va 持 r 性 iga 測(cè) 定時(shí).ova的包板濃度為1卩g/ml樣品加樣

19、濃度 為原濃度.二抗為hrp標(biāo)記的大駅抗小fel!gao經(jīng) tbm顯色、終止反應(yīng)拆全門動(dòng)阿標(biāo)儀在450 nm波 氏下測(cè)定n （ft.以各門的d值做統(tǒng)計(jì)分析。1.7 小鼠血清中ovaslge測(cè)定 采川el1sa 法.操作步驟參考文獻(xiàn)1叮.以100 m1 ova/孔（1（） 網(wǎng)/ml）但板.血淸樣品加樣濃度為原濃度.結(jié)介反 應(yīng)時(shí)hrp標(biāo)記的大61抗小鼠ige為 二抗（southern biotechnology ass（x?iates, usa）,稀釋濃度為 1 ：1 00（）,址麻經(jīng)tbm 44色、終止.于全門動(dòng)齣標(biāo)儀 150 rnn波k f測(cè)定dffi做統(tǒng)計(jì)分析。1.8 小腸組織中剩余組織胺含

20、量測(cè)定取小啟 treitz刼帶以下5 cm小腸,小腸中組織胺含議測(cè) 定采用組織熒光法,參照文獻(xiàn)12,過(guò)敏小鼠小腸 組織中組織胺含董越大,提示腸道中肥大細(xì)胞組織 胺的釋放越多，對(duì)腸道損傷越大。1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用sas&0統(tǒng)計(jì)分析軟件 包。各組樣本間數(shù)據(jù)用levene法進(jìn)行方差齊性檢 驗(yàn)。若方差齊同，實(shí)驗(yàn)結(jié)果以均數(shù)士標(biāo)準(zhǔn)差（t±s） 表示，進(jìn)一步采用單因素方差分析。如果各組均數(shù) 間差別有顯著性，用student-newman-keuls法（q 檢驗(yàn)）在分組均值之間作兩兩成對(duì)比較。以p< 0.05判定有無(wú)顯著性差別。進(jìn)行熒光定量rt-pcr 的基因mrna表達(dá)分析時(shí)，l

21、evene檢驗(yàn)提示各組 肚 w mrna hi 對(duì) 農(nóng) 達(dá) lit （ mrnaryiw/mr- na內(nèi)鈿叩ratio）方總不齊.經(jīng)對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換jti （ log ratio）提示方總齊同.故町按照i：述參數(shù)檢驗(yàn)方法 進(jìn)行統(tǒng)訃學(xué)分析。2結(jié)果2.1盍組質(zhì)粒酶切與鑒定 以hind iii和bamh i 雙側(cè)切pci）na3 1'' 7t（；f-pi w./k 5.4 kb 和 1.6 kb 雙條??；亞纟|質(zhì)pbudcei. 1/t（；f pl 質(zhì) 粒爪4. 6 kb和1.6 kl）雙條帯，空質(zhì)粒pbudce4. 1 /j< 4.6 kb 單條帶.uuw tgf-pl atwll被

22、敢組到 plkidce41/屮（圖1）。將酶切片段進(jìn)行雙向測(cè)庁 （takara公訶）其結(jié)jr打genivank注求:丿匕列 致.無(wú)突變。采川rt pcr分析cos 7細(xì)胞內(nèi) tgf-位mrna衣達(dá)，同時(shí)采川western biot檢測(cè) cos-7轉(zhuǎn)染細(xì)胞培屛iji7 t（；f-pl蛋門質(zhì)衣達(dá).發(fā) 現(xiàn)只仃pbudcel. l/t（；f-pl轉(zhuǎn)染紐細(xì)胞仃tgf pl mrna表達(dá)，其培養(yǎng)l-jihz tgf-pl蛋門衣達(dá)， 空細(xì)胞、空質(zhì)粒紐無(wú)任何條為（圖2、圖3）.捉示 pbudce4 1/tgf-01質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后能在cos 7亢孩 細(xì)胞屮表達(dá)tgf卩1 mrna,并右效翻譯獲得賀門 產(chǎn)物。 300

23、200圖 2 pbudce4. 1/tgf-pl 轉(zhuǎn)染 cos-7 細(xì)胞的 rt-pcr 結(jié)果i. marker; 2. tgf ph 3. empty cells 對(duì)照九$ 4. pliudcel. 1 對(duì)照組圖3 pbudce4. 1/tgf-pl轉(zhuǎn)染cos-7細(xì)胞培養(yǎng)上清的westernmot結(jié)果i. protein molecular weight marker； 2. empty cells x4 !m tl; 3. pbudcel. i 對(duì)曲flh i. tgepi2.2 小鼠小腸中tgf-pk ifny、il-4 mrna表達(dá)pcr擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳.紫外線打 描分析結(jié)

24、ha： il-4產(chǎn)物長(zhǎng)度為359 bp,其余待測(cè) 肚岡產(chǎn)物長(zhǎng)度在200300bp之間（圖4 ）。利用lightcycler軟件得到斜率（slope）、相關(guān)系數(shù)（廠）和 擴(kuò)增效率（e=10”）、cf值范圍（表3）。根據(jù) 公式1、公式2比較各組待測(cè)卑因，提示nak、 pla. cha 三組小鼠小腸 tgf-pl. ifn-y. il-4 mrna表達(dá)均無(wú)顯苦件差界（p>0 05）. tgf- pl. ifn-y mrna 農(nóng)達(dá)較 ns 組降低（pv0.01）, il-4 mrna 表達(dá)較 ns 組升高（pv0.01）： nak-im 組、chit組小鼠小腸tgf-pl. ifn-y mrna

25、表達(dá) 較nak、pla、cha三組升高（pv0.01）.但仍低于 ns 組（p<0. 01）、且 chit 組高于 nak-im 組（pv 0.01）； nak-im 組、chit 組小鼠小腸 il-4 mrna 衣達(dá)較nak、pla、cha三組降低（p<0.01）,且 chit組低于nak-im組（pv0. 01）,但商于ns組 （pv0.01x表 4）。*3各基因標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)參數(shù)擴(kuò)斜率w.相關(guān)系數(shù)擴(kuò)堀效華c/frtfelhp actin-3. 3711.7()0. 991.98i2 29t<；epl3.4()& 35（） 991.97627ien y-3.45&

26、amp; 30-1.0()1.914-27ii. d-3. 0013. 16-0. <)92.07829bp cha pla nak nak-iv chi ns13-actin300200ll：n 十300200bp cha pla nak nak-iv chi ns300200圖4各小腸組織待測(cè)基因rt-pcr產(chǎn)物電泳簽定圖2.3小鼠小腸黏液總iga、ova-siga含 測(cè)定 小鼠小腸黏液總iga、ova-siga含量.提示六組 中，ns組小鼠小腸黏液總iga、ova-siga含量 最高（p<0.01）; nak、pla、cha三組小鼠小腸黏 液總iga、ovasiga含駅無(wú)顯苦

27、性差異（p> 0. 05）； nak-im組、chit組小鼠小腸總iga、 ova-siga 含最較 nak、pla、cha 三組升高（pv 0.01）、chit 組高于 nak-im m（p<0.01）（表 4）。2.4 小鼠血清ovaslge含 測(cè)定小鼠血清中 ova-sige含量.提示六組中,ns組小鼠血清 ovasige 含量最低（pv0.01）； nak、pla、cha 三組小鼠血清ova-sige含最無(wú)顯著性差異（p> 0. 05）； nak-im 組、chit 組小鼠小腸（）va-sige 含量較nak、pla、cha三組降低（pv001）, chit 組低于n

28、ak-im組（pv0 01）（表"）。2.5小鼠小腸組織中剩余組織胺含 測(cè)定小鼠 小腸組織中剩余組織胺含最，顯示六組中，ns紐 小鼠小腸剩余組織胺含提示其 小腸組織胺釋放量最低)nak、pla、cha三組小 ».小腸組織屮剩余組織胺含暈無(wú)顯護(hù)性差5f(p> 0. 05), nak im組、chit組小鼠小腸組織中剩余組 織胺含量較nak. pla. cha三組升高(pv0.01)、 chit 組髙于 nak-im 31( p<0. 01)( 4)提示 nak im組、chit組過(guò)敏小乩小腸組織胺釋放受到 抑制.chhaim織胺秤放抑制秤度最仏舉4各組小亂待測(cè)指標(biāo)

29、比較chn 11(nukmpin mnk im(hit mlx>g( mrna n；f pi/ mrna)|mufi)0. 9«±0. 07白1.0310. 0臚0.06 令2i. h i1.30 1 002 日1. 11 1 ().01lx)g( mrna ifn 7/ nirnanrtm)1.27 + 0. 02 l.28f 0. 0|"2l.26±(>. 02 令i. 37 i (» 011. 1« 1 ().55 1 0.01i,og( mrna fi. i / mr n aj| "伽)l.27±

30、;(). 03 令l.26±(h 02*2l251o. ()1i. i6 i 0. 031.07 i ()(m0. «6 1 0.(>?» a a0 ira(d vi)0. 13 ±0. haae(h 4 1 1 0.06令0.174 0. (m令0. 82 » 007%"21.2507 1.56 1 0. h 韓ova(ft)0. 23土 (h 03"<». 21 4 o.ow0. 23 i (). 02令0.43 i 0.010. 72 1 0ijm 1 0.(>5*b*aaova slge(

31、 d(ft)0. s6±0.0la>0. 56 4 00：沖2574 0. ()2aa>0. 36 1 0.020. 26 1 00. 12 1 0.0211 白俐余細(xì)織ik a ht60. 0«± 4.01*266. 15 ±8. 0359.4b a130. 11 1i78.ki 1 x<)9«l<)7. 6k 1(ng/o. irinm)ni 比較.» p<0.0|； i nak 111 比較.pvo.oi; *1 ph ill 比較.p«>.<)l« * j nak

32、ini hl 比較.*p<o.oi» *j chii !比較.af><o.ol；與 n,納比較.pv0.013討論食物過(guò)敏主要與thl/th2細(xì)胞平衡異常，th2細(xì)胞反應(yīng)亢進(jìn)，誘導(dǎo)速發(fā)型變態(tài)反應(yīng)有關(guān)。 tgf-卩是腸道黏膜免疫最重要的調(diào)節(jié)抑制性細(xì)胞 因于可調(diào)wthl/th2細(xì)胞平衡，抑制th2細(xì)胞 分泌il-4,逆轉(zhuǎn)th2細(xì)胞過(guò)度極化1'打誘導(dǎo)腸逍 產(chǎn)生分泌性iga抗體，預(yù)防和治療食物過(guò)敏。 故外源性提拓腸道tgf-p水平町能是緩解食物過(guò) 敏癥狀的治療策略之一“。但是，口前對(duì)tgf-p 的研究多局限于體外細(xì)胞學(xué)水平，缺少其治療食物 過(guò)敏的體內(nèi)研究證據(jù)，11幫

33、用的單純tgf-p ii服 給藥方式尚存在利用率低、過(guò)敏療效不穩(wěn)定等弊 端因此,本課題通過(guò)構(gòu)建pbudcei. 1/tgft 01質(zhì)粒.試圖利用質(zhì)粒dna體系町在體內(nèi)穩(wěn)定表 達(dá)的優(yōu)勢(shì)，探索體內(nèi)給予tgf-p質(zhì)粒是否有利于 誘導(dǎo)過(guò)敏小風(fēng)腸道tgf-卩表達(dá)，緩解過(guò)敏癥狀。殼聚糖是天然甲殼素的脫乙酰產(chǎn)物，具有優(yōu)良 的生物相容性、可降解性，無(wú)免疫原性，能與 dna形成聚電解質(zhì)復(fù)合物，保護(hù)質(zhì)粒dna免遭 dnase酶解.是高效的口服藥物控釋系統(tǒng)，尤其 對(duì)于發(fā)生在胃腸道黏膜的疾病其吸收率和效果更 佳。此外，殼聚糖尚能和dna形成微囊，較 之傳統(tǒng)dna質(zhì)粒肌肉注射方法具有更島的轉(zhuǎn)染效 能，被視為最具潛力、安

34、全而有效的非病毒性基因 載體，日益廣泛應(yīng)用于治療性基因轉(zhuǎn)運(yùn)和疫苗研 究g。本實(shí)驗(yàn)在構(gòu)建pbudced. 1/tgf-pl質(zhì)粒并 證實(shí)能在真核細(xì)胞屮成功轉(zhuǎn)染并表達(dá)的基礎(chǔ)上，試 圖利用殼聚糖在藥物控釋和基因轉(zhuǎn)運(yùn)方面的優(yōu)越 性，分別采用質(zhì)粒常規(guī)肌肉給藥途徑和殼聚糖納米 1服給藥途徑.比較()va過(guò)敏小鼠腸道過(guò)敏炎癥 的緩解狀況，了解tgf-p質(zhì)粒經(jīng)芫聚糖微粒ii服 是否優(yōu)于常規(guī)肌肉給藥.更利于食物過(guò)敏治療。本研究發(fā)現(xiàn)nak-im組、chit組小鼠腸道 tgf-pl mrna 表達(dá)較 nak、pla、cha 組升高, fl chit組寫(xiě)于nak-im組，證實(shí)通過(guò)肌肉和殼聚糖 門服形式，pbudce4.

35、 1/tgf-pl質(zhì)粒在過(guò)敏小凰 體內(nèi)町產(chǎn)生不同程度的衷達(dá).h殼聚糖【i服給藥形 式在提高腸道對(duì)pbudced. l/tgf-pi質(zhì)粒的利川 率，促進(jìn)腸道tgf-pi表達(dá)方面較肌肉給藥優(yōu)越。此外，nak-im組、chit紐小鼠小腸黏液總 iga 和 ova-slga 表達(dá)較 nak、pla. cha 組升 高.ll chit紐高于nak-im組，其分泌規(guī)律與 tgf-pimrna在各組的衣達(dá)類似，推測(cè)腸逍 tgf-pl表達(dá)可能促進(jìn)iga分泌。腸道tgf-pi高 表達(dá)是slga持續(xù)分泌的重要條件1唄。研究中，口 服殼聚糖或肌肉給予pbudced. 1/tgf-pl質(zhì)粒町 能通過(guò)促進(jìn)腸道tgf-卩

36、1喪達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)腸道總 仗人和()va-siga表達(dá).利于緩解食物過(guò)敏癥 狀le, h殼聚糖口服給藥途徑產(chǎn)生的總iga和 ova-siga多于肌肉給藥。另外，食物過(guò)敏介導(dǎo)的組織損傷與th2細(xì)胞 反應(yīng)亢進(jìn).進(jìn)而導(dǎo)致體內(nèi)特異性ige抗體上升.小 腸肥大細(xì)胞脫顆粒、組織胺釋放有關(guān)。在外周.thl細(xì)胞主要分泌ifn-y. th2細(xì)胞主要分泌iim 等細(xì)胞岡子。實(shí)驗(yàn)中cha組小鼠外周血清()va特 異性ige水平升高、小腸組織中il-4 mrna表達(dá) 和腸道黏膜組織胺釋放增加(提示腸道剩余組織胺 含誠(chéng)降低)、ifn-y mrna表達(dá)降低.證實(shí)激發(fā)組 小鼠體內(nèi)th2細(xì)胞反應(yīng)亢進(jìn)。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)打 nak、

37、pla、cha 三組小鼠比較 nak-im 組、chit 組小鼠血清()va-slge. il-4 mrna表達(dá)抑制、 腸黏膜組織胺釋放減少、ifn-y mrna表達(dá)升 商、以chit組改變最明顯.提示pbudced. 1/ tgf-gl質(zhì)粒通過(guò)肌肉和殼聚糖口服形式均可緩解 過(guò)敏時(shí)組織胺介導(dǎo)的腸道免疫炎癥損傷.il質(zhì)粒經(jīng) 殼聚糖i丨服給藥的作用優(yōu)于肌肉注射。綜卜.研究誠(chéng)示.通過(guò)肌肉和殼聚糖ii服給藥網(wǎng) 種形式在體給于pbudced. 1/tgf-pi質(zhì)粒.均可 促進(jìn)過(guò)敏小鼠腸道tgf-gl農(nóng)達(dá).緩解腸逍炎癥， il以殼聚糖【i服給藥途徑優(yōu)于肌肉給藥途徑。w 此.對(duì)于發(fā)生在腸道本身的過(guò)敏損傷.利

38、用tgf pi質(zhì)粒壟岡穩(wěn)運(yùn)農(nóng)達(dá)的待點(diǎn)并結(jié)介売聚糖我基岡 轉(zhuǎn)運(yùn)和藥物控釋方面的優(yōu)勢(shì).進(jìn)行以殼聚糖為載體 的tgf-pi荃岡轉(zhuǎn)運(yùn)研究.右利于強(qiáng)化tgf-pi治 療食物過(guò)敏的療效。參考文獻(xiàn)i wan yy flavell ra. rcguhtory t ccllst trhnforming ffrowih factor beta nnd immune suppression | j proc am 1'borac soc. 2007>4(3) s271 276.i 2 kellinghauen l konig lh kottcher ! ct al. inhibition of hum

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49、ce induced by ovalbuminli fei, jin xin-ming, shen xiao-ming (shanghai xinhua hospital affiliated to shanghai jiaotong university school of medicine t shanghai institute for pediatric research shanghai key laboratory of childrens environmental health 9 shanghai 200092, chinaabstruct： the aim of the p

50、resent study is to investigate whether the adminislration in vivo of tgf-p plasmid is facilitated to in- duce the expression of tgf-p in intestine of ovalbumin()va induced allergic mice, and to determine whether the oral administration of the tgf-p plasmid micro-particles with chitosan is even bette

51、r than the conventional intramuscular injection route in order to provide some clue to chosgn the chitosan dna plasmid in the treatment of food allergy. at first the eukaryotic ex 篤 prcsxion recombinant plasmid pbudce 4. 1/tgf-卩 1 was constructed and the chitosan dna micrcrparliclew were then prepar

52、ed. the intestinal allergic animal model wax established in bai.b/c mice by induction with ova t and 60 female mice were domly divided into different groups« such as oral chitosan/dna plasmid group(chit) > oral naked on a plasmid control group (nak)« intramuscular naked dna plasmid cont

53、rol group(nak im)» oral dna plasmid group(pla) and the positive control group treated with normal salinc(cha)« meanwhile group of mice without sensitization and challenge whm »et up a» the nega live controk ns). the mrna expressions of tgf-p> ien-y and 1l-4 in intestine of mice were evaluated by