溶菌酶試驗(yàn)綜合型實(shí)驗(yàn)(實(shí)驗(yàn)報告定稿)

1、第1章 引言生化技術(shù)重要理論蛋白質(zhì)提取分離技術(shù) 以蛋白質(zhì)和結(jié)構(gòu)與功能為基礎(chǔ)，從分子水平上認(rèn)識生命現(xiàn)象，已經(jīng)成為現(xiàn)代生物學(xué)發(fā)展的主要方向，研究蛋白質(zhì)，首先要得到高度純化并具有生物活性的目的物質(zhì)。蛋白質(zhì)的制備工作涉及物理、化學(xué)和生物等各方面知識，但基本原理不外乎兩方面。一是得用混合物中幾個組分分配率的差別，把它們分配到可用機(jī)械方法分離的兩個或幾個物相中，如鹽析，有機(jī)溶劑提取，層析和結(jié)晶等；二是將混合物置于單一物相中，通過物理力場的作用使各組分分配于來同區(qū)域而達(dá)到分離目的，如電泳，超速離心，超濾等。在所有這些方法的應(yīng)用中必須注意保存生物大分子的完整性，防止酸、鹼、高溫，劇烈機(jī)械作用而導(dǎo)致所提物質(zhì)生物

2、活性的喪失。蛋白質(zhì)的制備一般分為以下四個階段：選擇材料和預(yù)處理，細(xì)胞的破碎及細(xì)胞器的分離，提取和純化，濃細(xì)、干燥和保存。 微生物、植物和動物都可做為制備蛋白質(zhì)的原材料，所選用的材料主要依據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康膩泶_定。對于微生物，應(yīng)注意它的生長期，在微生物的對數(shù)生長期，酶和核酸的含量較高，可以獲得高產(chǎn)量，以微生物為材料時有兩種情況：（1）得用微生物菌體分泌到培養(yǎng)基中的代謝產(chǎn)物和胞外酶等；（2）利用菌體含有的生化物質(zhì)，如蛋白質(zhì)、核酸和胞內(nèi)酶等。植物材料必須經(jīng)過去殼，脫脂并注意植物品種和生長發(fā)育狀況不同，其中所含生物大分子的量變化很大，另外與季節(jié)性關(guān)系密切。對動物組織，必須選擇有效成份含量豐富的臟器組織為原材料

3、，先進(jìn)行絞碎、脫脂等處理。另外，對預(yù)處理好的材料，若不立即進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，應(yīng)冷凍保存，對于易分解的生物大分子應(yīng)選用新鮮材料制備。1蛋白質(zhì)的分離純化 1.1蛋白質(zhì)（包括酶）的提取 大部分蛋白質(zhì)都可溶于水、稀鹽、稀酸或堿溶液，少數(shù)與脂類結(jié)合的蛋白質(zhì)則溶于乙醇、丙酮、丁醇等有機(jī)溶劑中，因些，可采用不同溶劑提取分離和純化蛋白質(zhì)及酶。 1.1.1水溶液提取法稀鹽和緩沖系統(tǒng)的水溶液對蛋白質(zhì)穩(wěn)定性好、溶解度大、是提取蛋白質(zhì)最常用的溶劑，通常用量是原材料體積的1-5倍，提取時需要均勻的攪拌，以利于蛋白質(zhì)的溶解。提取的溫度要視有效成份性質(zhì)而定。一方面，多數(shù)蛋白質(zhì)的溶解度隨著溫度的升高而增大，因此，溫度高利于溶解，縮短

4、提取時間。但另一方面，溫度升高會使蛋白質(zhì)變性失活，因此，基于這一點(diǎn)考慮提取蛋白質(zhì)和酶時一般采用低溫（5度以下）操作。為了避免蛋白質(zhì)提以過程中的降解，可加入蛋白水解酶抑制劑（如二異丙基氟磷酸，碘乙酸等）。下面著重討論提取液的pH值和鹽濃度的選擇。(1) pH值蛋白質(zhì)，酶是具有等電點(diǎn)的兩性電解質(zhì)，提取液的pH值應(yīng)選擇在偏離等電點(diǎn)兩側(cè)的pH 范圍內(nèi)。用稀酸或稀堿提取時，應(yīng)防止過酸或過堿而引起蛋白質(zhì)可解離基團(tuán)發(fā)生變化，從而導(dǎo)致蛋白質(zhì)構(gòu)象的不可逆變化，一般來說，堿性蛋白質(zhì)用偏酸性的提取液提取，而酸性蛋白質(zhì)用偏堿性的提取液。(2) 鹽濃度 稀濃度可促進(jìn)蛋白質(zhì)的溶，稱為鹽溶作用。同時稀鹽溶液因鹽離子與蛋白質(zhì)

5、部分結(jié)合，具有保護(hù)蛋白質(zhì)不易變性的優(yōu)點(diǎn)，因此在提取液中加入少量NaCl等中性鹽，一般以0.15摩爾。升濃度為宜。緩沖液常采用0.02-0.05M磷酸鹽和碳酸鹽等滲鹽溶液。 1.1.2有機(jī)溶劑提取法 一些和脂質(zhì)結(jié)合比較牢固或分子中非極性側(cè)鏈較多的蛋白質(zhì)和酶，不溶于水、稀鹽溶液、稀酸或稀堿中，可用乙醇、丙酮和丁醇等有機(jī)溶劑，它們具的一定的親水性，還有較強(qiáng)的親脂性、是理想的提脂蛋白的提取液。但必須在低溫下操作。丁醇提取法對提取一些與脂質(zhì)結(jié)合緊密的蛋白質(zhì)和酶特別優(yōu)越，一是因?yàn)槎〈加H脂性強(qiáng)，特別是溶解磷脂的能力強(qiáng)；二是丁醇兼具親水性，在溶解度范圍內(nèi)不會引起酶的變性失活。另外，丁醇提取法的pH及溫度選擇范

6、圍較廣，也適用于動植物及微生物材料。 1.2 蛋白質(zhì)的分離純化 蛋白質(zhì)的分離純化方法很多，主要有： 1.2 .1. 根據(jù)蛋白質(zhì)溶解度不同的分離方法 1.2.1.1蛋白質(zhì)的鹽析中性鹽對蛋白質(zhì)的溶解度有顯著影響，一般在低鹽濃度下隨著鹽濃度升高，蛋白質(zhì)的溶解度增加，此稱鹽溶；當(dāng)鹽濃度繼續(xù)升高時，蛋白質(zhì)的溶解度不同程度下降并先后析出，這種現(xiàn)象稱鹽析，將大量鹽加到蛋白質(zhì)溶液中，高濃度的鹽離子（如硫酸銨的SO4和NH4)有很強(qiáng)的水化力，可奪取蛋白質(zhì)分子的水化層，使之“失水”，于是蛋白質(zhì)膠粒凝結(jié)并沉淀析出。鹽析時若溶液pH在蛋白質(zhì)等電點(diǎn)則效果更好。由于各種蛋白質(zhì)分子顆粒大小、親水程度不同，故鹽析所需的鹽濃度

7、也不一樣，因此調(diào)節(jié)混合蛋白質(zhì)溶液中的中性鹽濃度可使各種蛋白質(zhì)分段沉淀。影響鹽析的因素有：（1）溫度：除對溫度敏感的蛋白質(zhì)在低溫（4度）操作外，一般可在室溫中進(jìn)行。一般溫度低蛋白質(zhì)溶介度降低。但有的蛋白質(zhì)（如血紅蛋白、肌紅蛋白、清蛋白）在較高的溫度（25度）比0度時溶解度低，更容易鹽析。（2）pH值：大多數(shù)蛋白質(zhì)在等電點(diǎn)時在濃鹽溶液中的溶介度最低。（3）蛋白質(zhì)濃度：蛋白質(zhì)濃度高時，欲分離的蛋白質(zhì)常常夾雜著其他蛋白質(zhì)地一起沉淀出來（共沉現(xiàn)象）。因此在鹽析前血清要加等量生理鹽水稀釋，使蛋白質(zhì)含量在2.5-3.0%。蛋白質(zhì)鹽析常用的中性鹽，主要有硫酸銨、硫酸鎂、硫酸鈉、氯化鈉、磷酸鈉等。 其中應(yīng)用最多

8、的硫酸銨，它的優(yōu)點(diǎn)是溫度系數(shù)小而溶解度大（25度時飽和溶液為4.1M，即767克/升；0度時飽和溶解度為3.9M，即676克/升），在這一溶解度范圍內(nèi)，許多蛋白質(zhì)和酶都可以鹽析出來；另外硫酸銨分段鹽析效果也比其他鹽好，不易引起蛋白質(zhì)變性。硫酸銨溶液的pH常在4.5-5.5之間，當(dāng)用其他pH值進(jìn)行鹽析時，需用硫酸或氨水調(diào)節(jié)。蛋白質(zhì)在用鹽析沉淀分離后，需要將蛋白質(zhì)中的鹽除去，常用的辦法是透析，即把蛋白質(zhì)溶液裝入秀析袋內(nèi)（常用的是玻璃紙），用緩沖液進(jìn)行透析，并不斷的更換緩沖液，因透析所需時間較長，所以最好在低溫中進(jìn)行。此外也可用葡萄糖凝膠G-25或G-50過柱的辦法除鹽，所用的時間就比較短。 1.2

9、.1.2 等電點(diǎn)沉淀法 蛋白質(zhì)在靜電狀態(tài)時顆粒之間的靜電斥力最小，因而溶解度也最小，各種蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)有差別，可利用調(diào)節(jié)溶液的pH達(dá)到某一蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)使之沉淀，但此法很少單獨(dú)使用，可與鹽析法結(jié)合用。 1.2.1.3低溫有機(jī)溶劑沉淀法 用與水可混溶的有機(jī)溶劑，甲醇，乙醇或丙酮，可使多數(shù)蛋白質(zhì)溶解度降低并析出，此法分辨力比鹽析高，但蛋白質(zhì)較易變性，應(yīng)在低溫下進(jìn)行。 1.2.2 根據(jù)蛋白質(zhì)分子大小的差別的分離方法 1.2.2.1 透析與超濾 透析法是利用半透膜將分子大小不同的蛋白質(zhì)分開。超濾法是利用高壓力或離心力，強(qiáng)使水和其他小的溶質(zhì)分子通過半透膜，而蛋白質(zhì)留在膜上，可選擇不同孔徑的膜截留不同分子

10、量的蛋白質(zhì)。 1.2.2.2 凝膠過濾法 也稱分子排阻層析或分子篩層析，這是根據(jù)分子大小分離蛋白質(zhì)混合物最有效的方法之一。柱中最常用的填充材料是葡萄糖凝膠（Sephadex gel）和瓊脂糖凝膠（agarose gel）。 1.2.3根據(jù)蛋白質(zhì)帶電性質(zhì)進(jìn)行分離 蛋白質(zhì)在不同pH環(huán)境中帶電性質(zhì)和電荷數(shù)量不同，可將其分開。 1.2.3.1電泳法各種蛋白質(zhì)在同一pH條件下，因分子量和電荷數(shù)量不同而在電場中的遷移率不同而得以分開。值得重視的是等電聚焦電泳，這是利用一種兩性電解質(zhì)作為載體，電泳時兩性電解質(zhì)形成一個由正極到負(fù)極逐漸增加的pH梯度，當(dāng)帶一定電荷的蛋白質(zhì)在其中泳動時，到達(dá)各自等電點(diǎn)的pH位置就

11、停止，此法可用于分析和制備各種蛋白質(zhì)。 1.2.3.2 離子交換層析法離子交換劑有陽離子交換劑（如：羧甲基纖維素；CM-纖維素）和陰離子交換劑（二乙氨基乙基纖維素；DEAE?FONT FACE="宋體" LANG="ZH-CN">纖維素），當(dāng)被分離的蛋白質(zhì)溶液流經(jīng)離子交換層析柱時，帶有與離子交換劑相反電荷的蛋白質(zhì)被吸附在離子交換劑上，隨后用改變pH或離子強(qiáng)度辦法將吸附的蛋白質(zhì)洗脫下來。1.2.4 根據(jù)配體特異性的分離方法親和色譜法 親和層析法（aflinity chromatography）是分離蛋白質(zhì)的一種極為有效的方法，它經(jīng)常只需經(jīng)過一步處理即

12、可使某種待提純的蛋白質(zhì)從很復(fù)雜的蛋白質(zhì)混合物中分離出來，而且純度很高。這種方法是根據(jù)某些蛋白質(zhì)與另一種稱為配體(Ligand）的分子能特異而非共價地結(jié)合。其基本原理：蛋白質(zhì)在組織或細(xì)胞中是以復(fù)雜的混合物形式存在，每種類型的細(xì)胞都含有上千種不同的蛋白質(zhì)，因此蛋白質(zhì)的分離（Separation），提純（Purification）和鑒定（Characterization）是生物化學(xué)中的重要的一部分，至今還沒的單獨(dú)或一套現(xiàn)成的方法能移把任何一種蛋白質(zhì)從復(fù)雜的混合蛋白質(zhì)中提取出來，因此往往采取幾種方法聯(lián)合使用。 1.3細(xì)胞的破碎 1.3.1 高速組織搗碎：將材料配成稀糊狀液，放置于筒內(nèi)約1/3體積，蓋緊

13、筒蓋，將調(diào)速器先撥至最慢處，開動開關(guān)后，逐步加速至所需速度。此法適用于動物內(nèi)臟組織、植物肉質(zhì)種子等。 1.3.2玻璃勻漿器勻漿：先將剪碎的組織置于管中，再套入研桿來回研磨，上下移動，即可將細(xì)胞研碎，此法細(xì)胞破碎程度比高速組織搗碎機(jī)為高，適用于量少和動物臟器組織。 1.3.3超聲波處理法：用一定功率的超聲波處理細(xì)胞懸液，使細(xì)胞急劇震蕩破裂，此法多適用于微生物材料，用大腸桿菌制備各種酶，常選用50-100毫克菌體/毫升濃度，在1KG至10KG頻率下處理10-15分鐘，此法的缺點(diǎn)是在處理過程會產(chǎn)生大量的熱，應(yīng)采取相應(yīng)降溫措施。對超聲波敏感和核酸應(yīng)慎用。 1.3.4反復(fù)凍融法：將細(xì)胞在-20度以下冰凍

14、，室溫融解，反復(fù)幾次，由于細(xì)胞內(nèi)冰粒形成和剩余細(xì)胞液的鹽濃度增高引起溶脹，使細(xì)胞結(jié)構(gòu)破碎。 1.3.5 化學(xué)處理法：有些動物細(xì)胞，例如腫瘤細(xì)胞可采用十二烷基磺酸鈉（SDS）、去氧膽酸鈉等細(xì)胞膜破壞，細(xì)菌細(xì)胞壁較厚，可采用溶菌酶處理效果更好。無論用哪一種方法破碎組織細(xì)胞，都會使細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)或核酸水解酶釋放到溶液中，使大分子生物降解，導(dǎo)致天然物質(zhì)量的減少，加入二異丙基氟磷酸（DFP）可以抑制或減慢自溶作用；加入碘乙酸可以抑制那些活性中心需要有疏基的蛋白水解酶的活性，加入苯甲磺酰氟化物（PMSF）也能清除蛋白水解酥活力，但不是全部，還可通過選擇pH、溫度或離子強(qiáng)度等，使這些條件都要適合于目的物質(zhì)的提

15、取。 1.4濃縮、干燥及保存 1.4.1 樣品的濃縮 生物大分子在制備過程中由于過柱純化而樣品變得很稀，為了保存和鑒定的目的，往往需要進(jìn)行濃縮。常用的濃縮方法的：1.4.1.1減壓加溫蒸發(fā)濃縮通過降低液面壓力使液體沸點(diǎn)降低，減壓的真空度愈高，液體沸點(diǎn)降得愈低，蒸發(fā)愈快，此法適用于一些不耐熱的生物大分子的濃縮。1.4.1.2空氣流動蒸發(fā)濃縮 空氣的流動可使液體加速蒸發(fā)，鋪成薄層的溶液，表面不斷通過空氣流；或?qū)⑸锎蠓肿尤芤貉b入透析袋內(nèi)置于冷室，用電扇對準(zhǔn)吹風(fēng)，使透過膜外的溶劑不沁蒸發(fā)，而達(dá)到濃縮目的，此法濃縮速度慢，不適于大量溶液的濃縮。1.4.1.3. 冰凍法 生物大分子在低溫結(jié)成冰，鹽類及生

16、物大分子不進(jìn)入冰內(nèi)而留在液相中，操作時先將待濃縮的溶液冷卻使之變成固體，然后緩慢地融解，利用溶劑與溶質(zhì)融點(diǎn)介點(diǎn)的差別而達(dá)到除去大部分溶劑的目的。如蛋白質(zhì)和酶的鹽溶液用此法濃縮時，不含蛋白質(zhì)和酶的純冰結(jié)晶浮于液面，蛋白質(zhì)和酶則集中于下層溶液中，移去上層冰塊，可得蛋白質(zhì)和酶的濃縮液。1.4.1.4. 吸收法 通過吸收劑直接收除去溶液中溶液分子使之濃縮。所用的吸收劑必需與溶液不起化學(xué)反應(yīng)，對生物大分子不吸附，易與溶液分開。常用的吸收劑有聚乙二醇，聚乙稀吡咯酮、蔗糖和凝膠等，使用聚乙二醇吸收劑時，先將生物大分子溶液裝入半透膜的袋里，外加聚乙二醇復(fù)蓋置于4度下，袋內(nèi)溶劑滲出即被聚乙二醇迅速吸去，聚乙二醇

17、被水飽和后要更換新的直至達(dá)到所需要的體積。1.4.1.5. 超濾法 超濾法是使用一種特別的薄膜對溶液中各種溶質(zhì)分子進(jìn)行選擇性過濾的方法，不液體在一定壓力下（氮?dú)鈮夯蛘婵毡脡海┩ㄟ^膜時，溶劑和小分子透過，大分子受阻保留，這是近年來發(fā)展起來的新方法，最適于生物大分子尤其是蛋白質(zhì)和酶的濃縮或脫鹽，并具有成本低，操作方便，條件溫和，能較好地保持生物大分子的活性，回收率高等優(yōu)點(diǎn)。應(yīng)用超濾法關(guān)鍵在于膜的選擇，不同類型和規(guī)格的膜，水的流速，分子量截止值（即大體上能被膜保留分子最小分子量值）等參數(shù)均不同，必須根據(jù)工作需要來選用。另外，超濾裝置形式，溶質(zhì)成份及性質(zhì)、溶液濃度等都對超濾效果的一定影響。Diaflo

18、 超濾膜的分子量截留值： 膜名稱 分子量截留值 孔的大的平均直徑 XM300 300，000 140 XM200 100，000 55 XM50 50，000 30 PM30 30，000 22 UM20 20，000 18 PM10 10，000 15 UM2 1，000 12 UM05 500 10 用上面的超濾膜制成空心的纖維管，將很多根這樣的管攏成一束，管的兩端與低離子強(qiáng)度的緩沖液相連，使緩沖液不斷地在管中流動。然后將纖維管浸入待透析的蛋白質(zhì)溶液中。當(dāng)緩沖液流過纖維管時，則小分子很易透過膜而擴(kuò)散，大分子則不能。這就是纖維過濾秀析法，由于透析面積增大，因而使透析時間縮短10倍。 1.4.

19、2 干燥 生物大分子制備得到產(chǎn)品，為防止變質(zhì)，易于保存，常需要干燥處理，最常用的方法是冷凍干燥和真空干燥。真空干燥適用于不耐高溫，易于氧化物質(zhì)的干燥和保存，整個裝置包括干燥器、冷凝器及真空干燥原理外，同時增加了溫度因素。在相同壓力下，水蒸汽壓隨溫度下降而下降，故在低溫低壓下，冰很易升華為氣體。操作時一般先將待干燥的液體冷凍到冰點(diǎn)以下使之變成固體，然后在低溫低壓下將溶劑變成氣體而除去。此法干后的產(chǎn)品具有疏松、溶解度好、保持天然結(jié)構(gòu)等優(yōu)點(diǎn)，適用于各類生物大分子的干燥保存。 1.4.3貯存 生物大分子的穩(wěn)定性與保存方法的很大關(guān)系。干燥的制品一般比較穩(wěn)定，在低溫情況下其活性可在數(shù)日甚至數(shù)年無明顯變化，

20、貯藏要求簡單，只要將干燥的樣品置于干燥器內(nèi)（內(nèi)裝有干燥劑）密封，保持04度冰箱即可，液態(tài)貯藏時應(yīng)注意以下幾點(diǎn)：1.4.3.1.樣品不能太稀，必須濃縮到一定濃度才能封裝貯藏，樣品太稀易使生物大分子變性。1.4.3.2.一般需加入防腐劑和穩(wěn)定劑，常用的防腐劑有甲苯、苯甲酸、氯仿、百里酚等。蛋白質(zhì)和酶常用的穩(wěn)定劑有硫酸銨糊、蔗糖、甘油等，如酶也可加入底物和輔酶以提高其穩(wěn)定性。此外，鈣、鋅、硼酸等溶液對某些酶也有一定保護(hù)作用。核酸大分子一般保存在氯化鈉或檸檬酸鈉的標(biāo)準(zhǔn)緩沖液中。1.4.3.3.貯藏溫度要求低，大多數(shù)在0度左右冰箱保存，有的則要求更低，應(yīng)視不同物質(zhì)而定。2.柱層析技術(shù)2.1概述柱層析技術(shù)

21、也稱柱色譜技術(shù)。一根柱子里先填充不溶性基質(zhì)形成固定相，將蛋白質(zhì)混合樣品加到柱子上后用特別的溶劑洗脫，溶劑組成流動相。在樣品從柱子上洗脫下來的過程中，根據(jù)蛋白質(zhì)混合物中各組分在固定向和流動相中的分配系數(shù)不同經(jīng)過多次反復(fù)分配，將不同蛋白組分逐一分離。 根據(jù)填充基質(zhì)和樣品分配交換原理不同，離子交換層析，凝膠過濾層析和親和層析是三種分離蛋白質(zhì)的經(jīng)典層析技術(shù)。 在利用柱層析技術(shù)分離提取蛋白質(zhì)的過程中，主要有以下幾個方面的流程。2.1.1 柱層析操作方法的選擇 目前 ，柱色譜分離的操作方式 ，主要包括常壓分離、 減壓分離和加壓分離 3種模式。常壓分離是最簡單的分離模式方便、 簡單 ，但是洗脫時間長。減壓分

22、離盡管能節(jié)省填料的使用量 ，但是由于大量的空氣通過填料會使溶劑揮發(fā) ，并且有時在柱子外面會有水汽凝結(jié) ，以及有些易分解的化合物也難以得到 ，而且還必須同時使用水泵或真空泵抽氣。加壓分離可以加快淋洗劑的流動速度 ，縮短樣品的洗脫時間 ，是一種比較好的方法 ，與常壓柱類似 ，只不過外加壓力使淋洗液更快洗脫。壓力的提供可以是壓縮空氣 ，雙連球或者小氣泵等。2.1.2 柱子規(guī)格的選擇市場上有各種規(guī)格的柱層析分離柱。柱子長了 ，相應(yīng)的塔板數(shù)就高 ，分離就好。目前市場上的柱子 ，其徑高比一般在1: 510范圍 ，在實(shí)際使用時 ，填料量一般是樣品量的 3040倍 ，具體的選擇要根據(jù)樣品的性質(zhì)和含量進(jìn)行具體分

23、析。如果所需組分和雜質(zhì)的分離度較大 ，就可以減少填料量 ，使用內(nèi)徑相對較小的柱子 (如 2 cm × 20 cm的柱子 ) ;如果 Rf相差不到 0.1，就要加大柱子 ，增加填料量 ，比如用 3 cm內(nèi)徑的柱子。2.1.3 裝柱柱層析色譜柱的填裝主要有濕法和干法兩種 ，濕法省事 ，一般用淋洗劑溶解樣品 ，也可以用二氯甲烷、 乙酸乙酯等 ，但溶劑越少越好 ，不然溶劑就成了淋洗劑了。柱子底端的活塞一定不要涂潤滑劑 ，否則會被淋洗劑帶到淋洗液中 ，可以采用聚四氟乙烯材料的閥門。干法和濕法裝柱沒什么實(shí)質(zhì)性差別，只要能把柱子裝實(shí)就行。裝完的柱子應(yīng)該有適度的緊密(太密了淋洗劑流速太慢 ) ，并且

24、一定要均勻 ，不然樣品就會從一側(cè)斜著流動。同時柱中不能有大氣泡 ，大多數(shù)情況下有些小氣泡沒太大的影響 ，因?yàn)橹灰訅簹馀菥涂上?。但是柱子更忌諱的是開裂 ，開裂會影響分離效果 ，甚至報廢。2.1.4 溶劑的選擇選擇一個合適的溶劑系統(tǒng)是柱層析分離的關(guān)鍵。在選用柱層析洗脫劑時首先要考慮三個方面的因素:溶解性 ( Solubil2ity)、 親合性 (Affinity)和分離度 (Res oluti on)。溶劑應(yīng)選擇價廉、 安全、 環(huán)保的 ，可以考慮石油醚、 乙酸乙酯、 二氯甲烷、 乙醚、 甲醇和正己烷等等。但正己烷價格較高 ，乙醚很易揮發(fā) ，二氯甲烷和甲醇與硅膠的吸附是一個放熱過程 ，易使柱子產(chǎn)

25、生氣泡。其他的溶劑用的相對較少 ，要依不同需要選擇。另外值得一提的是 ，由于我們進(jìn)行的是痕量分析 ，淋洗劑的純度必須關(guān)注 ，一般使用農(nóng)藥殘留級或 HPLC級的 ，如果是分析純的必須進(jìn)行精制。同時溶劑在過柱后最好回收使用 ，一方面環(huán)保 ，另一方面也能節(jié)省部分經(jīng)費(fèi)。2.1.5 上樣用少量的溶劑溶解樣品加樣 ，加完后將底端的活塞打開 ，待溶劑層下降至石英砂面時 ，再加少量的低極性溶劑 ，然后再打開活塞 ，如此兩三次 ，一般石英砂就基本是白色的了。加入淋洗劑 ，一開始不要加壓 ，等溶解樣品的溶劑和樣品層有一段距離 (24 cm) ，再加壓 ，這樣避免了溶劑 (如二氯甲烷等 )夾帶樣品快速下行。很多樣品

26、在上柱前粘性較大 ，上樣后在柱上又會析出 ，這一般都是比較大量的樣品才會出現(xiàn) ，是因?yàn)樘盍蠈悠返奈斤柡退隆Ｓ行悠啡芙庑圆?，能溶解的溶?(比如 DMF，DMSO等)又不能上柱 ，這樣就必須用干法上柱了。2.1.6 淋洗液的收集和濃縮用硅膠作固定相過柱子的原理是一個吸附與解吸的平衡。如果樣品與硅膠的吸附比較強(qiáng)的話 ，就不容易流出 ，這時可以采用氧化鋁作固定相。柱層析后的淋洗液 ，由于使用了較多的溶劑 ，必須進(jìn)行濃縮 ，如果待測物具有一定的揮發(fā)性 ，最好使用常壓揮發(fā)溶劑 ，否則易導(dǎo)致檢測結(jié)果偏低。2.2 離子交換層析 離子交換層析（Ion Exchange Chromatography簡稱

27、為IEC）是以離子交換劑為固定相，依據(jù)流動相中的組分離子與交換劑上的平衡離子進(jìn)行可逆交換時的結(jié)合力大小的差別而進(jìn)行分離的一種層析方法。1848年，Thompson等人在研究土壤堿性物質(zhì)交換過程中發(fā)現(xiàn)離子交換現(xiàn)象。本世紀(jì)40年代，出現(xiàn)了具有穩(wěn)定交換特性的聚苯乙烯離子交換樹脂。50年代，離子交換層析進(jìn)入生物化學(xué)領(lǐng)域，應(yīng)用于氨基酸的分析。目前離子交換層析仍是生物化學(xué)領(lǐng)域中常用的一種層析方法，廣泛的應(yīng)用于各種生化物質(zhì)如氨基酸、蛋白、糖類、核苷酸等的分離純化。常用的離子交換劑有：離子交換纖維素、離子交換葡聚糖和離子交換樹脂 。 離子交換層析中，基質(zhì)是由帶有電荷的樹脂或纖維素組成。帶有正電荷的稱之陰離子交

28、換樹脂；而帶有負(fù)電荷的稱之陽離子樹脂。離子交換層析同樣可以用于蛋白質(zhì)的分離純化。由于蛋白質(zhì)也有等電點(diǎn)，當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)處于不同的pH條件下，其帶電狀況也不同。陰離子交換基質(zhì)結(jié)合帶有負(fù)電荷的蛋白質(zhì)，所以這類蛋白質(zhì)被留在柱子上，然后通過提高洗脫液中的鹽濃度等措施，將吸附在柱子上的蛋白質(zhì)洗脫下來。結(jié)合較弱的蛋白質(zhì)首先被洗脫下來。反之陽離子交換基質(zhì)結(jié)合帶有正電荷的蛋白質(zhì)，結(jié)合的蛋白可以通過逐步增加洗脫液中的鹽濃度或是提高洗脫液的pH值洗脫下來。2.2.1. 預(yù)處理及裝柱：對于離子交換纖維素要用流水洗去少量碎的不易沉淀的顆粒，以保證有較好的均勻度，對于已溶脹好的產(chǎn)品則不必經(jīng)這一步驟。溶脹的交換劑使用前要用稀酸或

29、稀堿處理，使之成為帶H+或OH-的交換劑型。陰離子交換劑常用“堿-酸-堿”處理，使最終轉(zhuǎn)為-OH-型或鹽型交換劑；對于陽離子交換劑則用“酸-堿-酸”處理，使最終轉(zhuǎn)為-H-型交換劑。洗滌好的纖維素使用前必須平衡至所需的pH和離子強(qiáng)度。已平衡的交換劑在裝柱前還要減壓除氣泡。為了避免顆粒大小不等的交換劑在自然沉降時分層，要適當(dāng)加壓裝柱，同時使柱床壓緊，減少死體積，有利于分辨率的提高。柱子裝好后再用起始緩沖液淋洗，直至達(dá)到充分平衡方可使用。 2.2.2. 加樣與洗脫加樣：層析所用的樣品應(yīng)與起始緩沖液有相同的pH和離子強(qiáng)度，所選定的pH值應(yīng)落在交換劑與被結(jié)合物有相反電荷的范圍，同時要注意離子強(qiáng)度應(yīng)低，可

30、用透析、凝膠過濾或稀釋法達(dá)此目的。樣品中的不溶物應(yīng)在透析后或凝膠過濾前，以離心法除去。為了達(dá)到滿意的分離效果，上樣量要適當(dāng)，不要超過柱的負(fù)荷能力。柱的負(fù)荷能力可用交換容量來推算，通常上樣量為交換劑交換總量的1-5。洗脫：已結(jié)合樣品的離子交換前，可通過改變?nèi)芤旱膒H或改變離子強(qiáng)度的方法將結(jié)合物洗脫，也可同時改變pH與離子強(qiáng)度。為了使復(fù)雜的組份分離完全，往往需要逐步改變pH或離子強(qiáng)度，其中最簡單的方法是階段洗脫法，即分次將不同pH與離子強(qiáng)度的溶液加入，使不同成分逐步洗脫。由于這種洗脫pH與離子強(qiáng)度的變化大，使許多洗脫體積相近的成分同時洗脫，純度較差，不適宜精細(xì)的分離。最好的洗脫方法是連續(xù)梯度洗脫，

31、兩個容器放于同一水平上，第一個容器盛有一定pH的緩沖液，第二個容器含有高鹽濃度或不同pH的緩沖液，兩容器連通，第一個容器與柱相連，當(dāng)溶液由第一容器流入柱時，第二容器中的溶液就會自動來補(bǔ)充，經(jīng)攪拌與第一容器的溶液相混合，這樣流入柱中的緩沖液的洗脫能力即成梯度變化。第一容器中任何時間的濃度都可用下式進(jìn)行計(jì)算：CC2（C2C1）（1V）A2/A1式中A1、A2分別代表兩容器的截面積：C1、C2分別表示容器中溶液的濃度；V為流出體積對總體積之比。當(dāng)A1A2時為線性梯度，當(dāng)A1A2時為凹形梯度，A1A2時為凸形梯度。洗脫時應(yīng)滿足以下要求：洗脫液體積應(yīng)足夠大，一般要幾十倍于床體積，從而使分離的各峰不致于太

32、擁擠。梯度的上限要足夠高，使緊密吸附的物質(zhì)能被洗脫下來。梯度不要上升太快，要恰好使移動的區(qū)帶在快到柱末端時達(dá)到解吸狀態(tài)。目的物的過早解吸，會引起區(qū)帶擴(kuò)散；而目的物的過晚解吸會使峰形過寬。 2.2.3. 洗脫餾份的分析按一定體積（5-10ml/管）收集的洗脫液可逐管進(jìn)行測定，得到層析圖譜。依實(shí)驗(yàn)?zāi)康牡牟煌?，可采用適宜的檢測方法（生物活性測定、免疫學(xué)測定等）確定圖譜中目的物的位置，并回收目的物。 2.2.4. 離子交換劑的再生與保存離子交換劑可在柱上再生。如離子交換纖維素可用2mol/：NaCl淋洗柱，若有強(qiáng)吸附物則可用0.1mol/LNaOH洗柱；若有脂溶性物質(zhì)則可用非離子型去污劑洗柱后再生，也

33、可用乙醇洗滌，其順序?yàn)椋?.5mol/LNaOH-水-乙醇-水-20NaOH-水。保存離子交換劑時要加防腐劑。對陰離子交換劑宜用0.002氯已定（洗必泰），陽離子交換劑可用乙基硫柳汞（0.005）。有些產(chǎn)品建立用0.02疊氮鈉。 2.2.5. 離子交換層析的應(yīng)用離子交換層析技術(shù)已廣泛用于各學(xué)科領(lǐng)域。在生物化學(xué)及臨床生化檢驗(yàn)中主要用于分離氨基酸、多肽及蛋白質(zhì)，也可用于分離核酸、核苷酸及其它帶電荷的生物分子。2.3 凝膠過濾凝膠過濾層析(gel filtration chromatography)又稱排阻層析或分子篩方法，主要是根據(jù)蛋白質(zhì)的大小和形狀，即蛋白質(zhì)的質(zhì)量進(jìn)行分離和純化。層析柱中的填料是

34、某些惰性的多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)物質(zhì)，多是交聯(lián)的聚糖(如葡聚糖或瓊脂糖)類物質(zhì)，使蛋白質(zhì)混合物中的物質(zhì)按分子大小的不同進(jìn)行分離。也叫做分子排阻層析（molecular-exclusion chromatography）。一種利用帶孔凝膠珠作基質(zhì)，按照分子大小分離蛋白質(zhì)或其它分子混合物的層析技術(shù)。 一般是大分子先流出來，小分子后流出來。凝膠過濾層析也稱分子篩層析、排阻層析。是利用具有網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的凝膠的分子篩作用，根據(jù)被分離物質(zhì)的分子大小不同來進(jìn)行分離。層析柱中的填料是某些惰性的多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)物質(zhì)，多是交聯(lián)的聚糖(如葡聚糖或瓊脂糖)類物質(zhì)，小分子物質(zhì)能進(jìn)入其內(nèi)部，流下來速度慢，而大分子物質(zhì)卻被排除在外部，下來的

35、速度快，當(dāng)一混合溶液通過凝膠過濾層析柱時，溶液中的物質(zhì)就按不同分子量篩分開了。它的突出優(yōu)點(diǎn)是層析所用的凝膠屬于惰性載體，不帶電荷，吸附力弱，操作條件比較溫和，可在相當(dāng)廣的溫度范圍下進(jìn)行，不需要有機(jī)溶劑，并且對分離成分理化性質(zhì)的保持有獨(dú)到之處。對于高分子物質(zhì)有很好的分離效果。 2.3.1. 凝膠的選擇根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康牟煌x擇不同型號的凝膠。如果實(shí)驗(yàn)?zāi)康氖菍悠分械拇蠓肿游镔|(zhì)和小分子物質(zhì)分開，由于它們在分配系數(shù)上有顯著差異，這種分離又稱組別分離，一般可選用SephadexG-25和G-50，對于小肽和低分子量的物質(zhì)（1000-5000）的脫鹽可使用SephadexG-10，G-15及Bio-Gel-p

36、-2或4.如果實(shí)驗(yàn)?zāi)康氖菍悠分幸恍┓肿恿勘容^近似的物質(zhì)進(jìn)行分離，這種分離又叫分級分離。一般選用排阻限度略大于樣品中最高分子量物質(zhì)的凝膠，層析過程中這些物質(zhì)都能不同程度地深入到凝膠內(nèi)部，由于Kd不同，最后得到分離。 2.3.2. 柱的直徑與長度根據(jù)經(jīng)驗(yàn)，組別分離時，大多采用2-30cm長的層析柱，分級分離時，一般需要100cm左右長的層析柱，其直徑在1-5cm范圍內(nèi)，小于1cm產(chǎn)生管壁效應(yīng)，大于5cm則稀釋現(xiàn)象嚴(yán)重。長度L與直徑D的比值L/D一般宜在7-10之間，但對移動慢的物質(zhì)宜在30-40之間。 2.3.3. 凝膠柱的制備凝膠型號選定后，將干膠顆粒懸浮于5-10倍量的蒸餾水或洗脫液中充分溶

37、脹，溶脹之后將極細(xì)的小顆粒傾瀉出去。自然溶脹費(fèi)時較長，加熱可使溶脹加速，即在沸水浴中將濕凝膠漿逐漸升溫至近沸，1-2小時即可達(dá)到凝膠的充分脹溶。加熱法既可節(jié)省時間又可消毒。凝膠的裝填：將層析柱與地面垂直固定在架子上，下端流出口用夾子夾緊，柱頂可安裝一個帶有攪拌裝置的較大容器，柱內(nèi)充滿洗脫液，將凝膠調(diào)成較稀薄的漿頭液盛于柱頂?shù)娜萜髦?，然后在微微地攪拌下使凝膠下沉于柱內(nèi)，這樣凝膠粒水平上升，直到所需高度為止，拆除柱頂裝置，用相應(yīng)的濾紙片輕輕蓋在凝膠床表面。稍放置一段時間，再開始流動平衡，流速應(yīng)低于層析時所需的流速。在平衡過程中逐漸增加到層析的流速，千萬不能超過最終流速。平衡凝膠床過夜，使用前要檢查

38、層析床是否均勻，有無“紋路”或氣泡，或加一些有色物質(zhì)來觀察色帶的移動，如帶狹窄、均勻平整說明層析柱的性能良好，色帶出現(xiàn)歪曲、散亂、變寬時必須重新裝柱。 2.3.4. 加樣和洗脫凝膠床經(jīng)過平衡后，在床頂部留下數(shù)亳升洗脫液使凝膠床飽和，再用滴管加入樣品。一般樣品體積不大于凝膠總床體積的5-10。樣品濃度與分配系數(shù)無關(guān)，故樣品濃度可以提高，但分子量較大的物質(zhì)，溶液的粘度將隨濃度增加而增大，使分子運(yùn)動受限，故樣品與洗脫液的相對粘度不得超過1.5-2.樣品加入后打開流出口，使樣品滲入凝膠床內(nèi)，當(dāng)樣品液面恰與凝膠床表面相平時，再加入數(shù)毫升洗脫液中洗管壁，使其全部進(jìn)入凝膠床后，將層析床與洗脫液貯瓶及收集器相

39、連，預(yù)先設(shè)計(jì)好流速，然后分部收集洗脫液，并對每一餾份做定性、定量測定。 2.3.5. 凝膠柱的重復(fù)使用、凝膠回收與保存一次裝柱后可以反復(fù)使用，不必特殊處理，并不影響分離效果。為了防止凝膠染菌，可在一次層析后加入0.02的疊氮鈉，在下次層析前應(yīng)將抑菌劑除去，以免干擾洗脫液的測定。如果不再使用可將其回收，一般方法是將凝膠用水沖洗干凈濾干，依次用70、90、95乙醇脫水平衡至乙醇濃度達(dá)90以上，濾干，再用乙醚洗去乙醇、濾干、干燥保存。濕態(tài)保存方法是凝膠漿中加入抑菌劑或水沖洗到中性，密封后高壓滅菌保存。 2.3.6. 凝膠層析的應(yīng)用 2.3.6.1脫鹽：高分子（如蛋白質(zhì)、核酸、多糖等）溶液中的低分子量

40、雜質(zhì)，可以用凝膠層析法除去，這一操作稱為脫鹽。本法脫鹽操作簡便、快速、蛋白質(zhì)和酶類等在脫鹽過程中不易變性。適用的凝膠為SephadexG-10、15、25或Bio-Gel-p-2、4、6.柱長與直徑之比為5-15，樣品體積可達(dá)柱床體積的25-30，為了防止蛋白質(zhì)脫鹽后溶解度降低會形成沉淀吸附于柱上，一般用醋酸銨等揮發(fā)性鹽類緩沖液使層析柱平衡，然后加入樣品，再用同樣緩沖液洗脫，收集的洗脫液用冷凍干燥法除去揮發(fā)性鹽類。 2.3.6.2 用于分離提純：凝膠層析法已廣泛用于酶、蛋白質(zhì)、氨基酸、多糖、激素、生物堿等物質(zhì)的分離提純。凝膠對熱原有較強(qiáng)的吸附力，可用來去除無離子水中的致熱原制備注射用水。 2.

41、3.6.3 測定高分子物質(zhì)的分子量：用一系列已知分子量的標(biāo)準(zhǔn)品放入同一凝膠柱內(nèi)，在同一條件下層析，記錄每一分鐘成分的洗脫體積，并以洗脫體積對分子量的對數(shù)作圖，在一定分子量范圍內(nèi)可得一直線，即分子量的標(biāo)準(zhǔn)曲線。測定未知物質(zhì)的分子量時，可將此樣品加在測定了標(biāo)準(zhǔn)曲線的凝膠柱內(nèi)洗腫后，根據(jù)物質(zhì)的洗脫體積，在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出它的的分子量。2.3.6.4 高分子溶液的濃縮：通常將SephadexG-25或50干膠投入到稀的高分子溶液中，這時水分和低分子量的物質(zhì)就會進(jìn)入凝膠粒子內(nèi)部的孔隙中，而高分子物質(zhì)則排阻在凝膠顆粒之外，再經(jīng)離心或過濾，將溶脹的凝膠分離出去，就得到了濃縮的高分子溶液3.電泳技術(shù) 電泳：帶電

42、顆粒在電場作用下，向著與其電性相反的電極移動，稱為電泳(electrophoresis, EP)。在生物學(xué)中，主要是指帶電荷的蛋白質(zhì)或核酸分子在電場中移動的現(xiàn)象。3.1 電泳的分類： 目前所采用的電泳方法，大致可分為3類：顯微電泳，自由界面電泳和區(qū)帶電泳。區(qū)帶電泳應(yīng)用最為廣泛，可分為以下幾種類型： 3.1.1按支持物的物理性狀不同，區(qū)帶電泳可分為： 3.1.1.1濾紙為支持物的紙電泳 3.1.1.2 粉末電泳：如纖維素粉，淀粉，玻璃粉電泳 3.1.1.3 凝膠電泳：如瓊脂，瓊脂糖，硅膠，淀粉膠，聚丙烯酰胺凝膠電泳 3.1.1.4 緣線電泳：如尼龍絲，人造絲電泳 3.1.2 按支持物的裝置形式不

43、同，區(qū)帶電泳可分為： 3.1.3 平板式電泳：支持物水平放置，是最常用的電泳方式 3.1.4垂直板電泳：聚丙烯酰胺凝膠可做成垂直板式電泳 3.1.5 柱狀(管狀)電泳:：聚丙烯酰胺凝膠可灌入適當(dāng)?shù)碾娪竟苤凶龀晒軤铍娪?3.1.3 按pH的連續(xù)性不同，區(qū)帶電泳可分為： 3.1.3.1 連續(xù)pH電泳：如紙電泳，醋酸纖維素薄膜電泳3.1.3.2非連續(xù)pH電泳：如聚丙烯酰胺凝膠盤狀電泳3.2 電泳所需的儀器電泳所需的儀器有：電泳槽和電泳儀。 3.2.1. 電泳槽電泳槽是電泳系統(tǒng)的核心部分，根據(jù)電泳的原理，電泳支持物都是放在兩個緩沖液之間，電場通過電泳支持物連接兩個緩沖液，不同電泳采用不同的電泳槽.常用

44、的電泳槽有圓盤電泳槽、垂直板電泳槽、水平電泳槽。3.2.2 電泳儀要使荷電的生物大分子在電場中泳動，必須加電場，且電泳的分辨率和電泳速度與電泳時的電參數(shù)密切相關(guān)。不同的電泳技術(shù)需要不同的電壓，電流和功率范圍，所以選擇電源主要根據(jù)電泳技術(shù)的需要。.3.3電泳技術(shù)的應(yīng)用3.3.1. 聚丙烯酰胺凝膠電泳可用做蛋白質(zhì)純度的鑒定。聚丙烯酰胺凝膠電泳同時具有電荷效應(yīng)和分子篩效應(yīng)，可以將分子大小相同而帶不同數(shù)量電荷的物質(zhì)分離開，并且還可以將帶相同數(shù)量電荷而分子大小不同的物質(zhì)分離開。其分辨率遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于一般層析方法和電泳方法，可以檢出10-910-12g的樣品，且重復(fù)性好,沒有電滲作用。3.3.2 SDS聚丙烯酰

45、胺凝膠電泳可測定蛋白質(zhì)分子量。其原理是帶大量電荷的SDS結(jié)合到蛋白質(zhì)分子上克服了蛋白質(zhì)分子原有電荷的影響而得到恒定的荷/質(zhì)比。SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳測蛋白質(zhì)分子量已經(jīng)比較成功，此法測定時間短，分辨率高，所需樣品量極少(1100g)，但只適用于球形或基本上呈球形的蛋白質(zhì)，某些蛋白質(zhì)不易與SDS結(jié)合如木瓜蛋白酶，核糖核酸酶等，此時測定結(jié)果就不準(zhǔn)確。3.3.3 聚丙烯酰胺凝膠電泳可用于蛋白質(zhì)定量。電泳后的凝膠經(jīng)凝膠掃描儀掃描，從而給出定量的結(jié)果。凝膠掃描儀主要用于對樣品單向電泳后的區(qū)帶和雙向電泳后的斑點(diǎn)進(jìn)行掃描。3.3.4 瓊脂或瓊脂糖凝膠免疫電泳可用于檢查蛋白質(zhì)制劑的純度；分析蛋白質(zhì)混合物的組分

46、；研究抗血清制劑中是否具有抗某種已知抗原的抗體；檢驗(yàn)兩種抗原是否相同。3.4 電泳后結(jié)果檢測對于不同的目的，應(yīng)采用不同的檢測方法。用染料和生物大分子結(jié)合形成有色的復(fù)合物是電泳后檢測最常用的方法。3.5 聚丙烯酰胺凝膠電泳作用：用于蛋白質(zhì)與寡糖核苷酸的分離。作用原理 聚丙烯酰胺凝膠電泳是網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，具有分子篩效應(yīng)，它具有兩種形式，一種是非變性聚丙烯酰胺凝膠，蛋白質(zhì)在電泳中保持完整的狀態(tài)，蛋白在其中依三種因素分開：蛋白大小，形狀和電荷。 而SDS-PAGE僅根據(jù)蛋白分子量亞基的不同而分離蛋白。這個技術(shù)首先是1967年由shapiro建立，他們發(fā)現(xiàn)在樣品介質(zhì)和丙烯酰胺凝膠中加入離子去污劑和強(qiáng)還原劑后，

47、蛋白質(zhì)亞基的電泳遷移率主要取決于亞基分子量的大小，電荷因素可以忽視。 SDS是陰離子去污劑，作為變性劑和助溶試劑，它能斷裂分子內(nèi)和分子間的氫鍵，使分子去折疊，破壞蛋白分子的二、三級結(jié)構(gòu)。而強(qiáng)還原劑如巰基乙醇，二硫蘇糖醇能使絆胱氨酸殘基間的二硫鍵斷裂。在樣品和凝膠中加入還原劑和SDS后，分子被解聚成多肽鏈，解聚后的氨基酸側(cè)鏈和SDS結(jié)合成蛋白- SDS膠束，所帶的負(fù)電荷大大超過了蛋白原有的電荷量，這樣就消除了不同分子間的電荷差異和結(jié)構(gòu)差異。 SDS-PAGE一般采用的是不連續(xù)緩沖系統(tǒng)，于連續(xù)緩沖系統(tǒng)相比，能夠有較高的分辨率。 濃縮膠的作用是有堆積作用，凝膠濃度較小，孔徑較大，把較稀的樣品加在濃縮

48、膠上，經(jīng)過大孔徑凝膠的遷移作用而被濃縮至一個狹窄的區(qū)帶。當(dāng)樣品液和濃縮膠選TRIS/HCL緩沖液，電極液選TRIS/甘氨酸。電泳開始后，HCL解離成氯離子，甘氨酸解離出少量的甘氨酸根離子。蛋白質(zhì)帶負(fù)電荷，因此一起向正極移動，其中氯離子最快，甘氨酸根離子最慢，蛋白居中。電泳開始時氯離子泳動率最大，超過蛋白，因此在后面形成低電導(dǎo)區(qū)，而電場強(qiáng)度與低電導(dǎo)區(qū)成反比，因而產(chǎn)生較高的電場強(qiáng)度，使蛋白和甘氨酸根離子迅速移動，形成以穩(wěn)定的界面，使蛋白聚集在移動界面附近，濃縮成一中間層。 此鑒定方法中，蛋白質(zhì)的遷移率主要取決于它的相對分子質(zhì)量，而與所帶電荷和分子形狀無關(guān)。第2章 實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備2.1引言 本實(shí)驗(yàn)需用到的

49、試劑，所以根據(jù)其需要及要求進(jìn)行相關(guān)實(shí)驗(yàn)試劑配制準(zhǔn)備。2.2儀器及材料2.2.1儀器：柱層析系統(tǒng)（層析柱，恒流泵，紫外監(jiān)測儀，部分收集器），Sigma高速冷凍離心機(jī)，722s分光光度計(jì)，透析袋，水浴鍋，電泳儀，電泳槽，紫外凝膠成像系統(tǒng)。2.2.2材料：新鮮雞蛋。2.2.3試劑：（1）弱酸性陽離子交換樹脂；（2）磷酸氫二鈉；（3）磷酸二氫鈉；（4）氯化鈉；（5）硫酸銨；（6）氫氧化鈉；（7）甘油；（8）鹽酸；（9）葡聚糖凝膠G-50；（10）溶壁微球菌干粉；（11）考馬斯亮藍(lán)G-250；（12）95%乙醇；（13）85%磷酸；（14）牛血清清蛋白(BSA)；（15）脲；（16）丙烯酰胺（Acr）；

50、（17）甲叉雙丙烯酰胺（Bis）；（18）四甲基乙二胺（TEMED）；（19）甘氨酸(Gly)；（20）過硫酸銨（AP）；（21）考馬斯亮藍(lán)R-250；(22)三羥甲基氨基甲烷（Tris）；（23）2-巰基乙醇；（24）十二烷基磺酸鈉（SDS）；（25）溴酚藍(lán)；（26）冰醋酸；（27）標(biāo)準(zhǔn)蛋白：SDS-低相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)蛋白. 2.3方法(1) 0.1mol/L磷酸鹽緩沖液，pH7.0；【配置成5*500ml，臨用前稀釋】(2) 2mol/L NaOH；200ml(3) 2mol/L HCl；200ml(4) 含50%甘油的0.1mol/L 磷酸鹽緩沖液，pH 7.0；200ml(5) 含0.

51、05mol/L NaCl的磷酸鹽緩沖液，pH7.0；（現(xiàn)用現(xiàn)配）【臨用前配置】200ml(6) 含0.5 mol/L NaCl的磷酸鹽緩沖液，pH7.0；（現(xiàn)用現(xiàn)配）【臨用前配置】200ml(7) 含0.1 mol/L NaCl的磷酸鹽緩沖液，pH7.0；（現(xiàn)用現(xiàn)配）【臨用前配置】(8) 測活緩沖液：含30mmol/L NaCl的0.1mol/L磷酸鹽緩沖液，pH7.0；(9) 底物溶液：40mg溶壁微球菌干粉溶于100mL測活緩沖液中；【公用，臨用前配置】(10) 考馬斯亮藍(lán)G-250試劑：考馬斯亮藍(lán)G-250 100mg溶于50mL 95%乙醇中，加入100mL 85%磷酸，用蒸餾水稀釋至

52、1000mL，濾紙過濾；【公用】(11) 標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液：用0.1mol/L NaCl的0.1mol/L磷酸鹽緩沖液，pH7.0配制1mg/ml牛血清清蛋白溶液；（100ml）(12) 底物溶液：300mg溶壁微球菌干粉溶于100ml測活緩沖液中；【公用，臨用前配置】(13) 10mol/L 脲，測活緩沖液配制；【50ml】(14) 30%膠貯液：每100mL中含丙烯酰胺29.2g，甲叉雙丙烯酰胺0.8g；【100ml公用】(15) 1.5mol/L Tris-HCl pH 8.8；【100ml公用】(16) 0.5mol/L Tris-HCl pH 6.8；【100ml公用】(17) 10%

53、（W/V）過硫酸銨；【現(xiàn)用現(xiàn)配】(18) SDS電泳緩沖液：25mmol/L Tris，0.192mol/L Gly，0.1%（W/V）SDS；【500ml】(19) 10%（W/V）SDS；【10ml】(20) 染色液：0.2g考馬斯亮藍(lán)R-250，42mL工業(yè)酒精，10mL冰醋酸，加蒸餾水至100mL；【50ml】(21) 脫色液：5mL冰醋酸，45mL工業(yè)酒精，50mL蒸餾水；【100ml】(22) 保存液：7%冰醋酸；(現(xiàn)用現(xiàn)配) (23) 2×上樣緩沖液：【公用，10ml】0.5mol/L Tris-HCl pH 6.8 2mL甘油 2mLSDS 0.4g0.1%溴酚藍(lán) 0

54、.5mL2-巰基乙醇 0.5mL蒸餾水 2.5mL第3章 酶的提取3.1引言 離子交換層析是依據(jù)混合樣品中各種離子或離子化合物與離子交換樹脂的可交換離子之間的交換程度不同而進(jìn)行分離純化的。離子交換層析主要是離子交換劑與溶液中離子或離子化合物以離子交換方式進(jìn)行，過程是可逆的。由于離子交換劑對溶液中各種離子具有不同的結(jié)合力，也就是說，離子交換劑對各離子的排斥和阻滯作用不同，從而引起各離子在柱內(nèi)的流速差異，逐漸發(fā)生分離，最終分別流出層析柱。該法可同時分析多種離子化合物，具有靈敏度高，重復(fù)性、選擇性好，分離速度快等優(yōu)點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)分離溶菌酶采用732型弱酸性陽離子交換樹脂。鹽析，中性鹽對蛋白質(zhì)的溶解度有顯

55、著影響，一般在低鹽濃度下隨著鹽濃度升高，蛋白質(zhì)的溶解度增加，此稱鹽溶。當(dāng)鹽濃度繼續(xù)升高時，蛋白質(zhì)的溶解度不同程度下降并先后析出，這種現(xiàn)象稱鹽析，將大量鹽加到蛋白質(zhì)溶解中，高濃度的鹽離子（如硫酸銨的SO42-和NH4+）有很強(qiáng)的水化力，可奪取蛋白質(zhì)分子的水化層，使之失水，于是蛋白質(zhì)膠粒凝結(jié)并沉淀析出。鹽析是若溶液pH在蛋白質(zhì)等電點(diǎn)則效果更好。由于各種蛋白質(zhì)分子顆粒大小、親水程度不同，故鹽析所需的鹽濃度也不一樣。溶菌酶在32%硫酸銨鹽濃度下的沉淀最多，最適宜作為鹽析液濃度。經(jīng)鹽析得到的沉淀為溶菌酶的粗制品。3.2內(nèi)容及步驟（一）樣品的制備： 新鮮雞蛋兩個個，破蛋殼取出蛋清，加入蛋清體積1.5倍的0

56、.1mol/L磷酸鹽緩沖液（pH 7.0），攪拌均勻，并調(diào)pH7.0（NaOH調(diào)pH），然后用八層紗布過濾，留取上清液，量取體積并記錄，留0.4mL上清液（定為步驟樣品）并加入0.4mL甘油-20凍存?zhèn)溆?。（二）陽離子交換層析 1.陽離子交換柱的再生：50g陽離子交換樹脂用2mol/L NaOH浸泡30min，水洗至中性，再用2mol/L鹽酸浸泡30min，水洗至中性。 2.平衡：在燒杯中將再生好的陽離子交換樹脂用0.1mol/L磷酸鹽緩沖液，pH7.0平衡。 3.吸附：在已平衡好的陽離子交換樹脂中加入蛋清樣品，攪拌吸附1h（玻璃棒攪拌）。 4.洗滌：倒去其余上清液，樹脂用100mL 0.1mol/L磷酸鹽緩沖液，pH7.0洗滌3遍。 5.裝柱：將樹脂攪拌均勻裝入離子交換柱，再用300mL 含0.05mol/L NaCl的0.1mol/L磷酸鹽緩沖液，pH7.0洗滌雜蛋白。（裝柱前，先檢查層析柱是否干凈，保證所有接頭密閉、管道通暢；裝柱時，流速不超過3mL/min，全過程絕對不能出現(xiàn)流干現(xiàn)象）。 6.洗脫：用300mL含0.5mol/L NaCl的0.1mol/L磷酸鹽緩沖液，pH7.0以3mL/min的流速進(jìn)行洗脫，合并光吸收高峰管，量取體積并記錄，留0.4mL上清液并加入0.4mL甘油，-20凍存?zhèn)溆茫ǘ椴襟E