DNA測序 化學(xué)降解法

1、.DNA序列測定序列測定.脫氧核糖含氮堿基磷酸A G C TDNA的基本單位腺嘌呤鳥嘌呤胞嘧啶胸腺嘧啶. DNA測序：測定未知序列 確定重組DNA的方向與結(jié)構(gòu) 對突變進(jìn)行定位和鑒定 比較研究.成熟的DNA測序技術(shù)始于20世紀(jì)70年代中期。1977年Maxam 和Gilbert報道了通過化學(xué)降解測定DNA序列的方法。同一時期, Sanger發(fā)明了雙脫氧鏈終止法 20世紀(jì)90年代初出現(xiàn)的熒光自動測序技術(shù)將DNA測序帶入自動化測序的時代。這些技術(shù)統(tǒng)稱為第一代這些技術(shù)統(tǒng)稱為第一代DNADNA測序技術(shù)。測序技術(shù)。.第二代測序技術(shù)第二代測序技術(shù).三種第二代測序技術(shù)對比三種第二代測序技術(shù)對比測序技術(shù)4544

2、54SolexaSolexaSOLiDSOLiD上市時間200520072007價格（萬美元，2007）504559單次反應(yīng)數(shù)據(jù)量0.42050讀長（bp）40050*250優(yōu)勢長讀長低測序成本，高性價比高通量，高準(zhǔn)確度.第三代測序技術(shù)第三代測序技術(shù) 第二代測序技術(shù)在制備測序文庫的時候都需要經(jīng)過PCR擴(kuò)增，而這一PCR過程可能引入突變或者改變樣品中核酸分子的比例關(guān)系。另外，第二代測序的讀長普遍偏短，在進(jìn)行數(shù)據(jù)拼接時會遇到麻煩。為了克服這樣的缺點(diǎn)，業(yè)界發(fā)展出了以單分子實(shí)時測序和納米孔為標(biāo)志的第三代測序技術(shù)。 .Maxam-Gilbert DNA 化學(xué)降解法化學(xué)降解法基本原理：直接或間接特異性識別

3、4 種堿基特定化學(xué)試劑可對堿基進(jìn)行特異性修飾在修飾堿基處(5或3)打斷磷酸二酯鍵將一個 DNA 片段的 5 端磷酸基作放射性標(biāo)記，再分別采用不同的化學(xué)方法修飾和裂解特定堿基，從而產(chǎn)生一系列長度不一而 5 端被標(biāo)記的 DNA 片段，這些以特定堿基結(jié)尾的片段群通過凝膠電泳分離，再經(jīng)放射線自顯影，確定各片段末端堿基，從而得出目的 DNA 的堿基序列。操作步驟 將雙鏈DNA樣品變?yōu)閱捂?每個單鏈的同一方向末端都用放射性同位素標(biāo)記,以便顯示DNA條帶 分別用不同方法處理,獲得只差一個核苷酸的降解DNA群體 電泳,讀取DNA的核苷酸順序. 先用限制性內(nèi)切酶把DNA切成10200bp 的測序材料； 用堿性磷

4、酸化酶處理該片段，消除5末端上的磷酸； 在5OH端標(biāo)記 32P，用多核苷酸磷酸激酶催化； 標(biāo)記片段變性為單鏈； 用特異的化學(xué)試劑作用于不同的堿基進(jìn)行修飾，然后用哌啶甲酸切斷反應(yīng)堿基的多核苷酸鏈，緊接著用四組不同的特異反應(yīng)可以使末端標(biāo)記的DNA分子切成不同長度的片段， 產(chǎn)生一組其末端都是該特異堿基的長度不等的DNA片段； 經(jīng)電泳和放射性自顯影后，從4個反應(yīng)系統(tǒng)統(tǒng)一閱讀，待測DNA的全部核苷酸序列就可直接讀出.該反應(yīng)的關(guān)鍵在于使該反應(yīng)的關(guān)鍵在于使DNA的的4種核苷酸中，只有種核苷酸中，只有1-2種發(fā)生特種發(fā)生特異性的化學(xué)切割反應(yīng)：異性的化學(xué)切割反應(yīng)：堿基的特異性修飾；修飾的堿基從核糖環(huán)上轉(zhuǎn)移；失去

5、堿基的糖環(huán)部位發(fā)生DNA鏈斷裂。專門用來對核苷酸作化學(xué)修飾，并打斷磷酸二酯鍵的化學(xué)試劑有硫酸二甲酯（dimethylsulphate)和肼(hydrazine)、哌啶甲酸等。 . 肼，又稱聯(lián)氨 NH2.NH2 在堿性環(huán)境中作用于胞嘧啶C和胸腺嘧啶T的C4和C6位置導(dǎo)致糖苷鍵斷裂。 如果加入高濃度的鹽（1.5M NaCl），肼則主要作用于胞嘧啶C使之?dāng)嗔选?在高溫強(qiáng)堿作用(90,1.2M NaOH)下可使腺嘌呤A位點(diǎn)發(fā)生劇烈的斷裂反應(yīng),但對胞嘧啶C的反應(yīng)較弱哌啶甲酸(90,1mol/L)在修飾位點(diǎn)兩端使DNA的糖-磷酸鏈斷裂 胞嘧啶胸腺嘧啶. 硫酸二甲酯dimethyl sulphate ，DM

6、S ，（CH3O）2SO2： 一種堿性化學(xué)試劑，可以使DNA鏈上的腺嘌呤A的N2和鳥嘌呤G的N甲基化，但是鳥嘌呤G的N甲基化速度比腺嘌呤A的N2甲基化速度要快4-10倍，并且在中性pH環(huán)境中，DMS主要作用于鳥嘌呤G，使之甲基化，導(dǎo)致糖苷鍵斷裂。熱哌啶：使DNA鏈上的嘌呤在酸的作用下發(fā)生糖苷水解，導(dǎo)致DNA鏈在脫嘌呤位點(diǎn)（G和A）發(fā)生斷裂。.DNA化學(xué)降解反應(yīng)體系化學(xué)降解反應(yīng)體系反應(yīng)體系反應(yīng)體系 堿基修飾試劑堿基修飾試劑 堿基修飾反應(yīng)堿基修飾反應(yīng) 主鏈斷裂試劑主鏈斷裂試劑 斷裂點(diǎn)斷裂點(diǎn)G 硫酸二甲酯硫酸二甲酯 鳥嘌呤甲基化鳥嘌呤甲基化 六氫吡啶六氫吡啶 GG+A 甲酸甲酸 脫嘌呤作用脫嘌呤作用

7、 六氫吡啶六氫吡啶 G和和AC+T 肼肼 嘧啶開環(huán)嘧啶開環(huán) 六氫吡啶六氫吡啶 C和和TC 肼（加鹽）肼（加鹽） 胞嘧啶開環(huán)胞嘧啶開環(huán) 六氫吡啶六氫吡啶 C DMS（硫酸二甲酯）在（硫酸二甲酯）在中性中性pH環(huán)境，主要環(huán)境，主要作用于作用于G，被六氫吡啶作用而造成該，被六氫吡啶作用而造成該位點(diǎn)上位點(diǎn)上DNA鏈的斷裂。鏈的斷裂。 甲酸甲酸具有脫嘌呤作用。具有脫嘌呤作用。DNA鏈在脫嘌呤位點(diǎn)鏈在脫嘌呤位點(diǎn)(G和和A)發(fā)生斷裂。發(fā)生斷裂。 肼肼，在，在堿性條件下，作用于堿性條件下，作用于T胸腺嘧啶和胸腺嘧啶和C胞嘧啶胞嘧啶，在具有六氫吡啶的條件下，在具有六氫吡啶的條件下，導(dǎo)致在這個核苷酸位置上發(fā)生導(dǎo)致

8、在這個核苷酸位置上發(fā)生DNA鏈的斷裂。如果在反應(yīng)體系中加入鏈的斷裂。如果在反應(yīng)體系中加入高濃度的高濃度的鹽鹽，同胸腺嘧啶的反應(yīng)速率便會下降，主要作用于，同胸腺嘧啶的反應(yīng)速率便會下降，主要作用于C胞嘧啶胞嘧啶。A C 肼肼 90C, NaOH (1.2M) 斷裂反應(yīng). 在在4種反應(yīng)體系中，化學(xué)試劑特異地斷裂種反應(yīng)體系中，化學(xué)試劑特異地斷裂DNA的機(jī)的機(jī)制是：制是： G+A反應(yīng)反應(yīng)-（哌啶）甲酸使嘌呤環(huán)上氮原子質(zhì)子化，削（哌啶）甲酸使嘌呤環(huán)上氮原子質(zhì)子化，削弱了嘌呤脫氧核糖核苷酸和腺嘌呤脫氧核糖核苷酸的糖苷鍵，弱了嘌呤脫氧核糖核苷酸和腺嘌呤脫氧核糖核苷酸的糖苷鍵，然后哌啶置換了嘌呤。然后哌啶置換了

9、嘌呤。 G反應(yīng)反應(yīng)-硫酸二甲酯（硫酸二甲酯（DMS）使）使GN7甲基化，其后斷開甲基化，其后斷開了了C8-C9間的化學(xué)鍵，哌啶置換了被修飾鳥嘌呤與核糖的結(jié)合。間的化學(xué)鍵，哌啶置換了被修飾鳥嘌呤與核糖的結(jié)合。 T+C反應(yīng)反應(yīng)-肼斷開了嘧啶環(huán)，產(chǎn)生堿基片段被哌啶置換。肼斷開了嘧啶環(huán)，產(chǎn)生堿基片段被哌啶置換。 C反應(yīng)反應(yīng)-在在NaCl存在時，只有存在時，只有C才能與肼發(fā)生反應(yīng)，隨后，才能與肼發(fā)生反應(yīng)，隨后，被修飾的胞嘧啶被哌啶置換。被修飾的胞嘧啶被哌啶置換。. 在在4種反應(yīng)體系中，化學(xué)試劑特異地斷裂種反應(yīng)體系中，化學(xué)試劑特異地斷裂DNA的機(jī)制是：的機(jī)制是： G+A反應(yīng)反應(yīng)-（哌啶）甲酸使嘌呤環(huán)上氮原

10、子質(zhì)子化，削弱了嘌呤脫（哌啶）甲酸使嘌呤環(huán)上氮原子質(zhì)子化，削弱了嘌呤脫氧核糖核苷酸和腺嘌呤脫氧核糖核苷酸的糖苷鍵，然后哌啶置換了嘌呤。氧核糖核苷酸和腺嘌呤脫氧核糖核苷酸的糖苷鍵，然后哌啶置換了嘌呤。 G反應(yīng)反應(yīng)-硫酸二甲酯（硫酸二甲酯（DMS）使）使GN7甲基化，其后斷開了甲基化，其后斷開了C8-C9間間的化學(xué)鍵，哌啶置換了被修飾鳥嘌呤與核糖的結(jié)合。的化學(xué)鍵，哌啶置換了被修飾鳥嘌呤與核糖的結(jié)合。 T+C反應(yīng)反應(yīng)-肼斷開了嘧啶環(huán)，產(chǎn)生堿基片段被哌啶置換。肼斷開了嘧啶環(huán)，產(chǎn)生堿基片段被哌啶置換。 C反應(yīng)反應(yīng)-在在NaCl存在時，只有存在時，只有C才能與肼發(fā)生反應(yīng)，隨后，被修飾才能與肼發(fā)生反應(yīng)，隨后

11、，被修飾的胞嘧啶被哌啶置換。的胞嘧啶被哌啶置換。.哌啶.5 GATCACTACTG 3 標(biāo)記標(biāo)記5 *GATCACTACTG 3 G：DMSC：肼（加鹽）：肼（加鹽）G+A：甲酸：甲酸C+T：肼：肼5-*GATCACTACTG 5-*G G5-*GATCACTACTG 5-*GATCACTA 5-*GATCA5-*GA 5-*G 5-*GATCACTAC 5-*GATCACT 5-*GATCAC5-*GATC 5-*GAT 5-*GATCACTACT 5-*GATCACTACTG- 5-*GATCACTAC 5-*GATCAC5-*GATC -*GATCACTACTG- .在化學(xué)修飾反應(yīng)過程中

12、，通過在化學(xué)修飾反應(yīng)過程中，通過控制反應(yīng)溫度和反應(yīng)時間控制反應(yīng)溫度和反應(yīng)時間，只有只有一小部分堿基被修飾一小部分堿基被修飾(而不是全部被修飾而不是全部被修飾)，隨后進(jìn)，隨后進(jìn)行的斷裂反應(yīng)也是行的斷裂反應(yīng)也是定量反應(yīng)定量反應(yīng)。因此，。因此，DNA鏈并不是在所鏈并不是在所有可被修飾的堿基位點(diǎn)斷裂，而是有可被修飾的堿基位點(diǎn)斷裂，而是隨機(jī)斷裂隨機(jī)斷裂。在。在4個反應(yīng)個反應(yīng)中，產(chǎn)生中，產(chǎn)生4套帶相同標(biāo)記末端、長短不一的寡聚核苷酸片套帶相同標(biāo)記末端、長短不一的寡聚核苷酸片段。段。只有帶標(biāo)記末端的片段可被識別只有帶標(biāo)記末端的片段可被識別，沒有標(biāo)記末端的，沒有標(biāo)記末端的片段可以忽略不計。片段可以忽略不計。.、

13、 在化學(xué)修飾反應(yīng)過程中，通過在化學(xué)修飾反應(yīng)過程中，通過控制反應(yīng)溫度和反應(yīng)時間控制反應(yīng)溫度和反應(yīng)時間，只有，只有一小一小部分堿基被修飾部分堿基被修飾(而不是全部被修飾而不是全部被修飾)，隨后進(jìn)行的斷裂反應(yīng)也是，隨后進(jìn)行的斷裂反應(yīng)也是定量反定量反應(yīng)應(yīng)。因此，。因此，DNA鏈并不是在所有可被修飾的堿基位點(diǎn)斷裂，而是鏈并不是在所有可被修飾的堿基位點(diǎn)斷裂，而是隨機(jī)隨機(jī)斷裂斷裂。在。在4個反應(yīng)中，產(chǎn)生個反應(yīng)中，產(chǎn)生4套帶相同標(biāo)記末端、長短不一的寡聚核苷酸套帶相同標(biāo)記末端、長短不一的寡聚核苷酸片段。片段。只有帶標(biāo)記末端的片段可被識別只有帶標(biāo)記末端的片段可被識別，沒有標(biāo)記末端的片段可以忽略，沒有標(biāo)記末端的片段

14、可以忽略不計。不計。.電泳和讀譜電泳和讀譜具體的測定過程中，首先將3端或5端的雙鏈DNA溶解在總體積為50L的、分別含有0.03mol/LNaOH、10%甘油、1mmol/L EDTA、0.05%二甲苯藍(lán)和0.05%溴甲酚藍(lán)的溶液中，使雙鏈DNA變性。然后加到由5%10%的丙烯酰胺、0.16%0.33%的雙丙烯酰胺、50mmol/LTris-硼酸、pH8.3的1mmol/L EDTA組成的凝膠板上，進(jìn)行電泳和放射性自顯影等處理，制得一端帶標(biāo)記的單鏈DNA。.電泳檢測電泳檢測-310.步驟：毛細(xì)管灌膠.步驟：樣品盤移動.步驟：電進(jìn)樣及電泳.步驟：熒光激發(fā)及檢測.化學(xué)法讀序的方法化學(xué)法讀序的方法

15、化學(xué)法測序放射自顯影圖譜的識讀，比較復(fù)雜一些，這是因?yàn)榛瘜W(xué)裂化學(xué)法測序放射自顯影圖譜的識讀，比較復(fù)雜一些，這是因?yàn)榛瘜W(xué)裂解反應(yīng)并不完全是堿基特異性的，每組測序圖譜為解反應(yīng)并不完全是堿基特異性的，每組測序圖譜為4或或5條垂直的階梯帶，條垂直的階梯帶，AC反應(yīng)可以不做。該片從膠底部一個個向頂部讀，反應(yīng)可以不做。該片從膠底部一個個向頂部讀，G+A和和C+T兩列中含兩列中含有所有相差一個堿基的有所有相差一個堿基的DNA片段。片段。如果如果G+A中出現(xiàn)中出現(xiàn)1條帶就看條帶就看G列中是否列中是否有同樣大小的帶，若有即為有同樣大小的帶，若有即為G堿基，無則為堿基，無則為A堿基；同理，堿基；同理，C+T中則檢

16、查中則檢查C列中有無同樣大小條帶，有即為列中有無同樣大小條帶，有即為C，無則為，無則為T。在做了在做了AC反應(yīng)時，出現(xiàn)反應(yīng)時，出現(xiàn)較深的帶時，可以幫助確定為較深的帶時，可以幫助確定為A堿基?；瘜W(xué)法必須堿基?；瘜W(xué)法必須4或或5個反應(yīng)管統(tǒng)一閱讀，個反應(yīng)管統(tǒng)一閱讀，DNA中中4個堿基每個位置都有個堿基每個位置都有1個相應(yīng)的片段，待測的個相應(yīng)的片段，待測的DNA全部序列可直全部序列可直接讀出。接讀出。 化學(xué)法測序采用化學(xué)法測序采用32P標(biāo)記標(biāo)記DNA進(jìn)行，條帶會較末端法更模糊，更寬，進(jìn)行，條帶會較末端法更模糊，更寬，由于分辨率不足，從單塊凝膠上能得到可靠序列數(shù)量約為由于分辨率不足，從單塊凝膠上能得到可

17、靠序列數(shù)量約為200-300bp以內(nèi)。以內(nèi)。.聚丙烯酰胺凝膠電聚丙烯酰胺凝膠電泳將泳將DNADNA鏈按長短鏈按長短分開分開, ,根據(jù)放射自根據(jù)放射自顯影顯示區(qū)帶，直顯影顯示區(qū)帶，直接讀出接讀出DNADNA的核苷的核苷酸序列。酸序列。如果如果G+A中出現(xiàn)中出現(xiàn)1條帶就看條帶就看G列中是列中是否有同樣大小的帶，否有同樣大小的帶，若有即為若有即為G堿基，堿基，無則為無則為A堿基；同堿基；同理，理，C+T中則檢查中則檢查C列中有無同樣大列中有無同樣大小條帶，有即為小條帶，有即為C，無則為無則為T。.在做了在做了AC反應(yīng)反應(yīng)時，出現(xiàn)時，出現(xiàn)較深的帶較深的帶時，可以時，可以幫助確定幫助確定為為A堿基。堿基。.DNA序列測定的應(yīng)用序列測定的應(yīng)用1) 測序測序 PCR克隆測序驗(yàn)證 突變體檢測 新基因測序 全基因組測序 系統(tǒng)發(fā)育及物種鑒定2) 2) 片段分離片段分離 個體識別：親緣鑒定 SNP關(guān)聯(lián)分析 疾病診斷等.Maxam-Gilbert化學(xué)降解法的測序長度約250bp 優(yōu)點(diǎn)：不需要進(jìn)行酶催化反應(yīng)，因此不會產(chǎn)生由于酶催化反應(yīng)而帶來的誤差；對未經(jīng)克隆的 DNA 片段可