季的花藥培養(yǎng)(定稿)

1、授課教師：李琳授課教師：李琳 植物的花藥培養(yǎng)和單倍體育種的關(guān)系植物的花藥培養(yǎng)和單倍體育種的關(guān)系花粉粒（花粉粒（1N）單倍體植株單倍體植株（1N）二倍體純合子二倍體純合子植株（植株（2N）花藥離體培養(yǎng)花藥離體培養(yǎng)人工誘導(dǎo)染色體數(shù)加倍人工誘導(dǎo)染色體數(shù)加倍花的結(jié)構(gòu)花的結(jié)構(gòu)花絲花絲花藥：花藥：囊狀結(jié)構(gòu)，內(nèi)有很多花粉囊狀結(jié)構(gòu)，內(nèi)有很多花粉 花粉是由花粉母細(xì)胞（即小孢子母細(xì)胞）花粉是由花粉母細(xì)胞（即小孢子母細(xì)胞）經(jīng)過經(jīng)過而形成的，因此，花粉是而形成的，因此，花粉是。 花粉的發(fā)育要經(jīng)歷：花粉的發(fā)育要經(jīng)歷：時(shí)期、單核時(shí)期、單核期、雙核期期、雙核期等階段。等階段。雄蕊雄蕊被子植物花粉的發(fā)育過程被子植物花粉的發(fā)育

2、過程四分體四分體時(shí)期時(shí)期單核期單核期雙核期雙核期1花粉母花粉母細(xì)胞（細(xì)胞（2n）4個(gè)小孢子個(gè)小孢子(小孢子小孢子四分體四分體)（n）減分減分有分有分1個(gè)花粉管細(xì)胞核（個(gè)花粉管細(xì)胞核（n）1個(gè)生殖細(xì)胞核（個(gè)生殖細(xì)胞核（n）有分有分2個(gè)精子個(gè)精子單核居中期（單核居中期（n）單核靠邊期（單核靠邊期（n）注意： 二核花粉粒：成熟的花粉粒中，只含二核花粉粒：成熟的花粉粒中，只含花粉花粉管細(xì)胞核和生殖細(xì)胞核管細(xì)胞核和生殖細(xì)胞核。（精子在花粉管中。（精子在花粉管中形成）形成） 三核花粉粒：有些植物的花粉，在成熟前，三核花粉粒：有些植物的花粉，在成熟前，生殖細(xì)胞進(jìn)行一次有絲分裂，形成兩個(gè)精子，生殖細(xì)胞進(jìn)行一次

3、有絲分裂，形成兩個(gè)精子，這樣的花粉在成熟時(shí)，含有這樣的花粉在成熟時(shí)，含有一個(gè)營養(yǎng)核和兩一個(gè)營養(yǎng)核和兩個(gè)精子。個(gè)精子。 兩個(gè)精子和一個(gè)營養(yǎng)核的兩個(gè)精子和一個(gè)營養(yǎng)核的基因型基因型相同。相同。移栽移栽花藥中花藥中的花粉的花粉胚狀體胚狀體脫分化脫分化 愈傷組織愈傷組織 花藥中花藥中的花粉的花粉脫分化脫分化 分化分化 叢芽叢芽 再分化再分化 叢芽叢芽 誘導(dǎo)誘導(dǎo)生根生根體細(xì)胞胚（胚狀體）：在組織培養(yǎng)過程中，某些細(xì)胞在形態(tài)上轉(zhuǎn)體細(xì)胞胚（胚狀體）：在組織培養(yǎng)過程中，某些細(xì)胞在形態(tài)上轉(zhuǎn)變?yōu)榕c變?yōu)榕c合子發(fā)育成的胚非常相似的結(jié)構(gòu)合子發(fā)育成的胚非常相似的結(jié)構(gòu)，發(fā)育過程亦與合子胚類，發(fā)育過程亦與合子胚類似似這兩種途徑之

4、間沒有絕對(duì)的界限，這兩種途徑之間沒有絕對(duì)的界限，主要取主要取決于培養(yǎng)基中激素的種類及濃度配比。決于培養(yǎng)基中激素的種類及濃度配比。1、材料的選擇、材料的選擇 不同植物的誘導(dǎo)成功率不同不同植物的誘導(dǎo)成功率不同. 同一植物親本的不同生理狀況也對(duì)誘導(dǎo)成功率有直同一植物親本的不同生理狀況也對(duì)誘導(dǎo)成功率有直接的影響接的影響. 合適的花粉發(fā)育期（單核居中期與靠邊期之間）合適的花粉發(fā)育期（單核居中期與靠邊期之間）(三三)、影響花藥培養(yǎng)的主要因素、影響花藥培養(yǎng)的主要因素 材料的選擇與培養(yǎng)基的組成材料的選擇與培養(yǎng)基的組成從花藥看：月季的初花期從花藥看：月季的初花期（五月初到五月中旬）（五月初到五月中旬）從花粉看：

5、單核期從花粉看：單核期（一般來說，細(xì)胞核核從中央移向（一般來說，細(xì)胞核核從中央移向細(xì)胞一側(cè)的時(shí)期，花藥培養(yǎng)成功率最高）細(xì)胞一側(cè)的時(shí)期，花藥培養(yǎng)成功率最高）從花蕾看：完全未開放的從花蕾看：完全未開放的 此外，植株生長條件、材料低溫預(yù)處理、接種密度等對(duì)此外，植株生長條件、材料低溫預(yù)處理、接種密度等對(duì)誘導(dǎo)成功率有一定影響。誘導(dǎo)成功率有一定影響。2、培養(yǎng)基的組成、培養(yǎng)基的組成（ MS培養(yǎng)基培養(yǎng)基+不同比例的植物生長調(diào)節(jié)激素）不同比例的植物生長調(diào)節(jié)激素）實(shí)驗(yàn)操作實(shí)驗(yàn)操作材料選取材料選取材料和材料和消毒消毒接種和接種和培養(yǎng)培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)操作實(shí)驗(yàn)操作（一）材料選?。ㄒ唬┎牧线x取 通過通過鏡檢鏡檢來確定是否處于適宜

6、的發(fā)育期。來確定是否處于適宜的發(fā)育期。 方法：方法：醋酸洋紅法醋酸洋紅法(將染色體染成紅色將染色體染成紅色) 對(duì)于某些植物的花粉細(xì)胞核不易著色使用對(duì)于某些植物的花粉細(xì)胞核不易著色使用 焙花青焙花青-鉻礬法鉻礬法(花粉細(xì)胞核染成藍(lán)黑色花粉細(xì)胞核染成藍(lán)黑色)。 從花藥看：月季的初花期從花藥看：月季的初花期 從花粉看：單核期從花粉看：單核期 從花蕾看：完全未開放的從花蕾看：完全未開放的 1.我們?cè)鯓舆x擇想要的花粉呢？我們?cè)鯓舆x擇想要的花粉呢？2.我們?cè)鯓颖ＷC所選的材料處于單核期？我們?cè)鯓颖ＷC所選的材料處于單核期？為什么花瓣松動(dòng)會(huì)給材料的為什么花瓣松動(dòng)會(huì)給材料的消毒帶來困難？消毒帶來困難？答：花瓣松動(dòng)

7、后，微生物就答：花瓣松動(dòng)后，微生物就可能侵入到花藥，給材料可能侵入到花藥，給材料的消毒帶來困難。的消毒帶來困難。（二）材料的消毒（二）材料的消毒5 5、無菌水沖洗、無菌水沖洗3 35 5次次 花藥的外面有花萼、花瓣保護(hù)，通常處于無菌狀態(tài)花藥的外面有花萼、花瓣保護(hù)，通常處于無菌狀態(tài)1、花蕾用、花蕾用體積分?jǐn)?shù)為體積分?jǐn)?shù)為70%的酒精的酒精浸泡浸泡30秒秒2、無菌水清洗、無菌水清洗3、無菌吸水紙吸干花蕾表面的水分、無菌吸水紙吸干花蕾表面的水分4、放入、放入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%的氯化汞的氯化汞溶液中溶液中24分鐘分鐘 （質(zhì)量分?jǐn)?shù)為質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的的次氯酸鈣溶液次氯酸鈣溶液或飽和漂白粉溶液或飽和

8、漂白粉溶液）花花蕾蕾（70酒精）酒精）大約大約30s（無（無菌水）菌水）清洗清洗（無菌（無菌吸水紙）吸水紙）吸干水吸干水分分（1氯化氯化汞溶液）汞溶液）24min（無（無菌水）菌水）沖洗沖洗 月季花蕾的消毒與菊花外植體的消月季花蕾的消毒與菊花外植體的消毒相比較，二者有何不同？毒相比較，二者有何不同？ 在酒精消毒前，花藥不需要預(yù)先用流在酒精消毒前，花藥不需要預(yù)先用流水沖洗、洗衣粉洗滌和軟刷刷洗水沖洗、洗衣粉洗滌和軟刷刷洗 （三）接種和培養(yǎng)（三）接種和培養(yǎng) 滅菌后花蕾，要在滅菌后花蕾，要在無菌條件無菌條件下除去萼片和下除去萼片和花瓣，并立即將花藥接種到培養(yǎng)基上?；ò?，并立即將花藥接種到培養(yǎng)基上。

9、在剝離花藥時(shí)，要盡量在剝離花藥時(shí)，要盡量不損傷花藥不損傷花藥（否則否則接種后，容易從受傷部位產(chǎn)生二倍體的愈傷組接種后，容易從受傷部位產(chǎn)生二倍體的愈傷組織織），同時(shí)還要徹底），同時(shí)還要徹底去除花絲去除花絲，因?yàn)榕c花絲相連因?yàn)榕c花絲相連的花藥不利于愈傷組織或胚狀體的形成的花藥不利于愈傷組織或胚狀體的形成。 通常每瓶通常每瓶接種花藥接種花藥7-107-10個(gè)個(gè)，溫度控制在，溫度控制在2525左右，左右，不需要光照不需要光照。幼小植株形成后才。幼小植株形成后才需要需要光照。光照。 一般經(jīng)過一般經(jīng)過20-3020-30天培養(yǎng)后，會(huì)發(fā)現(xiàn)花藥開裂，天培養(yǎng)后，會(huì)發(fā)現(xiàn)花藥開裂，長出長出愈傷組織或釋放出胚狀體愈傷

10、組織或釋放出胚狀體。將愈傷組織及時(shí)。將愈傷組織及時(shí)轉(zhuǎn)移到轉(zhuǎn)移到分化培養(yǎng)基分化培養(yǎng)基上，以便進(jìn)一步分化出再生植上，以便進(jìn)一步分化出再生植株。株。 如果花藥開裂釋放出如果花藥開裂釋放出胚狀體胚狀體，則一個(gè)花，則一個(gè)花藥內(nèi)就會(huì)產(chǎn)生藥內(nèi)就會(huì)產(chǎn)生大量幼小植株大量幼小植株，必須在花藥開必須在花藥開裂后盡快將幼小植株分開，分別移植到新的裂后盡快將幼小植株分開，分別移植到新的培養(yǎng)基上培養(yǎng)基上，否則這些植株將很難分開。，否則這些植株將很難分開。 在花藥培養(yǎng)中，特別是通過愈傷組織形在花藥培養(yǎng)中，特別是通過愈傷組織形成的花粉植株，常常會(huì)出現(xiàn)成的花粉植株，常常會(huì)出現(xiàn)染色體倍性的變?nèi)旧w倍性的變化?；?。因此還需要因此還

11、需要對(duì)培養(yǎng)出來的幼苗進(jìn)一步的對(duì)培養(yǎng)出來的幼苗進(jìn)一步的鑒定和篩選。鑒定和篩選。（三）、接種和培養(yǎng)（三）、接種和培養(yǎng)1、剝?nèi)』ㄋ?、剝?nèi)』ㄋ? 2、接種花藥、接種花藥3 3、培養(yǎng)、培養(yǎng)4 4、分化培養(yǎng)基培養(yǎng)、分化培養(yǎng)基培養(yǎng)5 5、鑒定和篩選、鑒定和篩選不要損傷花藥？不要損傷花藥？要徹底除去花絲？要徹底除去花絲？常常會(huì)出現(xiàn)染色體倍性的變化？常常會(huì)出現(xiàn)染色體倍性的變化？ 每個(gè)培養(yǎng)瓶接種（每個(gè)培養(yǎng)瓶接種（7 710 10 ）個(gè)花藥？）個(gè)花藥？花藥長出愈傷組織還要轉(zhuǎn)移到哪？花藥長出愈傷組織還要轉(zhuǎn)移到哪？主要原因是主要原因是營養(yǎng)核和生營養(yǎng)核和生殖核融合殖核融合造造成的成的植物組織培養(yǎng)技術(shù)與花藥培養(yǎng)技術(shù)的比較植

12、物組織培養(yǎng)技術(shù)與花藥培養(yǎng)技術(shù)的比較項(xiàng)目項(xiàng)目植物組織培養(yǎng)植物組織培養(yǎng)花藥培養(yǎng)技術(shù)花藥培養(yǎng)技術(shù)相同點(diǎn)相同點(diǎn)1 1 培養(yǎng)基配制方法、無菌技術(shù)及接種操作培養(yǎng)基配制方法、無菌技術(shù)及接種操作等基本相同。等基本相同。2 2 都經(jīng)過了脫分化都經(jīng)過了脫分化不同點(diǎn)不同點(diǎn)1 1 離體培養(yǎng)的外植離體培養(yǎng)的外植體為體為體細(xì)胞。體細(xì)胞。2 2 有絲分裂的過程，有絲分裂的過程，染色體數(shù)量不變。染色體數(shù)量不變。1 1 花粉是花粉是生殖細(xì)胞生殖細(xì)胞，得，得到的到的單倍體植株單倍體植株，弱小，弱小且高度不育。且高度不育。2 2秋水仙素處理，染色秋水仙素處理，染色體加倍，恢復(fù)正常的染體加倍，恢復(fù)正常的染色體數(shù)，為色體數(shù)，為。 （四

13、）結(jié)果分析與評(píng)價(jià)（四）結(jié)果分析與評(píng)價(jià)選材是否恰當(dāng)：選材是否恰當(dāng)：選材時(shí)實(shí)驗(yàn)成功的關(guān)鍵。要選材時(shí)實(shí)驗(yàn)成功的關(guān)鍵。要能通過鏡檢找到適宜發(fā)育期的花粉。能通過鏡檢找到適宜發(fā)育期的花粉。無菌技術(shù)是否過關(guān)：無菌技術(shù)是否過關(guān)：如果出現(xiàn)了污染現(xiàn)象，如果出現(xiàn)了污染現(xiàn)象，說明某些技術(shù)操作步驟，如培養(yǎng)基滅菌、花蕾說明某些技術(shù)操作步驟，如培養(yǎng)基滅菌、花蕾消毒或接種等有問題。消毒或接種等有問題。接種是否成功：接種是否成功：如果接種的花藥長出愈傷組如果接種的花藥長出愈傷組織或釋放出胚狀體，花藥培養(yǎng)的第一步就成功織或釋放出胚狀體，花藥培養(yǎng)的第一步就成功了。要適時(shí)轉(zhuǎn)換培養(yǎng)基，以便愈傷組織或胚狀了。要適時(shí)轉(zhuǎn)換培養(yǎng)基，以便愈傷組

14、織或胚狀體進(jìn)一步分化成再生植株。體進(jìn)一步分化成再生植株。(08(08年海南高考年海南高考) )某二倍體植物是雜合體，圖為其花藥中未成熟某二倍體植物是雜合體，圖為其花藥中未成熟花粉在適宜的培養(yǎng)基上培養(yǎng)產(chǎn)生完整植株的過程。據(jù)圖回答：花粉在適宜的培養(yǎng)基上培養(yǎng)產(chǎn)生完整植株的過程。據(jù)圖回答： （1）圖中）圖中表示的是該花粉培養(yǎng)過程中的表示的是該花粉培養(yǎng)過程中的 _過程，過程，表表示的是示的是_過程，過程，X代表的是代表的是_，表示的是表示的是_ 過過程，程，表示的是誘導(dǎo)表示的是誘導(dǎo)_ 過程。過程。（2）圖中從愈傷組織形成完整植株的途徑有兩條，具體通過那）圖中從愈傷組織形成完整植株的途徑有兩條，具體通過那

15、一條途徑主要取決于培養(yǎng)基成分中一條途徑主要取決于培養(yǎng)基成分中_ 的種類及其濃度的種類及其濃度配比，最后獲得的來源于為成熟花粉的完整植株都稱為配比，最后獲得的來源于為成熟花粉的完整植株都稱為 _ 植株（甲）。未成熟花粉經(jīng)培養(yǎng)能形成完整植株，說明為成熟植株（甲）。未成熟花粉經(jīng)培養(yǎng)能形成完整植株，說明為成熟花粉具有花粉具有_。脫分化脫分化再分化再分化胚狀體胚狀體分化分化生根生根激素激素單倍體單倍體細(xì)胞全能性細(xì)胞全能性（0909廣州綜合測試）下圖是月季花藥離體培養(yǎng)產(chǎn)廣州綜合測試）下圖是月季花藥離體培養(yǎng)產(chǎn)生花粉植株的兩種途徑，請(qǐng)據(jù)圖回答有關(guān)問題：生花粉植株的兩種途徑，請(qǐng)據(jù)圖回答有關(guān)問題：1 1）選用的材

16、料合適與否是成功誘導(dǎo)出花粉植株的）選用的材料合適與否是成功誘導(dǎo)出花粉植株的重要因素，一般來說選用重要因素，一般來說選用 期的花粉可提高成期的花粉可提高成功率。選擇花粉時(shí)，一般要通過功率。選擇花粉時(shí)，一般要通過 來確定花粉是否處于合適的發(fā)育期，這時(shí)需要來確定花粉是否處于合適的發(fā)育期，這時(shí)需要對(duì)花粉的細(xì)胞核進(jìn)行染色，常用的染色劑是對(duì)花粉的細(xì)胞核進(jìn)行染色，常用的染色劑是 。單核單核鏡檢（顯微鏡觀察）鏡檢（顯微鏡觀察）醋酸洋紅醋酸洋紅2 2）上圖中花藥經(jīng)脫分化產(chǎn)生胚狀體還是愈傷組織主要?。┥蠄D中花藥經(jīng)脫分化產(chǎn)生胚狀體還是愈傷組織主要取決于培養(yǎng)基中決于培養(yǎng)基中 。3 3）胚狀體與愈傷組織在結(jié)構(gòu)上的主要區(qū)

17、別在于愈傷組織）胚狀體與愈傷組織在結(jié)構(gòu)上的主要區(qū)別在于愈傷組織的細(xì)胞排列疏松無規(guī)則，是一種高度的細(xì)胞排列疏松無規(guī)則，是一種高度 的薄壁細(xì)胞，胚狀體與的薄壁細(xì)胞，胚狀體與 發(fā)育形成的胚有發(fā)育形成的胚有類似的結(jié)構(gòu)，即具有胚芽、胚軸和胚根。類似的結(jié)構(gòu)，即具有胚芽、胚軸和胚根。4 4）無菌技術(shù)也是成功誘導(dǎo)出花粉植株的重要因素，請(qǐng)說）無菌技術(shù)也是成功誘導(dǎo)出花粉植株的重要因素，請(qǐng)說明下列各項(xiàng)需要消毒，還是需要滅菌。明下列各項(xiàng)需要消毒，還是需要滅菌。培養(yǎng)基，培養(yǎng)基，培養(yǎng)皿，培養(yǎng)皿，接種環(huán)，接種環(huán)，花蕾，花蕾，實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)操作者的雙手，操作者的雙手，三角錐形瓶。三角錐形瓶。 （填編號(hào)）（填編號(hào)）需要滅菌，需要滅菌

18、， （填編號(hào)）需要消毒。（填編號(hào)）需要消毒。激素的種類及其濃度配比激素的種類及其濃度配比液泡化液泡化正常受精卵正常受精卵 基因型為基因型為AaBb的水稻（條染色體）的花藥通的水稻（條染色體）的花藥通過無菌操作，接入試管后，在一定條件下培養(yǎng)成試管過無菌操作，接入試管后，在一定條件下培養(yǎng)成試管苗。苗。（）愈傷組織是花粉細(xì)胞分裂形成的不規(guī)則的細(xì)胞（）愈傷組織是花粉細(xì)胞分裂形成的不規(guī)則的細(xì)胞團(tuán)，愈傷組織必須從培養(yǎng)基中獲得（）（團(tuán)，愈傷組織必須從培養(yǎng)基中獲得（）（ ）和小分子有機(jī)物等營養(yǎng)物質(zhì)。和小分子有機(jī)物等營養(yǎng)物質(zhì)。（）要促進(jìn)花粉細(xì)胞的分裂分化，培養(yǎng)基中應(yīng)有（）要促進(jìn)花粉細(xì)胞的分裂分化，培養(yǎng)基中應(yīng)有（ ）（）（ ）兩種激素。）兩種激素。愈傷組織分化是指愈傷組織形成芽和根，由芽發(fā)育成愈傷組織分化是指愈傷組織形成芽和根，由芽發(fā)育成葉莖。這一過程必須給予光照，其原因是（）葉莖。這一過程必須給予光照，其原因是（）利用光能制造有機(jī)物促進(jìn)試管苗生長發(fā)育。利用光能制造有機(jī)物促進(jìn)試管苗生長發(fā)育。（）試管苗的細(xì)胞核中有（）條脫氧核苷酸（）試管苗的細(xì)胞核中有（）條脫氧核苷酸鏈。試管苗的基因型有：鏈。試管苗的基因型有： 水水無機(jī)鹽無機(jī)鹽生長素生長素細(xì)胞分裂素細(xì)胞分裂素葉葉24AB Ab aB