發(fā)酵工程（完整版）

1、固體發(fā)酵某些微生物生長(zhǎng)需水很少，可利用疏松而含有必需營(yíng)養(yǎng)物的固體培養(yǎng)基進(jìn)行發(fā)酵生產(chǎn)，稱為固體發(fā)酵。我國(guó)傳統(tǒng)的釀酒、制醬及天培(大豆發(fā)酵食品) 等的生產(chǎn)均為固體發(fā)酵。另外，固體發(fā)酵還用于蘑菇的生產(chǎn)、奶酪和泡菜的制作以及動(dòng)植物廢料的堆肥等。固體發(fā)酵所用原料一般為經(jīng)濟(jì)易得、富含營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的工農(nóng)業(yè)中的副、廢產(chǎn)品，如麩皮、事粉、大豆餅粉、高梁和玉米粉等。根據(jù)需要對(duì)原料進(jìn)行粉碎、蒸煮等預(yù)加工以促進(jìn)背養(yǎng)物吸收，改普發(fā)酵生產(chǎn)條件，有的需加人尿素、硫酸餃及一些無(wú)機(jī)酸、堿等輔料。固體發(fā)酵一般都是開放式的，因而不是純培養(yǎng)，無(wú)菌要求不高。它的一般過程為:將原料預(yù)加工后再經(jīng)蒸煮滅菌，然后制成含一定水分的固體物料，接人預(yù)先

2、培養(yǎng)好的菌種，進(jìn)行發(fā)酵。發(fā)酵成熟后要適時(shí)出料，并進(jìn)行適當(dāng)處理，或進(jìn)行產(chǎn)物的提取。根據(jù)培養(yǎng)基的厚薄可分為薄層和厚層發(fā)酵，用到的設(shè)備有簾子、曲盤和曲箱等。薄層固體發(fā)酵是利用木盤或葦簾，在上面鋪12cm 厚的物料，接種后在曲室內(nèi)進(jìn)行發(fā)酵。厚層固體發(fā)酵是利用深槽(或池)，在其上部架設(shè)竹簾，簾上鋪一尺多厚的物料，接種后在深槽下部給以通氣進(jìn)行發(fā)酵。固體發(fā)酵所需設(shè)備簡(jiǎn)單，操作容易，并可因陋就簡(jiǎn)、因地制宜地利用一些來(lái)源豐富至今仍在某些產(chǎn)品的生產(chǎn)上不同程度地沿用著。但是這種方法的工農(nóng)業(yè)副產(chǎn)品，因此，例如，勞動(dòng)強(qiáng)度大，不便于機(jī)械化操作，微生物品種少、生長(zhǎng)慢，產(chǎn)品有有許多缺點(diǎn)，限等。所以目前主要的發(fā)酵生產(chǎn)

3、多為液體發(fā)酵。 典型產(chǎn)品的發(fā)酵生產(chǎn)1、抗生素發(fā)酵生產(chǎn)抗生素是生物體在生命活動(dòng)中產(chǎn)生的一種次級(jí)代謝產(chǎn)物。這類有機(jī)物質(zhì)能在低濃度下抑制或殺滅活細(xì)胞，這種作用又有很強(qiáng)的選擇性。例如，醫(yī)用的抗生素僅對(duì)造成人類疾病的細(xì)菌或腫瘤細(xì)胞有很強(qiáng)的抑制或殺滅作用，而對(duì)人體正常細(xì)胞損害很小，這是抗生素能成為醫(yī)藥的原理。目前，人們?cè)谏矬w內(nèi)發(fā)現(xiàn)的6000 多種抗生素，約60%來(lái)自發(fā)酵生放線菌?？股刂饕梦⑸锇l(fā)酵法生產(chǎn)，少數(shù)抗生素也可用化學(xué)方法合成。人們還對(duì)7固體天然的抗生素進(jìn)行生化或化學(xué)改造，使其具有更優(yōu)越的性能，這樣得到的抗生素叫半合肥等成抗生素。抗生素不僅廣泛用于臨床醫(yī)療，而且也用在農(nóng)業(yè)、畜牧及環(huán)保等領(lǐng)域中。

4、青霉素是最早發(fā)現(xiàn)并用于臨床的一種抗生素。它于1928 年被英國(guó)人A.Fleming 發(fā)現(xiàn)，20 世紀(jì)40 年代投人工業(yè)生產(chǎn)，它能有效地控制傷口的細(xì)菌感染，在第二次世界大麩戰(zhàn)期間挽救了數(shù)百萬(wàn)戰(zhàn)爭(zhēng)中受傷者的性命。下面以青霉素為例簡(jiǎn)單介紹抗生素的發(fā)酵生促產(chǎn)過程。（1） 青霉素發(fā)酵生產(chǎn)菌株最初由A.Fleming 分離的點(diǎn)青霉只能產(chǎn)生2U/mL的青靠素。目前全世界用于生產(chǎn)青霉素的高產(chǎn)菌株，大都由菌株Wis Q176(一種產(chǎn)黃青看Penicillium chrysogenum) 經(jīng)不同改良途徑得到。20 世紀(jì)70 年代前，育種采用誘變和隨機(jī)篩選

5、方法，后來(lái)由于原生質(zhì)體融合技術(shù)、基因克隆技術(shù)等現(xiàn)代育種技術(shù)的應(yīng)用，青霉素工業(yè)發(fā)酵生產(chǎn)水平已達(dá)85 000U/mL以上。青霉素生產(chǎn)菌株一般在真空冷凍干燥狀態(tài)下保存其分生孢子，也可以用甘油或乳糖溶劑作懸浮劑，在一70C冰箱或液氮中保存孢子懸浮液和營(yíng)養(yǎng)菌絲體。（2） 青霉素發(fā)酵生產(chǎn)培養(yǎng)基1) 碳源。目前普遍采用淀粉經(jīng)酶水解的葡萄糖糖化液進(jìn)行流加。2) 氮源?？蛇x用玉米漿、花生餅粉、精制棉籽餅粉或麩皮，并補(bǔ)加無(wú)機(jī)氮源。3) 前體。苯乙酸或苯乙酰胺，由于它們對(duì)青霉菌有一定毒性，故一次加人量不能大于0.1%，并采用多次加人方式。4) 無(wú)機(jī)鹽。包括硫、磷、鈣

6、、鎂、鉀等鹽類，鐵離子對(duì)青霉菌有毒害作用，應(yīng)在發(fā)酵液中將鐵含量嚴(yán)格控制在30pug/mL 以下。（3） 發(fā)酵工藝流程:1) 種子制備種子種子制備階段以生產(chǎn)豐富的袍子（斜面和米孢子培養(yǎng)）或大量健壯的菌絲體為目的。為達(dá)到這一目的，在培養(yǎng)基中加入比較豐富的容易代謝的碳源(如葡萄糖或蔗糖)，氦源(如玉米漿)、緩沖PH的碳酸鈣以及生長(zhǎng)所必需的無(wú)機(jī)鹽。并保持最適宜生長(zhǎng)溫度(25-26C)和充分通氣、攪拌。在最適生長(zhǎng)條件下，到達(dá)對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)菌體量的倍增時(shí)間為67h。在工業(yè)生產(chǎn)中，種子制備的培養(yǎng)條件及原材料質(zhì)量均應(yīng)嚴(yán)格控制，以保持種子質(zhì)量的穩(wěn)定性。2) 發(fā)酵培養(yǎng)影響青霉素發(fā)酵產(chǎn)率的因素有環(huán)境因素，如

7、PH、溫度、溶氧濃度和碳氮組分含量等; 有生理變量因素，包括菌絲濃度、菌絲生長(zhǎng)速度和菌絲形態(tài)等，對(duì)它們都要進(jìn)行嚴(yán)格控制。發(fā)酵過程中PH一般控制在6.46.6，發(fā)酵溫度前期為2526%C，后期為23C，以減少后期發(fā)酵液中青霉素的降解破壞。此外，還要求發(fā)酵液中溶氧量不低于飽和溶解氧的30%，通氣比一般為1:0.8 wm (單位培養(yǎng)液體積在單位時(shí)間內(nèi)通人的空氣量)。3) 發(fā)酵后處理a）過濾: 采用鼓式真空過濾器，過濾前加去乳化劑并降溫。b）提煉: 用溶媒萃取法。將發(fā)酵濾液酸化至pH 2.0，加1/3 體積的醋酸丁酯(簡(jiǎn)稱BA),混合后以碟片式離心機(jī)分離，得一次BA 萃取液。然后以NaHCO3; 在p

8、H 6.87.1條件下將青霉素從BA 中萃取到緩沖液中。再調(diào)節(jié)PH 至2.0，將青霉素從緩沖液再次轉(zhuǎn)人到BA 中，方法同上，得二次BA 萃取液。C）脫色: 在二次BA 萃取液中加活性炭脫色，過濾。d）結(jié)晶: 用丁醇共沸結(jié)晶法。將二次BA 萃取液以NaOH 溶液萃取，調(diào)PH 至6.46.8,得青霉素鈉鹽水濃縮液。之后加34 倍體積的丁醇，進(jìn)行真空蒸餾，將水與丁醇共沸物蒸出，則青霉素鈉鹽結(jié)晶析出，過濾，將晶體洗滌后干燥即得成品。2、氨基酸發(fā)酵生產(chǎn)氨基酸是構(gòu)成蛋白質(zhì)的基本單位，是人體及動(dòng)物的重要營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，氨基酸產(chǎn)品廣泛應(yīng)用于食品、飼料、醫(yī)藥、化學(xué)和農(nóng)業(yè)等領(lǐng)城。以前，氨基酸主要是由酸水解蛋白質(zhì)制得，現(xiàn)

9、在氨基酸的生產(chǎn)方法有發(fā)解法。提取法、合成法和酶法等，其中最主要的是發(fā)酵法，用發(fā)酵法生產(chǎn)的氨基酸已有20 多種。在谷氨酸是一種重要的氨基酸。食用味精是以谷氨酸為原料生成的谷氨酸單鈉的俗稱，谷氨酸還可以制成對(duì)皮膚無(wú)刺激性的洗滌劑(十二烷基谷氨酸鈉肥皂)、能保持皮膚濕潤(rùn)的潤(rùn)膚劑(谷氨酸鈉)、質(zhì)量接近天然皮革的聚谷氨酸人造革，以及人造纖維和涂料等。谷氨酸是目前氨基酸生產(chǎn)中產(chǎn)量最大的一種，同時(shí)，谷氨酸發(fā)酵生產(chǎn)工藝也是氨基酸發(fā)酵生產(chǎn)中最典型和最成熟的。我們就以谷氨酸為例簡(jiǎn)單介紹一下氨基酸的發(fā)酵生產(chǎn)。（1）谷氨酸發(fā)酵生產(chǎn)的菌種谷領(lǐng)酸發(fā)酵生產(chǎn)的菌種主要有棒狀桿菌屬、短桿菌屬、小桿菌屬及節(jié)桿菌屬的細(xì)菌

10、。除節(jié)桿菌外，其他三屬中有許多菌種適用于糖質(zhì)原料的谷氨酸發(fā)酵。這些細(xì)菌都是需氧微生物，都需要以生物素為生長(zhǎng)因子。我國(guó)谷氨酸發(fā)酵生產(chǎn)所用菌種有北京棒狀桿菌、AS1542、HU7251及7338、B9、AS1299，鈍齒棒狀桿菌等。這些菌株的斜面培養(yǎng)一般采用由蛋白胨、牛肉膏和氯化鈉等組成的，pH 為7.07.2的瓊脂培養(yǎng)基，32C培養(yǎng)24h,冰箱保存?zhèn)溆?。?）谷氨酸發(fā)酵生產(chǎn)的原料制備谷氨酸發(fā)酵生產(chǎn)以淀粉水解糖為原料。淀粉水解糖的制備一般有酸水解法和酶水解法兩種。國(guó)內(nèi)常用的是淀粉酸水解工藝，干淀粉加水調(diào)成一定濃度的淀粉乳，用鹽酸調(diào)用N aOH至PH 1.5 左右。然后

11、直接用蒸汽加熱，水解約25min,冷卻糖化液至80*C，調(diào)節(jié)PH 至4.05.0，使糖化液中的蛋白質(zhì)和其他膠體物質(zhì)沉淀析出。最后用粉末狀即得到淀粉水解液?；钚蕴棵撋?，在4560“C下過濾，（3）菌種擴(kuò)大培養(yǎng) 1）一級(jí)種子培養(yǎng)。采用液體培養(yǎng)基，由葡萄糖、玉米漿、尿素、磷酸氫二鉀、硫酸鎂、硫酸鐵及硫酸錳等組成，pH 為6.56.8，在三角瓶?jī)?nèi)32C振蕩培養(yǎng)12h,貯干4"C 冰箱備用。2) 二級(jí)種子培養(yǎng)。培養(yǎng)基除用水解糖代替葡萄糖外，其他與一級(jí)種子培養(yǎng)基相仿。在種子罐內(nèi)32C通氣攪拌培養(yǎng)710h,即可移種或冷卻至10“C備用。（4）谷氨酸發(fā)酵生產(chǎn)發(fā)酵初期，菌體生長(zhǎng)遲滯，24h

12、后即進(jìn)人對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，代謝旺盛，糖耗快，這時(shí)必須流加尿素以供給氮源并調(diào)節(jié)培養(yǎng)液的PH 至7.58.0，同時(shí)保持溫度為3032%C。本階段主要是菌體生長(zhǎng)，幾乎不產(chǎn)酸，菌體內(nèi)生物素含量由豐富轉(zhuǎn)為貧乏，時(shí)間約12h。隨后轉(zhuǎn)人谷氨酸合成階段，此時(shí)菌體濃度基本不變，糖與尿素分解后產(chǎn)生的a-酮戊二酸和氨主要用來(lái)合成谷氨酸。這一階段應(yīng)及時(shí)流加尿素以提供氨及維持谷氨酸合成的最適pH 7.27.4，需要大量通氣，并將溫度提高到谷氨酸合成的最適溫度34糖耗慢，殘?zhí)堑?，需減少流加尿素量。當(dāng)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)耗盡、37C。發(fā)酵后期，菌體衰老，谷氨酸濃度不再增加時(shí)，及時(shí)放罐。發(fā)酵周期約為30h。（5）谷氨酸提取谷氨酸提取有等電點(diǎn)法

13、、離子交換法、金屬鹽沉淀法、鹽酸鹽法和電滲析法，以及將上述方法結(jié)合使用的方法。國(guó)內(nèi)多采用的是等電點(diǎn)一一離子交換法。谷氨酸的等電點(diǎn)為3.22，這時(shí)它的溶解度最小，所以將發(fā)酵液用鹽酸調(diào)節(jié)到pH 3.22，谷氨酸就可析出結(jié)晶。晶核形成的溫度一般為2530"C，為促進(jìn)結(jié)晶，需加入a 型晶種育晶2h。等電點(diǎn)攪拌之后靜置沉降，再用離心法分離即可得到谷氨酸結(jié)晶。等電點(diǎn)法提取了發(fā)酵液中的大部分谷氨酸，剩余的谷氨酸可用離子交換法進(jìn)一步分離提純和濃縮回收。谷氨酸是兩性電解質(zhì)，故與陽(yáng)性或陰性樹脂均能進(jìn)行交換。當(dāng)溶液PH低于3.2時(shí)，谷氨酸帶正電，能與陽(yáng)離子樹脂進(jìn)行交換。目前國(guó)內(nèi)多用國(guó)產(chǎn)732 型強(qiáng)酸性陽(yáng)離

14、子交換樹脂來(lái)提取谷領(lǐng)酸，然后在65左右，用NOH 溶液洗脫，州3.0-7.0的洗脫液返回等電點(diǎn)法提取。3、維生素發(fā)酵生產(chǎn)維生素是人體生命活動(dòng)必需的要素，主要以輔酶或輔基的形式參與生物體各種生化反應(yīng)。維生素在醫(yī)療中具有重要作用。例如，維生素B族用于治療神經(jīng)炎、角服炎等多種炎癥，維生素D是治療佝僂病的重要藥物等。此外，維生素還應(yīng)用于畜牧業(yè)及飼料工業(yè)中。維生素的生產(chǎn)多采用化學(xué)合成法，后來(lái)人們發(fā)現(xiàn)某些微生物可以完成維生素合成中的某些重要步驟。在此基礎(chǔ)上，化學(xué)合成與生物轉(zhuǎn)化相結(jié)合的半合成法在維生素生產(chǎn)中得到了廣泛應(yīng)用。目前，可以用發(fā)酵法或半合成法生產(chǎn)的維生素有維生素C、BZ、Brz、D,以及P-胡蘿卜素

15、等。維生素C 又稱抗壞血酸，能參與人體內(nèi)多種代謝過程，使組織產(chǎn)生膠原質(zhì)，影響毛細(xì)血管的滲透性及血漿的凝固，刺激人體造血功能，增強(qiáng)機(jī)體的免疫力。另外，由于它具有較強(qiáng)的還原能力，可作為抗氧化劑，已在醫(yī)藥、食品工業(yè)等方面獲得廣泛應(yīng)用。維生素c 的化學(xué)合成方法一般指萊氏法，后來(lái)人們改用微生物脫氫代替化學(xué)合成中L-山梨糖中間產(chǎn)物的生成，使山梨糖的得率提高1倍。我國(guó)進(jìn)一步利用另一種微生物將L山梨糖轉(zhuǎn)化為2-酮基-L古龍酸，再經(jīng)化學(xué)轉(zhuǎn)化生產(chǎn)維生素c,稱為兩步法發(fā)酵工藝。這種方法使得維生素C 的產(chǎn)量得到大幅度提高，簡(jiǎn)單介紹如下:第一步發(fā)酵是生黑葡萄糖酸桿菌(Gluconobacter mel la nogenus ) 或弱氧化醋酸桿菌(Acetobacter suboxrydans) 經(jīng)過二級(jí)種子擴(kuò)大培養(yǎng)，種子液質(zhì)量達(dá)到轉(zhuǎn)種液標(biāo)準(zhǔn)時(shí)，將其轉(zhuǎn)移至含有山梨醇、玉米粉、磷酸鹽和碳酸鈣等組分的發(fā)酵培養(yǎng)基中，在