水體中反硝化細(xì)菌的分離、篩選與初步鑒定

1、水體中反硝化細(xì)菌的分離、篩選與初步鑒定邵基倫 環(huán)境工程專業(yè)摘要： 當(dāng)今世界環(huán)境污染日益加重，尤其是水體污染已嚴(yán)重影響人們的日常生活與身體健 康。水污染是多方面的因素綜合作用， 而以氨氮的污染最為廣泛且嚴(yán)重。 所以控制污水中的 氨氮含量是污水處理中的重要內(nèi)容。 污水脫氮的基本原理是污水中的含氮有機(jī)物首先經(jīng)過微 生物的氨化作用轉(zhuǎn)化為氨， 硝化細(xì)菌的硝化作用， 將氨氧化為亞硝酸鹽， 并繼續(xù)氧化為硝酸 鹽。硝酸鹽經(jīng)過反硝化細(xì)菌的反硝化作用轉(zhuǎn)化為氮?dú)獾拳h(huán)節(jié)成分而釋放到大氣中， 從而實(shí)現(xiàn) 污水脫氮。 硝化作用是這一過程中的一個(gè)中間環(huán)節(jié)， 也是一個(gè)重要環(huán)節(jié)。 硝化作用是指氨經(jīng) 過微生物的作用氧化為亞硝酸和硝

2、酸的過程， 由硝化細(xì)菌完成。 硝化細(xì)菌是一類好樣化能自 養(yǎng)細(xì)菌， 包括亞硝化細(xì)菌和硝化細(xì)菌兩個(gè)亞群。 硝化細(xì)菌能夠利用還原態(tài)無機(jī)氮化合物進(jìn)行 自養(yǎng)生長(zhǎng)， 硝化細(xì)菌的生命活動(dòng)在污水脫氮中起重要作用。 由于硝化細(xì)菌是化能自養(yǎng)菌， 其 生長(zhǎng)速率很慢， 因此硝化、 亞硝化細(xì)菌的生命活動(dòng)成為污水脫氮的關(guān)鍵步驟之一。 它們能有 效降低水體中氨氮及亞硝酸氮的含量， 對(duì)水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)及環(huán)境保護(hù)具有重要意義。硝化細(xì)菌是生物硝化脫氨中起主要作用的微生物， 直接影響硝化效果和生物脫氨的效率。 因?yàn)橄趸?xì)菌、 亞硝化細(xì)菌在污水脫氮中的特殊意義，對(duì)這類微生物的研究受到廣泛關(guān)注。 氨和亞硝酸分別是亞硝化菌和硝化菌的唯一能源。

3、 對(duì)于硝化細(xì)菌來說生長(zhǎng)環(huán)境中的溫度對(duì)其 影響較大，pH值和鹽度的影響相對(duì)較小。大多數(shù)硝化細(xì)菌的合適生長(zhǎng)溫度為1038 C,高于20C時(shí)硝化細(xì)菌的活性較高，但超過38C消化作用將會(huì)消失。當(dāng)環(huán)境氣溫低于20C時(shí)，氨的轉(zhuǎn)化會(huì)受到影響。一般認(rèn)為，適宜硝化菌和亞硝化菌生長(zhǎng)介質(zhì)的pH 值分別為 6.08.5和 6.0 8.0。水體 DO 的高低影響到好氧、厭氧微生物的比例，大多數(shù)研究人員認(rèn)為DO 的濃度應(yīng)當(dāng)控制在1.02.0 mg/L,低于0.5 mg/L時(shí)硝化作用明顯減弱。另外,碳氮比、堿度等對(duì)硝化及脫氨均有影響。本實(shí)驗(yàn)采用人工培養(yǎng)基方法富集培養(yǎng)硝化細(xì)菌 研究了富集培養(yǎng)過程中硝化與亞硝化細(xì)菌的 結(jié)構(gòu)和性

4、質(zhì)變化。 結(jié)果表明，在25-28 C, pH7 .58.5, D0 2-5mg / L ,氨氮濃度100 150mg L 條件下， 經(jīng)過 19d 和 15d 的富集培養(yǎng)， 可以得到硝化速率為 4.18mg(NH3-N)-g(MLSS)/h 和 10.1mg(NH4-N)-g(MLSS)/h 的硝化細(xì)菌培養(yǎng)物在這種富集培養(yǎng)過程中,硝化細(xì)菌培養(yǎng) 物的污泥色澤和結(jié)構(gòu)、MLSS、SV30、SVI、硝化強(qiáng)度和硝化速率等均出現(xiàn)規(guī)律性變化且隨培養(yǎng)方法不同表現(xiàn)出明顯差異。關(guān)鍵詞：硝化細(xì)菌；反硝化細(xì)菌；脫氮；富集培養(yǎng)；硝化速率；活性污泥；載體Abstract: In today's world envi

5、ronment pollution is aggravating, especially the water pollution has seriously affect People's Daily life and health. Water pollution is various factors, and ammonia nitrogen pollution in the most extensive and severe. So control of ammonia nitrogen content is sewage wastewater treatme nt in the

6、 importa nt content. The basic prin ciple of sewage den itrificatio n is the n itroge n orga nic wastewater by microbes fun cti on first ammoni ati on into ammonia, nitrifying bacteria of nitrification, will ammonia oxidation as nitrite, and continue to oxidatio n as n itrate. Nitrate after den itri

7、fy ing bacteria aga in st n itrificati on into n itroge n links such as composition and released to the atmosphere, so as to realize the sewage denitrification. Is this a n itrificati on process of a in termediate link, and also an importa nt link. Nitrificati on refers to the role of ammonia after

8、microbial oxidation and the process of nitric acid based, by nitrifying bacteria complete. Nitrifying bacteria is a kind of photosynthetic bacteria can fleas, including the n itrify ing bacteria and n itrify ing bacteria two subsets. Nitrify ing bacteria can use Yuan Tai inorganic nitrogen compounds

9、 are also growing autotrophic, nitrifying bacteria in the life activities of sewage denitrification plays an important role. Because of nitrifying bacteria is which can sustain bacterium, the growth rate is slow, therefore nitrification, nitrosation bacteria life activities of sewage den itrificati

10、on become one of the key steps. They can effectively reduce the water in ammonia n itroge n based and n itroge n content, aquaculture and environmen tal protect ion to have the important meaning, dressfying bacteria is biological nitration take off to play a major role ammonia of microbes, directly

11、in flue nce the effect and biological n itrificatio n off the efficie ncy of ammo nia. Because n itrify ing bacteria, den itrify ing bacteria in the sewage and denitrification of special significance, for this kind of microbe study is widely concerned about.Ammon ia and respectively based n itrosati

12、 on bacteria and is the only en ergy den itrify ing bacteria. The esse ntial bacteria growth environment for it to its large effect on the temperature, pH value and sali nity in flue nce is relatively minor. The most esse ntial bacteria growth temperature right for 10 to 38 °C, 20 °C highe

13、r than when the activity of nitrifying bacteria are higher, but more than 38 C digestive function will disappear. Whe n the environment temperature less tha n 20 C, ammon ia tran sformatio n can be affected. Gen erally, appropriate den itrify ing bacteria and the denitrifying bacteria growth medium

14、pH value were 6.0 8.5 and 6.0 8.0. The water DO willaffect the good oxyge n, an aerobic microbe proport ion, most researchers think the concen trati on shall control in DO 1.0 2.0 mg/L, less than 0.5 mg/L nitrification when significantly weakened. In additi on, carb on and n itroge n, basicity on th

15、a n n itrificati on and take off all affect the ammonia.This experime nt used artificial medium en richme nt of n itrify ing bacteria cultivati on method. The process of cultivati on of n itrati on and en richme nt of n itrify ing bacteria and the structure and properties of change. The results show

16、 that, in 25 to 28 °C, pH7.5 8.5, D0 2-5 mg/L, ammonia nitrogen's 100-150 mg/L conditions, after 19 d and 15 d enrichment training, can get nitration rate for 4.18 mg (NH3_N)_g (MLSS) / h a nd 10.1 mg (NH4_N)_g (MLSS) / h of n itrifyi ng bacteria culture substanee. In this enrichment proces

17、s of cultivation, nitrifying bacteria culture substance of sludge colour and lustre and structure, MLSS, SV30, SVI, nitrificati。n strength and nitration rate all appear to regular cha nge with differe nt methods and training showed obvious differe nce.Key words : Nitrifying bacteria; Denitrifying ba

18、cteria ; Denitrification; Enrichment training; Nitration rate; Activated sludge; carrier引言據(jù)2010年環(huán)境狀況公報(bào)顯示，我國(guó)環(huán)境總體形勢(shì)依然十分嚴(yán)峻. 湖泊（水庫(kù)） 富營(yíng)養(yǎng)化問題依然突出，在監(jiān)測(cè)營(yíng)養(yǎng)狀態(tài)的26個(gè)湖泊（水庫(kù)）中，富營(yíng)養(yǎng)化狀態(tài) 的占42.3%.水體的富營(yíng)養(yǎng)化問題主要由水體中的總氮超標(biāo)所引起由于氮元素 污染的危害，脫氮已經(jīng)成為水處理和防止氮素危害的重要一步目前普遍認(rèn)為， 生物脫氮是水處理中防止氮素危害最經(jīng)濟(jì)有效的方法之一.傳統(tǒng)生物脫氮途徑一般包括硝化和反硝化兩個(gè)步驟，即在好氧條件下通過自養(yǎng)硝化菌

19、的作用，將水中氨氮（NH4+-N）轉(zhuǎn)化為硝酸氮（NO-N）或亞硝酸氮（NO-N），然后在缺氧或 厭氧條件下，利用反硝化菌將硝酸氮和亞硝酸氮還原為氮?dú)?，達(dá)到脫氮的目的.由于兩個(gè)菌的作用條件不同，這兩個(gè)過程不能同時(shí)發(fā)生，只能序列進(jìn)行.近些年來， 不斷有好氧反硝化細(xì)菌的分離報(bào)道，好氧反硝化現(xiàn)象的出現(xiàn)突破了傳統(tǒng)理論的束 縛，使人們對(duì)生物脫氮技術(shù)的發(fā)展有了全新的認(rèn)識(shí).已有文獻(xiàn)報(bào)道一些好氧反硝化細(xì)菌同時(shí)具有異養(yǎng)硝化功能，這一發(fā)現(xiàn)為同時(shí)硝化反硝化工藝（simulta neousntrification denitrification，SND）發(fā)展奠定了理論基礎(chǔ).因此異養(yǎng)硝化好氧反硝化菌正成為研 究的熱點(diǎn)文獻(xiàn)

20、報(bào)道的許多菌屬 如： Pseudomonas stutzeri,Thiosphaerpa ntotropha,Alcalige nesfaecalis,Pseudo mon asputida 等 都具有良 好的異養(yǎng)硝化好氧反硝化作用 ,故從我校師琴湖取水，通過富集分離到一株具 有好氧反硝化能力的細(xì)菌 ,該菌株命名為 ADB 通過形態(tài)觀察和序列分析，對(duì)菌 株ADB進(jìn)行初步鑒定。初步探討了不同碳源種類、碳氮比、PH值、溫度對(duì)菌株ADB 脫氨氮作用的影響 .為后面的實(shí)現(xiàn)同時(shí)硝化反硝化工藝做前期的理論研 究同時(shí)氮素是我國(guó)水體污染和富營(yíng)養(yǎng)化的主要因素,生物脫氮技術(shù)因其經(jīng)濟(jì)、有效、易操作、無二次污染等特點(diǎn)

21、 ,是近年來的研究熱點(diǎn)之一。傳統(tǒng)的生物脫氮 技術(shù)必須經(jīng)過好氧硝化和厭氧反硝化兩個(gè)相對(duì)獨(dú)立的反應(yīng)過程 ,好氧反硝化與傳 統(tǒng)的厭氧反硝化脫氮相比 ,具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì) :一方面 ,在有氧條件下進(jìn)行反硝化 ,硝 化和反硝化作用可同時(shí)在一個(gè)反應(yīng)器中進(jìn)行 ,設(shè)備與操作成本大幅下降 ;另一方面 , 硝化作用的產(chǎn)物可以直接作為反硝化作用的底物 ,避免抑制硝化作用 ,使得硝化和 反硝化進(jìn)程加劇?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)一些好氧反硝化細(xì)菌,如Alcaligenes faecalis, Pseudomo nasputid和P. stutzeri等，但現(xiàn)有報(bào)導(dǎo)的好氧反硝化細(xì)菌反硝化活性都較 弱,無法滿足實(shí)際污水的生物脫氮需要 ,因而高

22、效好氧反硝化細(xì)菌的篩選是一項(xiàng)重 要基礎(chǔ)性工作 ,本研究擬從氮素嚴(yán)重積累的水產(chǎn)養(yǎng)殖水體、污泥及農(nóng)村河道中篩 選高效好氧反硝化細(xì)菌 ,并初步探索篩選獲得的菌株在不同培養(yǎng)條件下的反硝化 特性,以期為污水生物脫氮技術(shù)的應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。1. 實(shí)驗(yàn)部分1.1 材料和方法1.11菌種來源 好氧反硝化細(xì)菌 ADB 菌種為本實(shí)驗(yàn)室從我校師琴湖水中分離獲 得1.12培養(yǎng)基的制備反硝化細(xì)菌富集分離培養(yǎng)基成分（g/L）:為Na2HPO4 7H2O 為 7.9; KH2PO4 為 1.5; NH4Cl 為 0.3; Mg2SO4。7H2O 為 0.1; 丁二酸鈉為 4.7; KNO3 為 2； NaNO2 為 0.5

23、；微量元素溶液為 2mL。微量元素溶液成分（g/L）: EDTA 為 50.0;ZnSO4為 2.2;CaCI2 為 5.5;MnCI24H2O 為 5.06; FeSO47H2O 為 5.0; CuSO45H2O 為 1.57; CoCl2 6H2O 為 1.61; PH 為 7.0-7.5反硝化測(cè)定培養(yǎng)基：不添加KN03和NH4CI，初始亞硝酸氮質(zhì)量濃度為 100mg/L,其它與反硝化細(xì)菌富集分離培養(yǎng)基基本一致。 脫氨氮測(cè)定培養(yǎng)基不添加 KN03 和 NaN02， （NH4）2S04 代替 NH4CI ， （NH4）2S04 和丁二酸鈉含量隨實(shí)驗(yàn)內(nèi)容而變其它與反硝化細(xì)菌富集分離培養(yǎng)基 基本

24、一致。1.2 實(shí)驗(yàn)試劑 無氨蒸餾水（淮安化工二廠）、氫氧化鈉 （AR）（ 上海試劑四廠）、 碘化鉀（AR）（南京化學(xué)試劑一廠）、碘化汞（AR）（浙江臨平化工試劑廠）、酒石酸鉀 鈉（AR）（南京化學(xué)試劑一廠）、氯化銨（AR）（浙江臨平化工試劑廠）、鹽酸（GR）、瓊 脂 （江蘇疾病預(yù)防控制中心微生物試劑廠 ）1.3 實(shí)驗(yàn)儀器 恒溫培養(yǎng)箱 （上海虹光化工廠 ）、滅菌爐 （上海泗聯(lián)化工廠 ）、試管、 250ml錐形瓶（南京化學(xué)試劑一廠）、培養(yǎng)皿、分析天平（上?？等A儀器廠）、電爐（上 ?？等A儀器廠 ）、酒精燈 （上海虹光化工廠 ）、接種環(huán)、分光光度計(jì) （上海虹光化工 廠）、電子顯微鏡 （上海康華儀器廠

25、）2. 實(shí)驗(yàn)方法2.1 反硝化細(xì)菌的分離與鑒定 將采集到的海水樣本分別放在兩個(gè)培養(yǎng)皿中， 分別加入反硝化菌液體培養(yǎng)基和硝 化菌液體培養(yǎng)基，放在24C地培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5天，然后取培養(yǎng)液在固體培養(yǎng)基上 進(jìn)行分區(qū)劃線，得到單菌落，再挑取單菌落進(jìn)行分區(qū)劃線分離。2.2形態(tài)結(jié)構(gòu)鑒定（1）將分離得到的單菌落分別接種到肉湯培養(yǎng)基的平板上看其是否生長(zhǎng)（硝化 細(xì)菌是嚴(yán)格的自養(yǎng)菌，在肉湯培養(yǎng)基上不能生長(zhǎng)）。（ 2）鏡檢觀察：?jiǎn)稳旧?（3）在培養(yǎng)液中加入格利斯試劑，反硝化菌培養(yǎng)液變紅即可判斷為陽(yáng)性，硝化 菌的培養(yǎng)液需比色計(jì)算出其亞硝酸根濃度是否降低，才能判斷是否為硝化菌。 2.3細(xì)菌的純培養(yǎng)（搖瓶、發(fā)酵罐）（1）

26、搖瓶培養(yǎng)：將初步鑒定是硝化細(xì)菌的菌落接種到搖瓶中20-28E培養(yǎng)，200 轉(zhuǎn)/分鐘，每隔五天取樣一次測(cè)硝化作用強(qiáng)度和菌濃度。（2）發(fā)酵培養(yǎng)：將培養(yǎng)5天的種子加入發(fā)酵罐中，于20-28T培養(yǎng)，其中pH控制 在6.0以上。每隔 12小時(shí)取樣測(cè)亞硝酸根濃度和菌濃度。2.3反硝化細(xì)菌的鏡檢2.31試劑：生理鹽水、結(jié)晶紫、盧哥氏碘液、碘化鉀、碘片、95%的乙醇、二甲苯、番紅2.32儀器：光學(xué)顯微鏡（南京化學(xué)試劑一廠）、載玻片、蓋玻片（上海虹光化工廠） 2.33涂片：取干凈的載玻片于實(shí)驗(yàn)臺(tái)上，在載玻片的中央滴一滴無菌蒸餾水， 將 接種環(huán)在火焰上燒紅，待冷卻后從斜面挑取少量培養(yǎng)物與玻片上的水滴混勻后， 在載

27、玻片上涂布成一均勻的薄層，涂布面不宜過大。待涂布成一均勻的薄層后， 將蓋玻片從一端緩慢的蓋在載玻片上，已完全覆蓋菌群為最佳2.34染色：由于微生物細(xì)胞含有大量水分，機(jī)體是無色透明的，與周圍背景沒有 明顯的反差，必須進(jìn)行染色，使經(jīng)染色后的菌體與背景形成明顯的色差，從而能 更清楚地觀察到其形態(tài)和結(jié)構(gòu)。微生物細(xì)胞是由蛋白質(zhì)、核酸等兩性電解質(zhì)及其 他化合物組成。所以，微生物細(xì)胞表現(xiàn)出兩性電解質(zhì)的性質(zhì)。細(xì)菌帶負(fù)電荷多， 容易與帶正電荷的堿性染料結(jié)合，故用堿性染料染色的較多。用堿性染料從一端 用滴管慢慢滲入使樣品變色即可。染色反應(yīng)呈藍(lán)紫色的稱為革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌，用 G+表示；染色反應(yīng)呈紅色的稱為革蘭氏陰性細(xì)

28、菌，用G-表示。2.35干燥與鏡檢：涂片最好在室溫下使其自然干燥，有時(shí)為了使之干得更快些， 可將標(biāo)本面向上，手持載玻片一端的兩側(cè)，小心地在酒精燈上高處微微加熱， 使 水分蒸發(fā)，但切勿緊靠火焰或加熱時(shí)間過長(zhǎng)，以防標(biāo)本烤枯而變形。最后將準(zhǔn)備 好的樣片放在顯微鏡下觀測(cè)反硝化細(xì)菌的形態(tài)并且照下細(xì)菌的形態(tài)。見如下圖：3結(jié)果與分析采用人工培養(yǎng)基的方式富集培養(yǎng)硝化細(xì)菌.對(duì)富集培養(yǎng)過程硝化、反硝化細(xì)菌的 形態(tài)以及培養(yǎng)系統(tǒng)生物相進(jìn)行觀察和比較分析，結(jié)果見圖1和圖2。在富集培養(yǎng)方法中.采用生活污水作為反硝化細(xì)菌的菌種， 在富集培養(yǎng)初期的活 性污泥絮體內(nèi)可觀察到線蟲、鐘蟲、輪蟲、滴蟲，藻類等多種微生物，隨著培養(yǎng) 的

29、進(jìn)行，這些微生物逐漸消失.但仍可見少量載體。在富集培養(yǎng)過程中菌落顏色 發(fā)生明顯變化，最初為暗褐色，隨著培養(yǎng)的進(jìn)行.顏色運(yùn)漸變淺，尤其是第16-19d 時(shí)變化更為明顯。在添加載體的硝化細(xì)菌富集培養(yǎng)方法中，反硝化細(xì)菌生長(zhǎng)環(huán)境發(fā)生了較大變化， 在富集培養(yǎng)初期培養(yǎng)物呈純向色，隨著富集培養(yǎng)的進(jìn)行顏色逐漸變至淡黃色， 尤其是第10 12d變化明顯。在培養(yǎng)過程中沒有觀察到原生動(dòng)物、藻類和微型后 生動(dòng)物的存在。4展望 反硝化細(xì)菌在污水脫氮過程中具有重要的意義， 加強(qiáng)對(duì)反硝化細(xì)菌的研究對(duì)提高 污水脫氮水平， 不斷改進(jìn)污水處理工藝具有重要的參考意義。 近年來， 我國(guó)對(duì)反 硝化細(xì)菌進(jìn)行了一些分子水平的研究， 還需要

30、不斷深入。 第一： 加強(qiáng)對(duì)硝化語(yǔ)反 硝化作用分子生態(tài)學(xué)的研究， 即綜合應(yīng)用現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)， 研究反硝化過程 中的微生物生態(tài)結(jié)構(gòu)和生態(tài)機(jī)制， 為提高污水的脫氮處理效率提供理論指導(dǎo)。 第 二：加強(qiáng)反硝化作用微生物的分子生物學(xué)研究， 即在理論上闡明硝化微生物在活 性污泥中的作用機(jī)制， 克隆硝化過程中的相關(guān)酶的基因， 通過基因的改造， 改善 酶對(duì)氨的親和力，提高反硝化作用速率和效率，從而達(dá)到較好的污水處理效果。 5.致謝 我認(rèn)為要想完成一篇合格的本科畢業(yè)論文， 光靠個(gè)人的付出還是不夠的。 要有來 自多方的協(xié)助， 有來自老師的關(guān)懷尤其是鄒海明老師對(duì)我的悉心指導(dǎo)、 同學(xué)的幫 助還有大量實(shí)驗(yàn)器材的提供等等。 所以我想在此感謝所有為了完成論文而不辭辛 苦的老師和同學(xué)們！想大聲對(duì)你們說一聲：謝謝！你們辛苦了！ 6.參考文獻(xiàn)1 Kenji Furukawa Aldkoike and Masanori fujita Pr