細(xì)胞免疫熒光技術(shù)學(xué)習(xí)教案

1、會(huì)計(jì)學(xué)1第一頁，共17頁。實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)(shyn)目的目的掌握免疫掌握免疫(miny)熒光技術(shù)的熒光技術(shù)的基本原理基本原理熟悉細(xì)胞免疫熟悉細(xì)胞免疫(miny)熒光技熒光技術(shù)的方法術(shù)的方法了解在免疫了解在免疫(miny)細(xì)胞化學(xué)細(xì)胞化學(xué)技術(shù)中如何獲得好的實(shí)驗(yàn)結(jié)果技術(shù)中如何獲得好的實(shí)驗(yàn)結(jié)果第1頁/共17頁第二頁，共17頁。實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)(shyn)原理原理原位檢測(cè)原位檢測(cè)抗原抗體抗原抗體(kngt)特異反特異反應(yīng)應(yīng)間接法間接法 間接熒光(ynggung)抗體染色法示意圖抗抗原原抗抗體體熒光素標(biāo)記熒光素標(biāo)記的抗抗體的抗抗體激發(fā)光激發(fā)光顯示熒光顯示熒光Hela細(xì)胞細(xì)胞Vinculin第2頁/共17頁第三頁，共1

2、7頁。實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)(shyn)用品用品試劑試劑(shj)：固定液：固定液：4%PFA細(xì)胞通透：細(xì)胞通透：0.2%TritonX封閉試劑封閉試劑(shj)：10%正常山羊血清正常山羊血清一抗：小鼠源抗一抗：小鼠源抗Vinculin單克隆抗體單克隆抗體二抗二抗:Alexa Fluor555標(biāo)記的山羊抗小鼠標(biāo)記的山羊抗小鼠IgGDAPI（4,6-二脒基二脒基-2-苯基吲哚）苯基吲哚）PBS洗滌緩沖液：洗滌緩沖液：PH7.4材料：材料：Hela細(xì)胞細(xì)胞細(xì)胞培養(yǎng)皿細(xì)胞培養(yǎng)皿儀器儀器(yq)：熒光顯微鏡熒光顯微鏡第3頁/共17頁第四頁，共17頁。實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)(shyn)步驟步驟 一，細(xì)胞制備一，細(xì)胞制備(zhbi

3、)和細(xì)胞固和細(xì)胞固定定將細(xì)胞鋪在將細(xì)胞鋪在24孔板中孔板中將細(xì)胞培養(yǎng)將細(xì)胞培養(yǎng)至所需密度至所需密度加入加入4%PFA固定固定10min染色染色或保存或保存PBS洗洗滌滌PBS洗洗滌滌第4頁/共17頁第五頁，共17頁。實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)(shyn)步驟步驟 二，細(xì)胞二，細(xì)胞(xbo)免疫熒光免疫熒光ICC染染色色0.2%TritonX處理處理(chl)5min 封閉封閉室溫室溫30min4過夜過夜371-2小時(shí)小時(shí)375-10min熒光顯微鏡熒光顯微鏡觀察觀察加入一抗加入一抗加入二抗加入二抗加入加入DAPI復(fù)染復(fù)染PBS洗滌洗滌PBS洗滌洗滌PBS洗滌洗滌第5頁/共17頁第六頁，共17頁。實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)(shy

4、n)結(jié)果結(jié)果三，觀察三，觀察(gunch) human HeLa cells 第6頁/共17頁第七頁，共17頁。實(shí)驗(yàn)中應(yīng)注意實(shí)驗(yàn)中應(yīng)注意(zh y)的的問題問題 細(xì)胞不要鋪的過密細(xì)胞不要鋪的過密:60-70% 防止防止(fngzh)細(xì)胞污染細(xì)胞污染 固定時(shí)間不要太長(zhǎng)固定時(shí)間不要太長(zhǎng),一般一般10-30min TrionX處理時(shí)間不宜過長(zhǎng)，膜蛋白可不必處理處理時(shí)間不宜過長(zhǎng)，膜蛋白可不必處理 選擇合適的封閉液選擇合適的封閉液 二抗孵育后二抗孵育后,一定要洗干凈一定要洗干凈 必要時(shí)用恒溫?fù)u床搖洗必要時(shí)用恒溫?fù)u床搖洗第7頁/共17頁第八頁，共17頁。 1. 1. 免疫熒光技術(shù)免疫熒光技術(shù)(jsh)(j

5、sh) 2. 2. 免疫酶技術(shù)免疫酶技術(shù)(jsh)(jsh) 3. 3. 免疫親和技術(shù)免疫親和技術(shù)(jsh)(jsh) 4. 4. 膠體金技術(shù)膠體金技術(shù)(jsh)(jsh) 標(biāo)記標(biāo)記(bioj)(bioj)物物 使抗體或抗使抗體或抗原原 抗體復(fù)合物抗體復(fù)合物在在 各種顯微鏡各種顯微鏡下下 可見的物質(zhì)可見的物質(zhì)免疫免疫(miny)細(xì)胞化學(xué)技術(shù)細(xì)胞化學(xué)技術(shù)第8頁/共17頁第九頁，共17頁。免疫細(xì)胞化學(xué)免疫細(xì)胞化學(xué)(huxu)技術(shù)注意事項(xiàng)技術(shù)注意事項(xiàng) 選擇合適的方法選擇合適的方法 材料要留好材料要留好 選擇抗體選擇抗體 選擇標(biāo)記選擇標(biāo)記(bioj)酶酶 封閉液的選擇封閉液的選擇 設(shè)定對(duì)照實(shí)驗(yàn)設(shè)定對(duì)照

6、實(shí)驗(yàn)第9頁/共17頁第十頁，共17頁。思考題思考題檢測(cè)檢測(cè)Hela細(xì)胞中蛋白細(xì)胞中蛋白A定位情況定位情況(qngkung)，思考應(yīng)選擇什么方法，思考應(yīng)選擇什么方法，用什么儀器觀察？用什么儀器觀察？A第10頁/共17頁第十一頁，共17頁。疑難解答疑難解答一，缺乏一，缺乏(quf)染色染色 可能的原因可能的原因 無抗原無抗原 抗體失效抗體失效 固定不充分固定不充分 過度固定過度固定 抗原修復(fù)無效抗原修復(fù)無效 不兼容的二抗和一抗不兼容的二抗和一抗 漏用試劑或未按正確的順序漏用試劑或未按正確的順序 加入試劑加入試劑相應(yīng)的措施相應(yīng)的措施 用原位雜交方法檢測(cè)蛋白表達(dá)用原位雜交方法檢測(cè)蛋白表達(dá) 按說明書儲(chǔ)存

7、抗體按說明書儲(chǔ)存抗體;分裝抗體分裝抗體;避免反復(fù)凍融避免反復(fù)凍融 增加固定時(shí)間或改用不同的固定劑增加固定時(shí)間或改用不同的固定劑 減少固定時(shí)間減少固定時(shí)間;抗原修復(fù)抗原修復(fù) 增加修復(fù)時(shí)間或更換修復(fù)液增加修復(fù)時(shí)間或更換修復(fù)液 使用可以與一抗結(jié)合的二抗使用可以與一抗結(jié)合的二抗 重復(fù)染色并確定使用的試劑和加入的順序重復(fù)染色并確定使用的試劑和加入的順序第11頁/共17頁第十二頁，共17頁。二，高背景二，高背景(bijng)第12頁/共17頁第十三頁，共17頁。 可能的原因可能的原因 一抗或二抗的濃度過高一抗或二抗的濃度過高 一抗和一抗和/或二抗與組織的或二抗與組織的 非特異性結(jié)合非特異性結(jié)合 組織過于干

8、燥組織過于干燥 試劑粘附在舊的試劑粘附在舊的 或未制備好的玻片上或未制備好的玻片上相應(yīng)的措施相應(yīng)的措施預(yù)實(shí)驗(yàn)摸索最佳濃度預(yù)實(shí)驗(yàn)摸索最佳濃度一抗孵育前封閉一抗孵育前封閉 (最好是二抗來源的血清最好是二抗來源的血清)在染色過程中避免組織干燥在染色過程中避免組織干燥用新鮮制備或購買的玻片進(jìn)行實(shí)驗(yàn)用新鮮制備或購買的玻片進(jìn)行實(shí)驗(yàn)第13頁/共17頁第十四頁，共17頁。三，細(xì)胞三，細(xì)胞/組織的形態(tài)組織的形態(tài)(xngti)被被破壞破壞第14頁/共17頁第十五頁，共17頁。 可能的原因可能的原因 抗原修復(fù)方法過于劇烈抗原修復(fù)方法過于劇烈 組織切片從玻片上脫落組織切片從玻片上脫落 組織切片撕裂或褶皺組織切片撕裂或

9、褶皺,切片下有氣泡切片下有氣泡 組織形態(tài)難以分辨組織形態(tài)難以分辨 組織固定不充分組織固定不充分,自發(fā)裂解自發(fā)裂解 相應(yīng)的措施相應(yīng)的措施 預(yù)實(shí)驗(yàn)摸索合適的修復(fù)條件預(yù)實(shí)驗(yàn)摸索合適的修復(fù)條件 增加固定時(shí)間增加固定時(shí)間;烤片烤片; 使用新鮮準(zhǔn)備的帶有充足電荷的玻片使用新鮮準(zhǔn)備的帶有充足電荷的玻片 使用鋒利的刀片使用鋒利的刀片;分析時(shí)避開受損的區(qū)域分析時(shí)避開受損的區(qū)域 切片薄一些切片薄一些;冰凍過程形成冰晶冰凍過程形成冰晶,蔗糖脫水蔗糖脫水 及時(shí)固定及時(shí)固定;增加固定時(shí)間增加固定時(shí)間; 提高固定劑提高固定劑/組織的比例組織的比例; 將組織切得較小將組織切得較小第15頁/共17頁第十六頁，共17頁。四，染色四，染色(rns)不正確不正確 可能的原因可能的原因 固定方法對(duì)于抗原不合適固定方法對(duì)于抗原不合適 抗原修復(fù)方法不合適抗原修復(fù)方法不合適 沒有及時(shí)固定引起抗原的擴(kuò)散沒有