聚丙烯酰胺凝膠電泳分離血清蛋白ppt課件

1、 聚丙烯酰胺凝膠電泳分別血清蛋白電泳是指帶電粒子在電場(chǎng)的作用下，發(fā)生定向泳電泳是指帶電粒子在電場(chǎng)的作用下，發(fā)生定向泳動(dòng)的景象。動(dòng)的景象。電泳技術(shù)指利用電泳景象對(duì)混合物進(jìn)展分別分析電泳技術(shù)指利用電泳景象對(duì)混合物進(jìn)展分別分析的技術(shù)。的技術(shù)。電泳根本原理：電泳根本原理： COO- COO- COOH + H+ + H+ Pr Pr Pr + OH- + OH- NH2 NH3+ NH3+PHPI PH=PI PH纖維狀影響電泳速度的要素：影響電泳速度的要素：v樣品本身：帶電量，分子大小，外形樣品本身：帶電量，分子大小，外形v電場(chǎng)強(qiáng)度：電壓電場(chǎng)強(qiáng)度：電壓v電泳介質(zhì)的電泳介質(zhì)的pHpH和離子強(qiáng)度和離子強(qiáng)

2、度v電滲作用電滲作用按凝膠安裝分為盤(pán)狀電泳及板狀電泳按凝膠安裝分為盤(pán)狀電泳及板狀電泳盤(pán)狀電泳通常是不延續(xù)系統(tǒng)，利用緩沖液離子成分、盤(pán)狀電泳通常是不延續(xù)系統(tǒng)，利用緩沖液離子成分、pHpH、凝膠孔徑進(jìn)展電泳，帶電顆粒電泳時(shí)具有電荷效、凝膠孔徑進(jìn)展電泳，帶電顆粒電泳時(shí)具有電荷效應(yīng)、分子篩效應(yīng)、應(yīng)、分子篩效應(yīng)、 濃縮效應(yīng)。濃縮效應(yīng)。聚丙烯酰胺凝膠電泳分類聚丙烯酰胺凝膠電泳分類以聚丙烯酰胺作為支持介質(zhì)的一種電泳技術(shù)。凝以聚丙烯酰胺作為支持介質(zhì)的一種電泳技術(shù)。凝膠是單體聚丙烯酰胺膠是單體聚丙烯酰胺Acr)Acr)和交聯(lián)劑甲叉雙丙烯和交聯(lián)劑甲叉雙丙烯酰胺酰胺(Bis)(Bis)交聯(lián)而成的，催化劑為過(guò)硫酸銨交

3、聯(lián)而成的，催化劑為過(guò)硫酸銨(AP)(AP)，加速劑為四甲基乙二胺加速劑為四甲基乙二胺TEMED, TEMED, 構(gòu)成三維網(wǎng)狀凝膠。構(gòu)成三維網(wǎng)狀凝膠。聚丙烯酰胺凝膠聚丙烯酰胺凝膠polyacrylamide gel, PAG的聚合反響：的聚合反響： 緩沖液離子成分、緩沖液離子成分、PHPH的不延續(xù)性：電極緩沖液通常為的不延續(xù)性：電極緩沖液通常為pH8.3 Tris-pH8.3 Tris-甘氨酸緩沖液，甘氨酸緩沖液，樣品及凝膠中緩沖液為樣品及凝膠中緩沖液為pH6.7 Tris-HCLpH6.7 Tris-HCL緩沖液。電極緩沖液的緩沖液。電極緩沖液的pH=8.3pH=8.3，甘氨酸的電，甘氨酸的電

4、離小，有效遷移率小，稱為慢離子；濃縮膠中的氯離子完全電離，有效遷移率大，離小，有效遷移率小，稱為慢離子；濃縮膠中的氯離子完全電離，有效遷移率大，稱為快離子；蛋白質(zhì)在濃縮膠中介于二者之間。電泳開(kāi)場(chǎng)后，氯離子跑得最快，留稱為快離子；蛋白質(zhì)在濃縮膠中介于二者之間。電泳開(kāi)場(chǎng)后，氯離子跑得最快，留下一段低電導(dǎo)區(qū)，產(chǎn)生高電位梯度電位與電導(dǎo)率成反比，使甘氨酸離子追逐氯下一段低電導(dǎo)區(qū)，產(chǎn)生高電位梯度電位與電導(dǎo)率成反比，使甘氨酸離子追逐氯離子，蛋白質(zhì)夾在中間而被緊縮。離子，蛋白質(zhì)夾在中間而被緊縮。1cm1cm厚樣品層可以緊縮厚樣品層可以緊縮0.25m0.25m的厚度。的厚度。三大效應(yīng)：濃縮效應(yīng)三大效應(yīng)：濃縮效應(yīng)

5、 成分成分pH值值孔徑孔徑電泳緩沖液電泳緩沖液甘氨酸甘氨酸(慢離子慢離子)8.3樣品樣品蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)6.7濃縮膠濃縮膠Cl-(快離子快離子)6.7大大分離膠分離膠Cl-(快離子快離子)8.9小小有效遷移率有效遷移率 = 遷移率遷移率 解離度解離度分子篩效應(yīng)：分子量或分子大小和外形不同的蛋白質(zhì)分子篩效應(yīng)：分子量或分子大小和外形不同的蛋白質(zhì)經(jīng)過(guò)一定孔徑分別膠時(shí)，受阻滯的程度不同而表現(xiàn)出經(jīng)過(guò)一定孔徑分別膠時(shí)，受阻滯的程度不同而表現(xiàn)出不同的遷移率，這就是分子篩效應(yīng)。當(dāng)樣品進(jìn)入分別不同的遷移率，這就是分子篩效應(yīng)。當(dāng)樣品進(jìn)入分別膠，凝膠孔徑變小，分子量小，阻力小，挪動(dòng)快；分膠，凝膠孔徑變小，分子量小，阻力

6、小，挪動(dòng)快；分子量大，阻力大，挪動(dòng)慢。子量大，阻力大，挪動(dòng)慢。電荷效應(yīng)：電荷量不同，遷移率不同。電荷效應(yīng)：電荷量不同，遷移率不同。實(shí)驗(yàn)步驟實(shí)驗(yàn)步驟1.制備PAGE膠柱 畫(huà)線，封口：在一端取7cm和7.5cm兩處畫(huà)線，此 端管口插入橡皮墊。 制備分別膠：配制好7.5%分別膠，緩慢注入玻璃管 7cm處，加水防止氧化，室溫下聚合 聚合20-30min。 制備濃縮膠：配制好3%濃縮膠。將膠上層水傾倒出 去，用濾紙吸干余水。加濃縮膠，封 水。室溫下聚合20-30min。 2. 上樣和電泳：將凝膠管插入電泳槽槽底橡膠塞孔中，參與電極緩沖液與下電泳槽，隨后放入凝膠管及上槽，除氣泡, 加樣品液50l至濃縮膠面。加電解液直至裝滿上電泳槽。電泳約1.5hr。 3. 染色，察看結(jié)果：將膠從玻璃管中取出，留意不要弄斷凝膠。凝膠考馬斯亮藍(lán)染色，然后脫色，脫色至背景明晰。察看結(jié)果。結(jié)果表示圖：結(jié)果表示圖： 2 1 清蛋白清蛋白1 1丙烯酰胺和甲叉雙丙烯酰胺是神經(jīng)毒性試劑，丙烯酰胺和甲叉雙丙烯酰胺是神經(jīng)毒性試劑，對(duì)皮膚有刺激作用，留意防止直接接觸。對(duì)皮膚有刺激作用，留意防止直接接觸。2 2制膠時(shí)，要充分搖勻，加速劑制膠時(shí)，要充分搖勻，加速劑TEMEDTEMED最后加。最