CMV復(fù)合啟動增強子指導(dǎo)pDsRed2-1基因在牛胎兒皮膚成纖維細(xì)胞中的表達(dá)

1、cmv啟動子指導(dǎo)pdsred2-1基因在牛胎兒成纖維細(xì)胞中的表達(dá)杜雪，張東，周歡敏*（內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)動物遺傳冇種重點實驗室 呼和浩特010018）摘要：目的為了檢測擴增所得cmv啟動子能夠指導(dǎo)下游基因序列表達(dá)，從而 可以為構(gòu)建其它真核表達(dá)載體提供實驗基礎(chǔ)和依據(jù)。方法對pegfp質(zhì)粒上的 cmv啟動子進行擴增，并將其插入pdsred2-l質(zhì)粒紅色熒光蛋白上游，構(gòu)建 pcmv-red質(zhì)粒轉(zhuǎn)染牛胎兒皮膚成纖維細(xì)胞，對其進行熒光檢測。結(jié)果質(zhì)粒轉(zhuǎn)染 牛胎兒皮膚成纖維細(xì)胞48小時后，熒光激發(fā)細(xì)胞，發(fā)紅色熒光。結(jié)論擴增所得 cmv啟動子具冇啟動其下游基因表達(dá)的功能。pcmv-red質(zhì)?？捎糜跇?gòu)建英它 真核表

2、達(dá)載體。關(guān)鍵詞：cmv啟動子；pdsred2-l質(zhì)粒；pcmv-red質(zhì)粒；牛胎兒皮膚成纖維 細(xì)胞expression of pdsred2-l gene in bovine fetal skinfibroblasts under the control of cmv promoterdu-xue, zhang-dong, zhou huan-min（ animal genetics breeding reproduction, college of bioengineering, innermongolia agricultural university, huhhot 01001 &

3、; china）abstract： objective to test the cmv promoter can guide the downstream gene expression, which can provide experimental basis and foundation when we construct a new eukaryotic expression vector. methods to insert the cmv promoter which is amplified from the pegfp plasmid into the pdsred2-l pla

4、smid to construct the pcmv-red plasmid, and use the new plasmid to transfect the bovine fetal fibroblasts for fluorescence detection. results transfected bovine fetal fibroblasts for 48 hours, fluorescence excite the cells, fat red fluorescence. conclusions cmv promoter can guide the downstream gene

5、 expression. pcmv-red plasmid can be used to build other eukaryotic expression vector.key words： cmv promoter; pdsred2-l plasmid; pcmv-red plasmid; bovine fetal fibroblasts隨著基因工程的高速發(fā)展，經(jīng)常需要構(gòu)建-種能高水平表達(dá)異源蛋白的表達(dá) 載體。啟動了對外援基因的表達(dá)水平影響很大，是基因工程表達(dá)載體的重要組成 原件。因此研究啟動子的克隆，對研究基因表達(dá)調(diào)控和構(gòu)建合適的表達(dá)載體至關(guān) 重要本實驗通過構(gòu)建真核表達(dá)載體pcmv-re

6、d,將其轉(zhuǎn)入牛胎兒皮膚成纖維 細(xì)胞，進行熒光檢測，為構(gòu)建其它真核表達(dá)載體啟動子的選擇提供實驗基礎(chǔ)和依 據(jù)。啟動了是指rna聚合酶識別并與z結(jié)合，從而起始轉(zhuǎn)錄的一段特異性dna 序列，通常位于基因的上游，是基因表達(dá)調(diào)控的重要順式元件。真核生物啟動子 的結(jié)構(gòu)是一個轉(zhuǎn)錄起始位點，整個啟動子由核心啟動子和上游啟動子兩部分組 成：1）核心啟動子，即tata盒，其功能是控制轉(zhuǎn)錄啟動的準(zhǔn)確性。2）上游啟 動子元件，包括caat盒和gc盒等，其功能是調(diào)控轉(zhuǎn)錄的起始頻率。cmv 啟動/增強了屈病毒啟動增強了，被廣泛應(yīng)用于構(gòu)建高效真核表達(dá)載體，用于基 因工程、基因治療和dna免疫等?？蓛有ё礁吣康幕虻霓D(zhuǎn)錄及表達(dá)

7、效率。紅色熒光蛋白（rfp）基因是1999年人們從海葵中分離所得，在紫外光的照 射下可發(fā)射紅色熒光，其蛋白質(zhì)的最大吸收光譜為583nm5o rfp與gfp在一級 結(jié)構(gòu)上只有23%的同源性，但也是不需要任何預(yù)處理便可檢測到的。有著廣泛的 應(yīng)用前景，為分子生物學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)等相關(guān)領(lǐng)域的研究提供了一個新的、快捷 的檢測手段。脂質(zhì)體也稱人工細(xì)胞膜，是由脂質(zhì)雙分了層組成的，可形成一種囊狀物被稱 為脂質(zhì)小體叫 隨后發(fā)現(xiàn)了膜的融合及內(nèi)吞作用。脂質(zhì)體法具有很多優(yōu)點，操 作簡便，轉(zhuǎn)化率高，對細(xì)胞類型的運用面廣，對轉(zhuǎn)染的核酸類型和分子量包容性 強，細(xì)胞毒性小，也可用于體內(nèi)的基因轉(zhuǎn)染何。因此脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法得到了廣泛的

8、 應(yīng)用。本實驗中所采用的是陽離子脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染法，試劑稱為lipofectamineo 1材料與方法1. 1實驗材料pegfp, pdsred2-l, dh5a,蒙古牛胎兒皮膚成纖維細(xì)胞1.2主要器材、儀器和藥品器材：卡氏培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)皿、離心管、凍存管等。儀器：超凈工作臺、培養(yǎng)箱、 倒置顯微鏡、熒光激發(fā)顯微操作儀、搖床等。紗品：dmem/f12培養(yǎng)液、胎牛 血清（fbs）、抗生素（ps）、dpi03質(zhì)粒小捉試劑盒、lipofectamine reagent等。 1.3引物設(shè)計根據(jù)pegfp屮登陸的cmv啟動子基因序列，利用生物軟件primer 5.0輔 助設(shè)計了引物p上游、p下游，預(yù)擴增片斷大

9、小約678 bp,同時在上游5端引入sac 切位點，下游引物5端引入kpntm切位點，分別用下劃線標(biāo)出，引物序列 如下：上游引物：atgagctctgttctttcctgcgttatccccsac!卜游引物：atggtaccgctagcggatctgacggttcackpn!1. 4表達(dá)載體pcmv-red的構(gòu)建及轉(zhuǎn)染pegfp和pdsred2-l質(zhì)粒的提取液體lb培養(yǎng)基分別培養(yǎng)含pegfp和pdsred2-l質(zhì)粒的菌液，37°c 220rpm培養(yǎng)12小時。質(zhì)粒捉取步驟參照天根質(zhì)粒小提試劑盒使用說明o cmv啟動子的擴增以提取所得pegfp為模板，以設(shè)計的基因序列為引物，對cmv啟動

10、子進行擴增，并電泳檢測。cmv啟動子擴增 產(chǎn)物和pdsred2-l質(zhì)粒的酶切 將cmv啟動子和dsred2-l質(zhì)粒用sac /和kpn /酶切，37°c反應(yīng)3-4h,電泳檢測。膠回收cmv啟動了和pdsred2-l酶切產(chǎn)物,利用連接酶將cmv啟動子與pdsred2-1質(zhì)粒的多克隆位點相連接，構(gòu)建表達(dá)載 pcmv-redo使用cacl2法制備感受態(tài)細(xì)菌，熱激法進行轉(zhuǎn)化陽。挑取菌落，液體lb培養(yǎng)基屮培養(yǎng)12小吋，提取質(zhì)粒，酶切鑒定。脂質(zhì)體介導(dǎo)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染待6 孔板中的牛成纖維細(xì)胞生長至50-80%匯合時進行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染步驟見熒光激發(fā)檢測。lipofectamine reagent 使用說明。4

11、8 小時后, 2實驗結(jié)果2. 1cmv啟動子的擴增以pegfp為模板，對cmv啟動子擴增，pcr產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測。如圖1, 1-4 號泳道在約678bp處有單一條帶，與預(yù)期擴增的cmv啟動子片段大小相-致。 m： dl20001-4： cmv 啟動了 pcr 擴增產(chǎn)物2. 2重組質(zhì)粒pcmv-red的酶切鑒定重組質(zhì)粒pcmv-red經(jīng)sad/ kpnl酶切得到4.1 kb和678bp兩個片斷， pcmv-red經(jīng)sac/切得到約4.8kb的單一片斷，pdsred2-l經(jīng)sac脇切得到 4.1kb的單一片斷，圖2說明重組質(zhì)粒pcmv-red構(gòu)建是正確的。m： dl5000 1： pcmv-red用

12、sac/a”惣酶切產(chǎn)物厶pcmv-red用sac/fw切產(chǎn)物3： pdsred2-m22000bp圖1 cmv啟動子pcr擴增產(chǎn)物電泳檢測.1 4375bp250bplooobp75obpsoohnfig 1: the result of pcr amplificationof the cmv promoterm:dl20001-4:pcr product5000bp*3000bp2000bp*1500bp-looobp-75obp-500bp250bpm 123圖2:酶切鑒定fig2: identification of pcmv-red and pdsred2-1 by sac / kpn

13、 i m: dl5000 1:pcmv-red digested by sac i and kpn i 2:pcmv-rcd digested by sac i 3:pdsred2-l digested by sac i2.3熒光激發(fā)前后的照片圖3： pcmv-red轉(zhuǎn)染牛細(xì)胞顯微對照圖（100x）圖4： pcmv-red轉(zhuǎn)染牛細(xì)胞熒光激發(fā)圖（100fig 3: bovine cells which was transfcctcd with pcmv-red under light microscope(loox)x ) fig 4:bovine cells which was transfe

14、cted with pcmv-red under fluoroscope(loox)6孔板中的細(xì)胞轉(zhuǎn)染48h后在熒光顯微操作儀下熒光激發(fā)。本研究將 pcmv-red （紅色熒光蛋白）質(zhì)粒轉(zhuǎn)入牛胎兒成纖維細(xì)胞屮（圖3）,被轉(zhuǎn)染的 細(xì)胞發(fā)紅色熒光（圖4）,說明cmv啟動子具有啟動其下游基因表達(dá)的功能。3. 討論近年來，脂質(zhì)體法得到了迅速發(fā)展而成為目前應(yīng)用最為廣泛的轉(zhuǎn)染技術(shù)他。 脂質(zhì)體能將口的基因轉(zhuǎn)入細(xì)胞，且毒性較低測。木研究所采用的lipofectamine reagent脂質(zhì)體試劑將da包裹入內(nèi)，形成dna-脂質(zhì)體復(fù)合物，該復(fù)合物通 過膜融合或細(xì)胞內(nèi)吞作用，將dna傳遞進入細(xì)胞，進而進入轉(zhuǎn)錄、表

15、達(dá)本 實驗通過lipofectamine reagent轉(zhuǎn)染紅色熒光蛋口 pdsred2t質(zhì)粒到牛胎兒成 纖維細(xì)胞，48h后熒光激發(fā)檢測結(jié)果。實驗結(jié)果與預(yù)期結(jié)果一致，說明 lipofectamine reagent介導(dǎo)的牛胎兒成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)pcmv-red質(zhì)粒的技術(shù)是基 木成功的。4. 結(jié)論通過實驗成功克隆了 cmv啟動子區(qū)片斷，構(gòu)建了表達(dá)載體pcmv-red,經(jīng) 過轉(zhuǎn)染牛胎兒成纖維細(xì)胞，熒光激發(fā)后細(xì)胞發(fā)紅色熒光，說明所擴增的cmv啟 動子具有啟動其下游基因表達(dá)的功能，構(gòu)建所得的真核表達(dá)載體pcmv-red可 以用于后續(xù)實驗。參考文獻i 黃玉政，成勇.酪蛋白/巨細(xì)胞病毒(cmv)復(fù)合啟動/增強子

16、指導(dǎo)人乳鐵蛋白cdna表達(dá) 的研究d.揚州大學(xué)，2007： 15-16 馮亞杰，成勇.山羊blg調(diào)控序列及cmv增強子指導(dǎo)人胰島素原基因在細(xì)胞和小鼠中表 達(dá)d.揚州大學(xué)，2007： 2-43 成勇，謝莊.乳蛋白與cmv復(fù)合啟動子驅(qū)動hlfcdna乳腺特異性表達(dá)d.南京農(nóng)業(yè)大 學(xué),2007： 15-244 楊坤宇，劉如石，夏寧邵.紅色熒光蛋白在畢赤酵母中的高效表達(dá)j.廈門大學(xué)學(xué)報， 2005, 44 (3)： 35 姚琦，黃劭，姜勇.人cat啟動子紅色熒光蛋白報告基因載體的構(gòu)建及功能鑒定j.南 方醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，2009, 29 (11 )： 29146 龍華，松島良次.紅色熒光蛋白(rfp)基因

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