病毒轉(zhuǎn)基因技術(shù)原理腺相關(guān)病毒學(xué)習(xí)教案

1、會計學(xué)1病毒轉(zhuǎn)基因技術(shù)原理病毒轉(zhuǎn)基因技術(shù)原理 腺相關(guān)病毒腺相關(guān)病毒第一頁，編輯于星期日：十八點 二十六分。l生物學(xué)特性生物學(xué)特性l致病性與免疫性致病性與免疫性第1頁/共46頁第二頁，編輯于星期日：十八點 二十六分。l血清型血清型l病毒結(jié)構(gòu)病毒結(jié)構(gòu)l病毒復(fù)制病毒復(fù)制l對理化因素的抵抗力對理化因素的抵抗力第2頁/共46頁第三頁，編輯于星期日：十八點 二十六分。血清型血清型l AAV是從腺病毒的污染物（1965年）、人群或非人靈長類動物等的組織中分離鑒定到的。l共鑒定了11個AAV血清型以及108個AAV變株（variants）。l通過簽名PCR（signature PCR）技術(shù)，利用高度保守序列擴

2、增Cap基因的一小段可變區(qū)的DNA序列，以篩檢是否是新的AAV分離株，然后利用PCR技術(shù)獲得新的AAV分離株的Cap或（和）Rep基因的全長序列。在人類、非人靈長類動物、馬、豬、牛、綿羊、山羊和蛇等的不同組織器官，發(fā)現(xiàn)了大量的具有多樣性的AAV的基因組。但新分離的病毒株，尚未進(jìn)行血清學(xué)分型，通稱為變株。lAAV不同血清型和變株的基因組結(jié)構(gòu)相對較為保守，與AAV-2型較為類似，不同血清型的衣殼蛋白結(jié)構(gòu)中表位的差異。50 80% AAV-2抗體在人群中檢測出。第3頁/共46頁第四頁，編輯于星期日：十八點 二十六分。轉(zhuǎn)導(dǎo)不同組織器官的轉(zhuǎn)導(dǎo)不同組織器官的AAVAAV最優(yōu)血清型最優(yōu)血清型 不同血清型在吸

3、附細(xì)胞表面能力、病毒受體、胞內(nèi)交通和抗原性等方面具有明顯的區(qū)別，以及針對不同組織和細(xì)胞的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率不一致，體現(xiàn)出不同的組織極性（tissue tropisms） 第4頁/共46頁第五頁，編輯于星期日：十八點 二十六分。病毒結(jié)構(gòu)病毒結(jié)構(gòu)lAAV-2 2030 nm，基因組為線性、單鏈的DNA分子。正鏈和負(fù)鏈的單鏈DNA分子，以同等效率包裝在病毒體衣殼中?；蚪M全長4679個核苷酸。l基因組包括兩個ORF，三個啟動子（啟動子以在基因組中處的作圖位置標(biāo)示，分別為p5、p19和p40啟動子），以及兩末端為145個核苷酸的反向末端重復(fù)序列（inverted terminal repeat，ITR） 第5頁

4、/共46頁第六頁，編輯于星期日：十八點 二十六分。ITRITRlITR中的前125個核苷酸具有回文結(jié)構(gòu)，其中還存在兩個小的內(nèi)部回文結(jié)構(gòu)，可自身折疊后經(jīng)堿基配對、形成T字形的發(fā)夾結(jié)構(gòu)；剩余的20個核苷酸，保持非配對狀態(tài)，稱為D序列（D sequence）。lITR中還具有Rep結(jié)合元件（Rep binding elements， RBEs) RBE和 RBE ， 以及一個末端解離位點TRS（terminal resolution site）等重要序列。lITR是在AAV生物學(xué)中重要的順式（cis）作用活性元件，在病毒復(fù)制中具有重要作用：在非容許條件下，ITR在病毒復(fù)制的負(fù)調(diào)控中起關(guān)鍵作用；在容許

5、條件下，作為病毒基因組復(fù)制的起點和引物。lITR對病毒基因組的包裝、轉(zhuǎn)錄、以及位點特異性的整合，均是必需的。 第6頁/共46頁第七頁，編輯于星期日：十八點 二十六分。左端的左端的ORF（Rep基因）基因）l可編碼四個Rep蛋白，即Rep78， Rep68，Rep52和Rep40，均具有螺旋酶和ATP酶活性。較大的Rep蛋白如Rep78和 Rep68，由P5啟動子指導(dǎo)轉(zhuǎn)錄，分別由未剪輯和剪輯的轉(zhuǎn)錄物產(chǎn)生，具有鏈和位點特異的核酸內(nèi)切酶活性（切割點在TRS附近）以及位點特異的DNA結(jié)合活性（結(jié)合于RBE）。因此它們是重要的調(diào)節(jié)蛋白，以反式（trans）方式參與調(diào)節(jié)AAV復(fù)制周期的所有階段，如 DNA

6、復(fù)制、位點特異性整合、整合病毒基因組的拯救，調(diào)節(jié)病毒和細(xì)胞內(nèi)基因表達(dá)的啟動子等。l較小的Rep蛋白如Rep52和Rep40，由P19啟動子指導(dǎo)轉(zhuǎn)錄，分別由未剪輯和剪輯的轉(zhuǎn)錄物產(chǎn)生，參與單鏈DNA的聚集并包裝入病毒體的衣殼。 第7頁/共46頁第八頁，編輯于星期日：十八點 二十六分。右端的右端的ORF（Cap基因）基因）l由P40啟動子指導(dǎo)轉(zhuǎn)錄，產(chǎn)生兩個轉(zhuǎn)錄物，可編碼三個病毒衣殼蛋白，即VP1，VP2和VP3。l這些衣殼蛋白利用共同的ORF ，但轉(zhuǎn)錄起始位置不一致。l一般而言，VP1、VP2和VP3的分子比是1：1：8/10。l構(gòu)成這些病毒體的衣殼蛋白的比例的差異，最有可能會影響病毒的感染性，尤其

7、是VP1含量低的情況下。缺乏VP1的病毒體沒有感染性。 第8頁/共46頁第九頁，編輯于星期日：十八點 二十六分。病毒復(fù)制病毒復(fù)制八個主要步驟：與細(xì)胞表面受體黏附或結(jié)合內(nèi)吞（endocytosis）在細(xì)胞內(nèi)經(jīng)內(nèi)吞體運輸釋放出內(nèi)吞體進(jìn)入胞核脫殼并釋放病毒基因組啟動雙鏈DNA的合成整合到細(xì)胞染色體或以附加子形式持久表達(dá)病毒基因第9頁/共46頁第十頁，編輯于星期日：十八點 二十六分。不同血清型的AAV感染的細(xì)胞類型不同，這取決于不同血清型的AAV靶向細(xì)胞表面的受體的差異。而且這也決定了不同血清型的病毒在細(xì)胞內(nèi)的不同的運輸途徑 AAVAAV病毒的糖苷受體和輔助受體病毒的糖苷受體和輔助受體第10頁/共46

8、頁第十一頁，編輯于星期日：十八點 二十六分。AAV病毒基因組的復(fù)制模型左為病毒基因組的復(fù)制模型左為RFm，右為，右為RFd） Rep 蛋白蛋白第11頁/共46頁第十二頁，編輯于星期日：十八點 二十六分。lAAVAAV成功感染細(xì)胞后，依據(jù)是否有輔助病毒存在的情成功感染細(xì)胞后，依據(jù)是否有輔助病毒存在的情況下：裂解階段（況下：裂解階段（ lytic stagelytic stage）和溶原性階段（）和溶原性階段（lysogenic lysogenic stagestage） AAVAAV的復(fù)制周期可以分為兩個階段的復(fù)制周期可以分為兩個階段溶原性階段（lysogenic stage）:在缺乏輔助病毒如

9、AdV、HSV等感染的情況下，AAV幾乎不能復(fù)制，基因表達(dá)受到抑制，AAV基因組會整合到染色體的一個4kb大小的區(qū)域（命名為AAVS1），建立潛伏感染 裂解階段（ lytic stage）:在輔助病毒如AdV、HSV-1等共同感染的情況下，AAV可以經(jīng)歷核酸復(fù)制、病毒基因表達(dá)和病毒體產(chǎn)生等過程，最終形成產(chǎn)毒性感染 受到羥基脲、拓?fù)洚悩?gòu)酶抑制劑或紫外線照射等處理，在缺乏輔助病毒的情況下，也可以刺激AAV的復(fù)制。AAV的復(fù)制在某些細(xì)胞也可以自發(fā)發(fā)生。 第12頁/共46頁第十三頁，編輯于星期日：十八點 二十六分。l染色體的染色體的AAVS1AAVS1位點中最少位點中最少 33bp33bp的序列，包含

10、由的序列，包含由8 8個核苷酸分開的個核苷酸分開的RBERBE樣和樣和 TRSTRS樣序列，對樣序列，對AAVAAV的靶向整合是必須而且充分的條件。位點特異性的整合過程的靶向整合是必須而且充分的條件。位點特異性的整合過程即使是在即使是在Rep78Rep78和和 Rep68Rep68蛋白理想表達(dá)的條件下，未必是完全是位點特異的，大約蛋白理想表達(dá)的條件下，未必是完全是位點特異的，大約40-40-70%70%的整合發(fā)生在的整合發(fā)生在AAVS1AAVS1位點位點溶原性階段（溶原性階段（lysogenic stagelysogenic stage） 第13頁/共46頁第十四頁，編輯于星期日：十八點 二十

11、六分。lAdVAdV能提供輔助功能的基因有能提供輔助功能的基因有E1aE1a，E1b55KE1b55K，E2aE2a，E4orf6 E4orf6 和和 VA VA RNA RNA （viral associated RNAviral associated RNA）。）。l HSV-1HSV-1能提供輔助能提供輔助AAVAAV復(fù)制功能復(fù)制功能，至少涉及，至少涉及HSV-1HSV-1的復(fù)制蛋白，包的復(fù)制蛋白，包括括helicase/primase complex (UL5, helicase/primase complex (UL5, UL8, UL8, 和和 UL52) UL52) 和和DNAD

12、NA結(jié)合蛋白結(jié)合蛋白ICP8ICP8（UL29UL29）。）。 裂解階段（裂解階段（ lytic stagelytic stage）第14頁/共46頁第十五頁，編輯于星期日：十八點 二十六分。對環(huán)境理化因素的抵抗力對環(huán)境理化因素的抵抗力lAAV對理化因素如溫度和pH的抵抗力強。l對化學(xué)消毒劑如1的次氯酸鈉、2戊二醛、十二烷基硫酸鈉等敏感。 第15頁/共46頁第十六頁，編輯于星期日：十八點 二十六分。l約約80%80%的人群的血清抗的人群的血清抗AAVAAV抗體陽性，這些抗體抗體陽性，這些抗體針對的血清型是針對的血清型是AAV-1AAV-1，2 2，3 3和和AAV-5AAV-5型。型。l但針對

13、但針對AAV AAV 在人群自然感染史的認(rèn)識非常少，在人群自然感染史的認(rèn)識非常少，且未發(fā)現(xiàn)這些感染導(dǎo)致臨床典型的病理改變或疾且未發(fā)現(xiàn)這些感染導(dǎo)致臨床典型的病理改變或疾病。病。 第16頁/共46頁第十七頁，編輯于星期日：十八點 二十六分。l蛋白表達(dá)型腺相關(guān)病毒載體蛋白表達(dá)型腺相關(guān)病毒載體 l基因打靶型腺相關(guān)病毒載體基因打靶型腺相關(guān)病毒載體 lrAAVrAAV的純化和定量的純化和定量 三成分包裝系統(tǒng) 自我互補型AAV 載體（self-complementary AAV vector， scAAV） 反式剪接型AAV 載體（trans-splicing AAV vector, tsAAV）衣殼蛋白修

14、飾型AAV載體 第17頁/共46頁第十八頁，編輯于星期日：十八點 二十六分。第一部分第一部分 蛋白表達(dá)型腺相關(guān)病毒載體蛋白表達(dá)型腺相關(guān)病毒載體l三成分包裝系統(tǒng) :重組AAV病毒體（rAAV，ssAAV, Sigle-stranded AAV）的組裝，必須依賴于三種成分， 即：轉(zhuǎn)移載體，由轉(zhuǎn)基因表達(dá)讀框以及兩側(cè)的野生型AAV的ITR區(qū)組成； AAV的cap和rep編碼序列；輔助病毒功能建立了各種各樣的方法和細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)以制備rAAV，并且這些方法和培養(yǎng)系統(tǒng)還在不斷完善之中 目前最常使用的rAAV載體系統(tǒng)是二(或三)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HEK293法(two/three plasmid transfectio

15、n of adherent HEK293 cells)，包括rAAV轉(zhuǎn)移載體，rAAV輔助質(zhì)粒和(或)輔助病毒質(zhì)粒三部分 第18頁/共46頁第十九頁，編輯于星期日：十八點 二十六分。l三成分包裝系統(tǒng) : rAAV轉(zhuǎn)移載體僅保留野生型AAV基因組中決定其復(fù)制、包裝和整合必須的順式作用元件基因組兩端的ITR序列；全部去掉rep 和cap基因及其控制序列，用外源基因及其控制序列代替。實際包裝外源基因的上限僅為。rAAV輔助質(zhì)粒是克隆的ITR缺失的野生型AAV的基因組，以反式方式提供rep 和cap基因編碼蛋白的功能。目的在于病毒包裝過程中，避免野生型AAV病毒的形成。AdV輔助病毒質(zhì)粒，包括其起輔助

16、功能的基因E2a，E4orf6 和 VA RNA。E1a和E1b55K可由HEK293細(xì)胞提供。 第一部分第一部分 蛋白表達(dá)型腺相關(guān)病毒載體蛋白表達(dá)型腺相關(guān)病毒載體第19頁/共46頁第二十頁，編輯于星期日：十八點 二十六分。l三成分包裝系統(tǒng)優(yōu)點:l三成分包裝系統(tǒng)不足:快速、有效，避免了輔助病毒的使用當(dāng)rAAV用于心臟、肝臟和骨骼肌等器官時，制備大量的rAAV耗時、耗力 采用大規(guī)模懸浮細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)可克服這一障礙，并研制了三種替代的方法 第一部分第一部分 蛋白表達(dá)型腺相關(guān)病毒載體蛋白表達(dá)型腺相關(guān)病毒載體第20頁/共46頁第二十一頁，編輯于星期日：十八點 二十六分。l三成分包裝系統(tǒng)的大規(guī)模懸浮細(xì)胞培

17、養(yǎng)技術(shù):采用重組桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)BEVS（baculovirus expression vector system），提供三種成分并感染昆蟲細(xì)胞或利用包含cap和rep的穩(wěn)定包裝昆蟲細(xì)胞系；包含cap和rep的穩(wěn)定包裝哺乳動物細(xì)胞系，并通過感染AdV提供輔助功能；利用哺乳動物細(xì)胞系和重組HSV-1提供cap和rep，rAAV和輔助功能。 第一部分第一部分 蛋白表達(dá)型腺相關(guān)病毒載體蛋白表達(dá)型腺相關(guān)病毒載體第21頁/共46頁第二十二頁，編輯于星期日：十八點 二十六分。策略策略2 constructed Ad helper plasmids that are cotransfected onto E

18、1a/E1b-expressing 293 cells along with a plasmid that expresses the rep and cap genes and a vector plasmid60C, 30 minForty-eight to seventy-two hours after transfectionAd is inactivated by heat treatment第22頁/共46頁第二十三頁，編輯于星期日：十八點 二十六分。第23頁/共46頁第二十四頁，編輯于星期日：十八點 二十六分。l自我互補型AAV 載體（self-complementary AAV

19、 vector， scAAV） 重組AAV（ssAAV）進(jìn)入細(xì)胞后，在啟動蛋白表達(dá)之前，重要的限速步驟是單鏈基因組需要轉(zhuǎn)換成為雙鏈基因組。McCarty等缺失了rAAV的一個ITR區(qū)的TRS（trs），阻止其突變末端參與復(fù)制的啟動，最終形成一個呈現(xiàn)串聯(lián)的、單鏈的反向重復(fù)的基因組，其兩端是野生型的ITR，但中間一個是突變型的ITR。脫出衣殼后，將以中間突變的ITR為基礎(chǔ)折疊形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)，形成自我互補的雙鏈，因此，在組織或體外實驗中可以快速和高效表達(dá)。這種類型的scAAV的包裝能力僅為ssAAV的一半，大約。最近的進(jìn)展是利用scAAV表達(dá)小干擾RNA ( siRNA，small-interfere

20、nce RNA)。第一部分第一部分 蛋白表達(dá)型腺相關(guān)病毒載體蛋白表達(dá)型腺相關(guān)病毒載體第24頁/共46頁第二十五頁，編輯于星期日：十八點 二十六分。l自我互補型AAV 載體（self-complementary AAV vector， scAAV） 由于ssAAV和scAAV 載體的包裝容量均有限，限制了在基因治療領(lǐng)域的應(yīng)用。第一部分第一部分 蛋白表達(dá)型腺相關(guān)病毒載體蛋白表達(dá)型腺相關(guān)病毒載體第25頁/共46頁第二十六頁，編輯于星期日：十八點 二十六分。l反式剪接型AAV 載體（trans-splicing AAV vector, tsAAV） 單鏈線性AAV DNA 的自由末端以頭-尾相接的形式

21、經(jīng)分子間內(nèi)重組形成的串聯(lián)的二聚體（concatemers），介導(dǎo)AAV在特定組織(如肌肉)中的非整合性長效表達(dá)。利用此原理，將一個較大的外源基因拆分成兩個部分，分別包括剪接供體位點SD（splice donor sites）和剪接受體位點SA（splice acceptor sites），建立兩個不同的rAAV載體或不同亞型的ITR雜交載體，即反式剪接型AAV 載體；共感染靶細(xì)胞后，可以指導(dǎo)兩個外源基因片段形成首尾拼接的異二聚體、經(jīng)正確剪接后形成完整的基因而獲得表達(dá)。該型載體可克服包裝容量的限制，可達(dá)9kb，并成功在肺臟、肌肉和視網(wǎng)膜等表達(dá)。第一部分第一部分 蛋白表達(dá)型腺相關(guān)病毒載體蛋白表達(dá)型

22、腺相關(guān)病毒載體第26頁/共46頁第二十七頁，編輯于星期日：十八點 二十六分。l自我互補型AAV 載體（self-complementary AAV vector， scAAV） 總體而言，反式剪接型AAV 載體較ssAAV低效。 第一部分第一部分 蛋白表達(dá)型腺相關(guān)病毒載體蛋白表達(dá)型腺相關(guān)病毒載體第27頁/共46頁第二十八頁，編輯于星期日：十八點 二十六分。l衣殼蛋白修飾型AAV載體 交叉包裝型AAV載體（cross-packaging AAV vector）：利用同一AAV載體的基因組包裝入不同血清型的衣殼，便于直接比較不同的血清型以及在體內(nèi)的組織極性的差異，為了利用不同衣殼的組織極性而有目的

23、改造。鑲嵌型載體（mosaic vectors）：將不同血清型的衣殼按照不同比例混合。嵌合型病毒體（chimeric virions）：將不同血清型的VP蛋白重新聯(lián)合形成。第一部分第一部分 蛋白表達(dá)型腺相關(guān)病毒載體蛋白表達(dá)型腺相關(guān)病毒載體第28頁/共46頁第二十九頁，編輯于星期日：十八點 二十六分。l衣殼蛋白修飾型AAV載體 免疫逃避載體：分子進(jìn)化方法如DNA洗牌（DNA shuffling）和易錯PCR（error-prone PCR）等技術(shù)構(gòu)成的突變衣殼蛋白庫，然后直接進(jìn)行定向篩選抵抗中和抗體、或具有特定受體親和性、或細(xì)胞嗜性的rAAV，或者經(jīng)位點導(dǎo)向的突變（site-directed m

24、utagenesis）、特異肽端插入（peptide insertion）和化學(xué)接合（chemical conjugation）等方法細(xì)胞靶向特異性AAV載體(target specific AAV vector)：利用不同細(xì)胞表面的特定受體，對AAV衣殼蛋白進(jìn)行插入突變或缺失，導(dǎo)致配體改變組織特異性AAV載體（tissue-specific AAV vector：利用特定組織細(xì)胞表達(dá)的啟動子，以實現(xiàn)靶向特定組織如肌肉、肺臟和腫瘤等第一部分第一部分 蛋白表達(dá)型腺相關(guān)病毒載體蛋白表達(dá)型腺相關(guān)病毒載體第29頁/共46頁第三十頁，編輯于星期日：十八點 二十六分。第二部分第二部分 基因打靶型腺相關(guān)病毒

25、載體基因打靶型腺相關(guān)病毒載體 野生型AAV-2在Rep的作用下，定點整合于人19號染色體的AAVSl位點。重組AAV不含rep基因，定點整合的可能性極度下降。可以通過高M(jìn)OI感染以及對細(xì)胞敏感的血清型的衣殼包裝，可能增加AAV的單鏈DNA入核并與細(xì)胞染色體發(fā)生重組的幾率。基因打靶型AAV載體依賴于DNA的雙鏈斷裂(double strand break，DSB)，AAV可通過同源重組修復(fù)DNA雙鏈可介導(dǎo)包括插入、缺失、點突變等多種遺傳修飾的細(xì)胞內(nèi)的基因打靶。因此，基因打靶型AAV載體重點在于設(shè)計，載體序列與染色體靶基因序列的同源臂的匹配長度，將載體上待突變的基因放在中央。35%的感染細(xì)胞可以發(fā)

26、生整合，顯著高于轉(zhuǎn)染或電穿孔方式獲得的基因打靶頻率，且在打靶中AAV介導(dǎo)的基因表達(dá)可以長期持續(xù)、并具有高度的保真性。 第30頁/共46頁第三十一頁，編輯于星期日：十八點 二十六分。 rAAV載體應(yīng)用于基因校正、基因阻斷治療疾病或生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因家畜、用于農(nóng)業(yè)和研究的大型動物等具有無可比擬的優(yōu)勢，如：介導(dǎo)的基因打靶的效率高達(dá)1、高于質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)染或電轉(zhuǎn)化，宿主范圍廣泛，可利用的多種亞型等。主要缺陷是大約10仍是隨機整合、具有潛在的致死或致癌效應(yīng)。研究顯示可采用成體干細(xì)胞并在體外篩選特異打靶克隆用于疾病治療。 第二部分第二部分 基因打靶型腺相關(guān)病毒載體基因打靶型腺相關(guān)病毒載體 第31頁/共46頁第三十二頁

27、，編輯于星期日：十八點 二十六分。策略策略3細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞內(nèi)整合表達(dá)整合表達(dá)第32頁/共46頁第三十三頁，編輯于星期日：十八點 二十六分。 純化（純化（三種方法）l離子交換色譜法（IEX chromatography）：原理是依據(jù)在某一PH條件下，不同血清型的AAV的衣殼蛋白的電荷不同，因而，可以利用這一技術(shù)將不同的血清型的AAV分離純化.l優(yōu)勢:具有快速、規(guī)?；?、可重復(fù)性以及適用于不同血清型病毒純化的。l缺點: 在于需要摸索鹽和PH濃度，以利于AAV病毒顆粒結(jié)合于IEX離子柱，而且這些條件依據(jù)不同的血清型而有所變化；另外常需要多步驟才能獲得高純度的rAAV。第三部分第三部分 純化和定量純化和定量

28、第33頁/共46頁第三十四頁，編輯于星期日：十八點 二十六分。 純化（純化（三種方法）l受體特異性的親和純化（Receptor-specific affinity purification）：Heparan sulfate proteoglycan (HSPG)是AAV-2感染細(xì)胞的受體，因此肝素親和色譜分析法（Heparin affinity chromatography ）利用AAV-2和細(xì)胞特定受體結(jié)合這一特點，進(jìn)行AAV-2 的純化，可獲得高滴度和高純度的純化產(chǎn)物并可以用于臨床試驗，這也是rAAV-2在臨床試驗中作為使用最廣的原因之一。依據(jù)同樣原理，mucin被作為親和配體以純化AAV

29、-5。l缺點是不同的血清型的受體不同，因此，適用范圍較窄。第三部分第三部分 純化和定量純化和定量第34頁/共46頁第三十五頁，編輯于星期日：十八點 二十六分。 純化（純化（三種方法）lAVB葡聚糖凝膠親和色譜法：以AAV衣殼中高度保守的表位為基礎(chǔ)，制備的單鏈抗體（14 kDa）并在酵母中表達(dá)純化后鉸鏈到葡聚糖凝膠 ，以純化AAV的多個血清型（如AAV-1，2， 3，5和 8）。 第三部分第三部分 純化和定量純化和定量第35頁/共46頁第三十六頁，編輯于星期日：十八點 二十六分。定量定量采用含Rep/cap基因的細(xì)胞并接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，用AdV輔助病毒感染后，系列稀釋的rAAV接種并用TC

30、ID50計算終點滴度，同時聯(lián)合作為標(biāo)準(zhǔn)檢查病毒基因滴度的qRT-PCR 技術(shù)?；虿捎胷HSV表達(dá)Rep/cap基因作為輔助病毒的方法，可選用更多的細(xì)胞類型用于定量。第三部分第三部分 純化和定量純化和定量第36頁/共46頁第三十七頁，編輯于星期日：十八點 二十六分。具有復(fù)制能力的rcAAV (replication-competent AAV)需要對終產(chǎn)物檢測是否具有復(fù)制能力的rcAAV (replication-competent AAV)，這通常是由于載體與細(xì)胞系或輔助質(zhì)粒中存在互補序列造成，可影響病毒載體的表達(dá)。常將rAAV制備物稀釋后感染293細(xì)胞（或其它缺乏AAV基因的合適細(xì)胞），并在

31、輔助病毒存在情況下作用48 或72 h，僅其中的rcAAV才能復(fù)制，收集細(xì)胞，凍融后的產(chǎn)物重復(fù)感染293細(xì)胞2次以上，用針對AAV的 ITR區(qū)和 rep 基因的引物進(jìn)行qRT-PCR 檢測。第三部分第三部分 純化和定量純化和定量第37頁/共46頁第三十八頁，編輯于星期日：十八點 二十六分。l生物醫(yī)學(xué)的各種基礎(chǔ)研究生物醫(yī)學(xué)的各種基礎(chǔ)研究l基因治療基因治療病毒學(xué)和分子生物學(xué)體內(nèi)基因轉(zhuǎn)移和表達(dá)研究rAAV載體的構(gòu)建、生產(chǎn)和功能評價，臨床前研究，人體臨床試驗，離體細(xì)胞水平的臨床前和臨床研究腫瘤治療rAAV載體的生物分布和應(yīng)用途徑與細(xì)胞和基因治療等的相關(guān)研究 第38頁/共46頁第三十九頁，編輯于星期日：

32、十八點 二十六分。rAAV 載體的DNA在細(xì)胞內(nèi)常存在于染色體外，而且在體內(nèi)持續(xù)存在的時間較長，可以持久表達(dá)外源基因 第39頁/共46頁第四十頁，編輯于星期日：十八點 二十六分?；蛑委熁蛑委焼位蜻z傳病腫瘤神經(jīng)系統(tǒng)疾病視網(wǎng)膜疾病心血管疾病（心衰） 關(guān)節(jié)炎慢性紊亂傳染性疾病 第40頁/共46頁第四十一頁，編輯于星期日：十八點 二十六分。第41頁/共46頁第四十二頁，編輯于星期日：十八點 二十六分。 lwhat does Glybera do and how does it work? Its been approved for patients with the rare (one in 1,000,000 people) autosomal recessive lipoprotein