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文檔簡(jiǎn)介
1、人用重組DNA制品質(zhì)量控制技術(shù)指導(dǎo)原則 一、引言 由于分子遺傳學(xué)、核酸化學(xué)及重組DNA(rDNA)技術(shù)的迅速發(fā)展,現(xiàn)已能夠確定和獲得許多天然活性蛋白的編碼基因,將其插入表達(dá)載體或引入某種宿主細(xì)胞后,能有效地表達(dá)該基因產(chǎn)物,再經(jīng)分離、純化和檢定,可得到用于預(yù)防和治療某些人類疾病的制品,諸如現(xiàn)有的乙型肝炎疫苗、胰島素、生長(zhǎng)激素、干擾素等。 用不同于常規(guī)方法的rDNA技術(shù)生產(chǎn)的制品,是近年來(lái)出現(xiàn)的新產(chǎn)品,評(píng)價(jià)其安全性和有效性亦不同于常規(guī)方法。這一領(lǐng)域中的知識(shí)和技術(shù)還在不斷發(fā)展,為了有利于這類制
2、品在我國(guó)的研究和發(fā)展,并為這類制品的審評(píng)提供依據(jù),有必要制定一個(gè)原則性指導(dǎo)文件,以保證在人群中試驗(yàn)或應(yīng)用時(shí)安全有效。 本“人用重組DNA制品質(zhì)量控制技術(shù)指導(dǎo)原則”(以下簡(jiǎn)稱指導(dǎo)原則)不可能面面俱到,可能有許多專門(mén)技術(shù)問(wèn)題會(huì)出現(xiàn),對(duì)于這類問(wèn)題或某一特定制品,則應(yīng)視具體問(wèn)題具體研究決定。本指導(dǎo)原則亦將隨科學(xué)技術(shù)發(fā)展和經(jīng)驗(yàn)積累而逐步完善。 二、總則 (一)本指導(dǎo)原則適用于rDNA技術(shù)生產(chǎn)并在人體內(nèi)應(yīng)用的蛋白質(zhì)、肽類制品。 (二)凡屬與一般生物制品有關(guān)的質(zhì)量控
3、制,均按現(xiàn)行版中國(guó)藥典有關(guān)規(guī)定執(zhí)行。有關(guān)生產(chǎn)設(shè)施的要求應(yīng)參照國(guó)家藥品監(jiān)督管理局藥品生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范執(zhí)行。 三、質(zhì)量控制要求 (一)原材料的控制 1表達(dá)載體和宿主細(xì)胞 應(yīng)提供有關(guān)表達(dá)載體詳細(xì)資料,包括基因的來(lái)源、克隆和鑒定,表達(dá)載體的構(gòu)建、結(jié)構(gòu)和遺傳特性。應(yīng)說(shuō)明載體組成各部分的來(lái)源和功能,如復(fù)制子和啟動(dòng)子來(lái)源,或抗生素抗性標(biāo)志物。提供至少包括構(gòu)建中所用位點(diǎn)的酶切圖譜。應(yīng)提供宿主細(xì)胞的資料,包括細(xì)胞株(系)名稱、來(lái)源、傳代歷史、檢定結(jié)果及基本生物學(xué)特性等。
4、 應(yīng)詳細(xì)說(shuō)明載體引入宿主細(xì)胞的方法及載體在宿主細(xì)胞內(nèi)的狀態(tài)(是否整合到染色體內(nèi))及拷貝數(shù)。應(yīng)提供宿主和載體結(jié)合后的遺傳穩(wěn)定性資料。 2克隆基因的序列 應(yīng)提供插入基因和表達(dá)載體兩側(cè)端控制區(qū)的核苷酸序列。所有與表達(dá)有關(guān)的序列均應(yīng)詳細(xì)敘述。 3表達(dá) 應(yīng)詳細(xì)敘述在生產(chǎn)過(guò)程中,啟動(dòng)和控制克隆基因在宿主細(xì)胞中的表達(dá)所采用的方法及表達(dá)水平。4原輔料 原輔料應(yīng)按照國(guó)家藥品監(jiān)督管理局有關(guān)規(guī)定執(zhí)行。動(dòng)物源性原料的使用應(yīng)提供來(lái)源及質(zhì)控檢測(cè)
5、資料;發(fā)酵用培養(yǎng)基不能添加內(nèi)酰胺類抗生素。(二)生產(chǎn)的控制 1主細(xì)胞庫(kù)(MASTERCELLBANK) rDNA制品的生產(chǎn)應(yīng)采用種子批(SEEDLOT)系統(tǒng)。從已建立的主細(xì)胞庫(kù)中,再進(jìn)一步建立生產(chǎn)細(xì)胞庫(kù)(WCB)。 含表達(dá)載體的宿主細(xì)胞應(yīng)經(jīng)過(guò)克隆而建立主細(xì)胞庫(kù)。在此過(guò)程中,在同一實(shí)驗(yàn)室工作區(qū)內(nèi),不得同時(shí)操作兩種不同細(xì)胞(菌種);一個(gè)工作人員亦不得同時(shí)操作兩種不同細(xì)胞或菌種。 應(yīng)詳細(xì)記述種子材料的來(lái)源、方式、保存及預(yù)計(jì)使用壽命。應(yīng)提供在保存和復(fù)蘇條件下宿
6、主載體表達(dá)系統(tǒng)的穩(wěn)定性證據(jù)。采用新的種子批時(shí),應(yīng)重新作全面檢定。真核細(xì)胞用于生產(chǎn)時(shí),細(xì)胞的鑒別標(biāo)志,如特異性同功酶或免疫學(xué)或遺傳學(xué)特征,對(duì)鑒別所建立的種子是有用的。有關(guān)所用傳代細(xì)胞的致癌性應(yīng)有詳細(xì)報(bào)告。如采用微生物培養(yǎng)物為種子,則應(yīng)敘述其特異表型特征。 一般情況下,在原始種子階段應(yīng)確證克隆基因的DNA序列。但在某些情況下,例如傳代細(xì)胞基因組中插入多拷貝基因。在此階段不適合對(duì)克隆基因作DNA序列分析。在此情況下,可采用總細(xì)胞DNA的雜交印染分析,或作mRNA的序列分析。對(duì)最終產(chǎn)品的特征鑒定應(yīng)特別注意。 種子批不應(yīng)含有外源致癌
7、因子,不應(yīng)含有感染性外源因子,如細(xì)菌、支原體、真菌及病毒。 有些細(xì)胞株含有某些內(nèi)源病毒,例如逆轉(zhuǎn)錄病毒,且不易除去。但當(dāng)已確知在原始細(xì)胞庫(kù)或載體部分中污染此類特定內(nèi)源因子時(shí),則應(yīng)能證明在生產(chǎn)純化過(guò)程可使之滅活或清除。 2有限代次生產(chǎn) 用于培養(yǎng)和誘導(dǎo)基因產(chǎn)物的材料和方法應(yīng)有詳細(xì)資料。對(duì)培養(yǎng)過(guò)程及收獲時(shí),應(yīng)有敏感的檢測(cè)措施控制微生物污染。 應(yīng)提供培養(yǎng)生長(zhǎng)濃度和產(chǎn)量恒定性方面的數(shù)據(jù),并應(yīng)確立廢棄一批培養(yǎng)物的指標(biāo)。根據(jù)宿主細(xì)胞載體系統(tǒng)的穩(wěn)定性資料,確定在生產(chǎn)過(guò)
8、程中允許的最高細(xì)胞倍增數(shù)或傳代代次,并應(yīng)提供最適培養(yǎng)條件的詳細(xì)資料。 在生產(chǎn)周期結(jié)束時(shí),應(yīng)監(jiān)測(cè)宿主細(xì)胞載體系統(tǒng)的特性,例如質(zhì)??截悢?shù)、宿主細(xì)胞中表達(dá)載體存留程度、含插入基因的載體的酶切圖譜。一般情況下,用來(lái)自一個(gè)原始細(xì)胞庫(kù)的全量培養(yǎng)物進(jìn)行監(jiān)測(cè),必要時(shí)應(yīng)做一次目的基因的核苷酸序列分析。 3連續(xù)培養(yǎng)生產(chǎn) 基本要求同2項(xiàng)。 應(yīng)提供經(jīng)長(zhǎng)期培養(yǎng)后所表達(dá)基因的分子完整性資料,以及宿主細(xì)胞的表型和基因型特征。每批培養(yǎng)的產(chǎn)量變化應(yīng)在規(guī)定范圍內(nèi)。對(duì)可以進(jìn)行后處理及應(yīng)廢棄
9、的培養(yǎng)物,應(yīng)確定指標(biāo)。從培養(yǎng)開(kāi)始至收獲,應(yīng)有敏感的檢查微生物污染的措施。 根據(jù)宿主載體穩(wěn)定性及表達(dá)產(chǎn)物的恒定性資料,應(yīng)規(guī)定連續(xù)培養(yǎng)的時(shí)間。如屬長(zhǎng)時(shí)間連續(xù)培養(yǎng),應(yīng)根據(jù)宿主載體穩(wěn)定性及產(chǎn)物特性的資料,在不同間隔時(shí)間作全面檢定。 4純化 對(duì)于收獲、分離和純化的方法應(yīng)詳細(xì)記述,應(yīng)特別注意污染病毒、核酸以及有害抗原性物質(zhì)的去除。 如采用親和層析技術(shù),例如用單克隆抗體,應(yīng)有檢測(cè)可能污染此類外源性物質(zhì)的方法,不應(yīng)含有可測(cè)出的異種免疫球蛋白。 &
10、#160; 對(duì)整個(gè)純化工藝應(yīng)進(jìn)行全面研究,包括能夠去除宿主細(xì)胞蛋白、核酸、糖、病毒或其它雜質(zhì)以及在純化過(guò)程中加入的有害的化學(xué)物質(zhì)等。 關(guān)于純度的要求可視制品的用途和用法而確定,例如,僅使用一次或需反復(fù)多次使用;用于健康人群或用于重癥患者;對(duì)純度可有不同程度要求。 (三)最終產(chǎn)品的控制 應(yīng)建立有關(guān)產(chǎn)品的鑒別、純度、穩(wěn)定性和活性等方面的試驗(yàn)方法。檢測(cè)的必要性和純度要求取決于多種因素:產(chǎn)品性質(zhì)和用途、生產(chǎn)和純化工藝及生產(chǎn)工藝的經(jīng)驗(yàn)。一般說(shuō)來(lái)下列試驗(yàn)對(duì)控制產(chǎn)品質(zhì)量是可以采用的。新的分析技術(shù)及對(duì)現(xiàn)
11、有技術(shù)的改進(jìn)正在不斷進(jìn)行,適當(dāng)時(shí)應(yīng)使用這些新的技術(shù)。 1物理化學(xué)鑒定 (1)氨基酸組成 使用各種水解法和分析手段測(cè)定氨基酸的組成,并與目的蛋白基因序列推導(dǎo)的氨基酸組成或天然異構(gòu)體比較。如需要時(shí)應(yīng)考慮分子量的大小。多數(shù)情況下,氨基酸組成分析對(duì)肽段和小蛋白可提供有價(jià)值的結(jié)構(gòu)資料,但對(duì)大蛋白一般意義較小。在多數(shù)情況下,氨基酸定量分析數(shù)據(jù)可用于確定蛋白含量。 (2)氨基酸末端序列 氨基酸末端分析用于鑒別N-端和C-端氨基酸的
12、性質(zhì)和同質(zhì)性。若發(fā)現(xiàn)目的產(chǎn)品的末端氨基酸發(fā)生改變時(shí),應(yīng)使用適當(dāng)?shù)姆治鍪侄闻卸ㄗ儺愺w的相應(yīng)變異數(shù)量。應(yīng)將這些氨基酸末端序列與來(lái)自目的產(chǎn)品基因序列推導(dǎo)的氨基酸末端序列進(jìn)行比較。 (3)肽譜 應(yīng)用合適的酶或化學(xué)試劑使所選的產(chǎn)品片段產(chǎn)生不連續(xù)多肽,應(yīng)用HPLC或其他適當(dāng)?shù)姆椒ǚ治鲈摱嚯钠?。?yīng)盡量應(yīng)用氨基酸組成分析技術(shù),N-末端測(cè)序或質(zhì)譜法鑒別多肽片段。對(duì)批簽發(fā)來(lái)說(shuō),經(jīng)驗(yàn)證的肽譜分析經(jīng)常是確證目的產(chǎn)品結(jié)構(gòu)/鑒別的適當(dāng)方法。 (4)巰基和二硫鍵 如果依據(jù)目的產(chǎn)品
13、基因序列存在半胱氨酸殘基時(shí),應(yīng)盡可能確定巰基和/或二硫鍵的數(shù)量和位置。使用方法包括肽譜分析(還原和非還原條件下)、質(zhì)譜測(cè)定法或其他適當(dāng)?shù)姆椒ā?#160; (5)碳水化合物結(jié)構(gòu) 應(yīng)測(cè)定糖蛋白中碳水化合物含量(中性糖、氨基糖、唾液酸)。此外盡可能分析碳水化合物的結(jié)構(gòu)、寡糖形態(tài)(長(zhǎng)鏈狀)和多肽的糖基化位點(diǎn)。 (6)分子量 應(yīng)用分子篩層析法、SDS-PAGE(還原和/或非還原條件下)、質(zhì)譜測(cè)定法、和/或其他適當(dāng)技術(shù)測(cè)定分子量。 (7)
14、等電點(diǎn) 通過(guò)等電聚焦電泳或其他適當(dāng)?shù)姆椒y(cè)定。 (8)消光系數(shù)(或克分子吸光度) 多數(shù)情況下,可取目的產(chǎn)品于UV/可見(jiàn)光波長(zhǎng)處測(cè)定消光系數(shù)(或克分子吸光度)。消光系數(shù)的測(cè)定為使用UV/可見(jiàn)光或分光光度計(jì)檢測(cè)已知蛋白含量的溶液,蛋白含量應(yīng)用氨基酸組成分析技術(shù)或定氮法等方法測(cè)定。 (9)電泳圖型 應(yīng)用PAGE電泳、等電聚焦、SDSPAGE電泳、免疫印跡、毛細(xì)管電泳法或其他適當(dāng)?shù)姆椒?獲得目的產(chǎn)品/藥物的一致性,同一性和純
15、度的電泳圖譜和數(shù)據(jù)。 (10)液相層析圖譜 應(yīng)用分子篩層析、反相液相層析、離子交換液相層析、親和層析或其他適當(dāng)方法,獲得目的產(chǎn)品/藥物的一致性、同一性和純度的層析圖譜和數(shù)據(jù)。 (11)光譜分析 適當(dāng)時(shí),應(yīng)用紫外或可見(jiàn)光吸收光譜法測(cè)定,使用圓二色譜、核磁共振(NMR)、或其他適當(dāng)?shù)姆椒z測(cè)制品的高級(jí)結(jié)構(gòu)。 2雜質(zhì)檢測(cè) (1)工藝相關(guān)雜質(zhì) 工藝相關(guān)雜
16、質(zhì)來(lái)源于生產(chǎn)工藝,可分三大類:來(lái)源于細(xì)胞基質(zhì)、培養(yǎng)基和下游工藝。 來(lái)源于細(xì)胞基質(zhì)的雜質(zhì)包括源于宿主生物體的蛋白/多肽;核酸(宿主細(xì)胞/載體/總DNA);多糖及病毒。對(duì)于宿主細(xì)胞蛋白,一般應(yīng)用能檢測(cè)出較寬范圍蛋白雜質(zhì)的靈敏的免疫檢測(cè)方法。應(yīng)用不含目的基因的生物體粗提物,即不含產(chǎn)品編碼基因的生產(chǎn)用細(xì)胞,制備上述試驗(yàn)使用的多克隆抗體??赏ㄟ^(guò)對(duì)產(chǎn)品的直接分析方法(如雜交技術(shù)法)檢測(cè)宿主細(xì)胞的DNA水平,和/或通過(guò)標(biāo)記實(shí)驗(yàn)(實(shí)驗(yàn)室規(guī)模)檢測(cè)證實(shí)通過(guò)純化工藝能去除核酸。對(duì)于有意導(dǎo)入的病毒,應(yīng)驗(yàn)證生產(chǎn)工藝中去除/滅活病毒的能力。 來(lái)源于
17、培養(yǎng)基的雜質(zhì)包括誘導(dǎo)劑(多核苷酸,病毒)、抗生素、血清及其他培養(yǎng)基組分。 來(lái)源于下游工藝產(chǎn)生的雜質(zhì)包括酶、化學(xué)/生化處理試劑(如溴化氰、胍、氧化劑和還原劑)、無(wú)機(jī)鹽(如重金屬、砷、非有色金屬離子)、溶劑、載體/配體(如單克隆抗體),及其他可濾過(guò)的物質(zhì)。 (2)產(chǎn)品相關(guān)雜質(zhì) 以下為最常見(jiàn)的目的產(chǎn)品的分子變異體,并列出了相應(yīng)的檢測(cè)方法: 化學(xué)修飾類型:應(yīng)考慮脫酰胺、異構(gòu)化、錯(cuò)配S-S連接和氧化形式的分離和鑒別。對(duì)這些變異體的分離和鑒別,可應(yīng)用層析法和/或電
18、泳法(如HPLC、毛細(xì)管電泳、質(zhì)譜法、圓二色譜)。 降解物和聚合體:聚合體包括二聚體和多聚體:可用分子篩層析法(如SE-HPLC)進(jìn)行定量;降解物:應(yīng)建立降解物的判定標(biāo)準(zhǔn),并對(duì)穩(wěn)定性試驗(yàn)產(chǎn)生的降解產(chǎn)物進(jìn)行監(jiān)測(cè)。 3生物學(xué)測(cè)定 (1)鑒別試驗(yàn) 應(yīng)用免疫印跡法,或者在可能情況下,應(yīng)用參考品將rDNA制品與天然產(chǎn)品通過(guò)生物學(xué)比較試驗(yàn),確定其與天然產(chǎn)品是一致的。 (2)效價(jià)測(cè)定 采用國(guó)際或
19、國(guó)家參考品,或經(jīng)過(guò)國(guó)家檢定機(jī)構(gòu)認(rèn)可的參考品,以體內(nèi)或體外法測(cè)定制品的生物學(xué)活性,并標(biāo)明其活性單位。 (3)特異比活性測(cè)定 在測(cè)定生物學(xué)活性的基礎(chǔ)上,對(duì)有些制品還應(yīng)用適當(dāng)方法測(cè)定主藥蛋白含量,測(cè)定其特異比活性,以活性單位重量表示。 (4)熱原質(zhì)試驗(yàn) 應(yīng)采用家兔法或鱟試驗(yàn)法(LAL)作熱原質(zhì)檢測(cè),控制標(biāo)準(zhǔn)可參照天然制品的要求。 (5)無(wú)菌試驗(yàn) 參照現(xiàn)行版中國(guó)藥典有關(guān)規(guī)定進(jìn)行,應(yīng)證實(shí)最終制品無(wú)細(xì)菌污染。 (6)抗原性物質(zhì)檢查 必要時(shí),如制品屬大劑量反復(fù)使用者,應(yīng)測(cè)定最終制品中可能存在的抗原性物質(zhì),如宿主細(xì)胞、亞細(xì)胞組分及培養(yǎng)基成份等?;颊叻磸?fù)接受大劑量的這類制品時(shí),應(yīng)密切監(jiān)測(cè)由這些抗原可能產(chǎn)生的抗體或變態(tài)反應(yīng)。 (7)異常毒性試驗(yàn) 可參照現(xiàn)行版中國(guó)藥典有關(guān)規(guī)定進(jìn)行。 4其他 根據(jù)產(chǎn)品劑型,應(yīng)有外觀(如固體、液體、色澤、澄明度等方面的描述)、水分
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